《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Hypoxia inducible factor network reflects kidney disease progression in diabetes and sodium-glucose co-transporters inhibition
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为探究缺氧如何驱动糖尿病肾病进展以及SGLT2i的肾脏保护机制，研究人员通过单细胞转录组、多组学分析和缺氧肾类器官模型，构建并验证了一个包含237个基因的HIF调控网络。该网络可反映疾病进展阶段，并在接受SGLT2i治疗的个体肾组织中观察到该网络变化的逆转，为量化疾病进展和治疗反应提供了多组分读数。
糖尿病肾病是全球肾衰竭的主要原因，高发病率与死亡率使其成为重大的公共卫生负担。长期以来，肾脏慢性缺氧被认为是驱动糖尿病肾病进展的关键因素，其核心调控者——缺氧诱导因子（HIF）信号通路——在其中扮演了复杂而关键的角色。然而，要将这一理论从假说转化为临床可用的工具，面临着巨大挑战。肾脏拥有极其复杂的细胞异质性和解剖结构，不同肾单位节段的氧需求和供应差异巨大，这使得在体直接评估药物（如被认为可改善肾脏氧合的SGLT2抑制剂）对肾脏氧合及缺氧响应通路的影响变得异常困难。此外，虽然动物模型研究提示HIF-缺氧响应轴的改变参与糖尿病肾病进程，但确认该机制在人类肾脏疾病中的相关性仍然证据有限。既往关于HIF信号的知识多来源于恶性肿瘤组织，而针对人类肾脏组织的研究，尤其是能够区分不同细胞类型的研究，更是凤毛麟角。正是为了破解这些难题，一项开创性的研究得以开展，旨在揭示人类糖尿病肾病中HIF调控网络的真实面貌，并评估SGLT2抑制剂对这一关键通路的影响。该研究成果已发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊。
为开展此项研究，作者团队整合运用了多项前沿技术。他们首先对已发表的缺氧或HIF活性改变相关基因进行文献梳理，构建了HIF响应基因集。利用患有2型糖尿病但临床肾病证据极少的青少年肾活检组织的单细胞RNA测序数据，以及肾脏精准医学项目（KPMP）中晚期糖尿病肾病患者的单细胞数据，分析了HIF响应基因的细胞类型富集模式。通过保守转录因子结合基序的分析，研究者识别了可能与HIF协同作用的高阶启动子调控结构——多重有序调控元件。基于此，他们通过信号通路富集分析，构建了一个包含237个基因的HIF调控网络。该网络的染色质可及性在KPMP参考组织的多组学数据中得到了验证。研究者进一步利用来自不同队列的批量RNA测序数据、单细胞多组学数据以及空间转录组学数据，评估了该网络在疾病早期（适应性近端肾小管细胞）、进展期（早、晚期糖尿病肾病）的表达变化。为实验验证，研究使用了缺氧人肾类器官模型，并分析了已发表的HIF1A/HIF2A基因敲低的HK2细胞系数据。最后，通过对比接受与未接受SGLT2抑制剂治疗的2型糖尿病患者肾组织单细胞数据，以及缺氧肾类器官经SGLT2抑制剂处理后的数据，评估了该药物对HIF调控网络的影响。
HIF响应基因在肾组织中呈现细胞类型特异性富集
研究人员通过文献回顾筛选出1666个与缺氧或HIF活性改变相关的独特转录本，其中272个在多个数据源中重复出现。在青少年2型糖尿病患者的肾单细胞转录组数据中，有181个基因在至少一种肾细胞类型中表达量超过10%。这些基因的功能富集分析恰当地反映了已知的HIF调控生物学通路，如糖酵解、血管生成和细胞凋亡。分析发现，HIF响应基因的表达在肾脏不同细胞类型中呈现出富集模式，例如，某些基因在髓袢降支细段或巨噬细胞中表达最高。重要的是，在青少年2型糖尿病未治疗组和KPMP晚期糖尿病肾病组中，85%的基因其最大表达细胞类型在两个队列中是一致的，这表明HIF响应的细胞类型模式在不同疾病阶段的个体间具有保守性。
HIF在肾脏内与特定的转录因子家族在明确的层级启动子结构中协同作用
基因的表达通常需要多个转录因子的组合互动。通过分析HIF响应基因的启动子区域，研究者识别了潜在的与HIF相关的高阶启动子调控结构，即多重有序调控元件（MORE cassettes）。这些结构反映了转录因子结合基序在距离、方向和间隔上的特定保守模式。分析发现，Krüppel样因子和E26转化特异性因子这两个转录因子家族在HIF响应基因相关的MORE元件中过度呈现，被确定为潜在的HIF协同作用转录因子家族。与人类基因组中所有启动子相比，这些MORE元件在HIF调控转录本的启动子区域中富集了2到30倍。其中，来自髓袢降支细段的一个特定MORE元件富集了30倍，而巨噬细胞和主细胞中识别出的MORE元件数量最多。
HIF调控网络的构建
通过全基因组范围的MORE元件搜索和信号通路富集分析，研究者将冗余基因列表精简并聚焦于与HIF因子、肾脏疾病和/或缺氧相关的顶级通路。最终，七个通路被确定，共同构成了HIF调控网络的基础。这七个通路包括：1）HIF1A转录因子网络（粉色），2）缺氧与氧稳态对HIF1A的调控（黑色），3）血管内皮生长因子（VEGF）缺氧与血管生成（蓝色），4）HIF2A转录因子网络（绿色），5）转化生长因子-β（TGF-β）受体复合物信号传导（棕色），6）血小板衍生生长因子（PDGF）信号传导（黄色），以及7）HIF激活介导的缺氧反应通路（橙色）。这七个通路网络以HIF1A为核心通路进行调控，共包含237个非冗余基因，其中许多基因出现在不止一个通路中。由此，一个基于已发表通路图谱的缺氧相关网络得以构建。虽然MORE元件是基于在特定肾细胞类型中富集的基因识别出来的，但其底层启动子结构存在于每个细胞的基因组中。利用KPMP参考肾组织的多组学数据，研究者证实该网络中80%（189/237）的基因至少有一个启动子位于开放的染色质区域，支持了肾脏环境本质上对缺氧条件具有响应能力。
HIF调控网络的基因表达在适应性近端肾小管细胞和进展性糖尿病肾病中发生紊乱
研究者首先关注了与不良长期结局相关的适应性近端肾小管细胞。在KPMP参考组织的多组学数据中，比较健康近端肾小管细胞和适应性近端肾小管细胞，仅有少部分开放染色质区域的可及性存在差异。然而，这些可及性发生改变的染色质区域常常与调控网络内的基因相关，约41.0%的网络基因注释至少有一个差异可及区域。此外，近半数HIF调控网络基因在适应性近端肾小管细胞与健康近端肾小管细胞之间的表达水平不同，其中约一半同时伴有启动子可及性的改变，从而形成了一组在早期疾病状态中发生改变的高置信度HIF调控网络转录本。例如，TGFBR2基因在适应性近端肾小管细胞中表现出更高的表达和可及性。接着，研究者通过分析两个早期和晚期糖尿病肾病队列的肾脏皮质RNA测序数据，检验了网络基因在病变肾组织中的情况。研究发现，与参照组相比，早期糖尿病肾病中有49个基因差异表达，而晚期糖尿病肾病中这一数字增加到163个。类似的结果在欧洲肾脏cDNA银行队列的糖尿病肾病与活体肾捐献者的组织转录组数据比较中也得到了验证。
空间转录组学证实高置信度基因在受损的近端肾小管细胞中表达失调
在来自四名未接受SGLT2抑制剂治疗的2型糖尿病患者的VisiumHD空间转录组学数据中，研究者识别了近端肾小管区域以及具有适应性和退行性近端肾小管特征的区域。后者比标注为健康近端肾小管的区域表现出更高的细胞损伤信号。作为进一步验证，研究者从HIF网络中选择了五个在多组学测量和两个批量糖尿病肾病数据集中均显示健康与疾病状态间表达变化一致的基因。在这五个基因中，有三个（AKT3、CREB1和 TGFBR2）表达上调，两个（VEGFA和 HNF4A）表达下降。在空间转录组数据中，其中四个高置信度基因在健康与受损近端肾小管区域之间的表达模式与其他转录组数据中观察到的模式相匹配。在组织切片上，被标注为适应性/退行性近端肾小管的区域靠近免疫细胞浸润区，并显示出更高的 TGFBR2表达。
HIF调控网络基因的表达在缺氧类器官中发生改变，并在细胞培养中功能依赖于HIF1A和HIF2A
为确定缺氧的实验性影响，研究者利用了人 pluripotent stem cell 来源的肾类器官在1% O2条件下培养24小时后的单细胞转录组数据。对类器官近端肾小管细胞转录组的分析显示，在该细胞类型表达的159个网络基因中，有60个在缺氧条件下差异表达，表达上调与下调的数量大致相当，这从实验上证实了HIF网络基因的表达改变与氧可用性降低相关。此外，利用已发表的缺氧HK2细胞中敲低 HIF1A和 HIF2A的细胞培养数据，研究者验证了HIF网络基因的表达在功能上依赖于 HIF1A和 HIF2A。在缺氧条件下表达变化大于0.4 log2倍数的18个基因，在其各自的HIF敲低条件下，缺氧反应普遍减弱。
SGLT2抑制剂治疗改变了HIF调控网络基因的表达
SGLT2抑制剂被认为可通过降低近端肾小管的能量需求来减轻2型糖尿病中的缺氧应激。相应地，研究者假设SGLT2抑制剂治疗会减弱与进展性2型糖尿病相关的HIF调控网络基因表达变化。比较接受与未接受SGLT2抑制剂治疗的2型糖尿病患者及健康对照者近端肾小管细胞的基因表达，发现83个网络基因在未治疗糖尿病患者与健康对照之间存在差异表达。其中，有35个基因在SGLT2抑制剂治疗后表达更接近基线状态，另有28个基因在治疗后表达进一步远离健康对照水平。在缺氧肾类器官的近端肾小管细胞中，SGLT2抑制逆转了网络中关键节点的表达，包括 HIF1A、脯氨酰羟化酶（EGLN1和 EGLN3）、调控TGF-β的 SMAD7以及 RORA。这些数据共同表明，SGLT2抑制剂调节了近端肾小管细胞中HIF1A、HIF网络及缺氧相关基因的表达。
研究结论与讨论
本研究构建并验证了一个广泛存在于开放染色质中、在早晚期糖尿病肾病中均有相关性、且在缺氧肾类器官中表达发生改变的HIF调控网络。该网络基因的表达模式在临床糖尿病肾病证据极少的2型糖尿病患者中即可被检测到紊乱，而在糖尿病肾病晚期阶段，网络关键节点的表达扰动进一步加剧，提示该网络转录本的调控参与疾病的发生与进展。空间转录组学数据为这一发现提供了独立验证。实验证实，该网络在缺氧条件下被激活，且其功能依赖于 HIF1A和 HIF2A。尤为重要的是，SGLT2抑制剂治疗与糖尿病患者肾组织中该网络表达扰动的减弱相关，并在缺氧类器官模型中得到验证，这为SGLT2i通过影响缺氧-HIF轴发挥肾脏保护作用的假说提供了直接证据。
然而，这些结果并不能最终证明缺氧是驱动糖尿病肾病进展的HIF相关始动因素。除了缺氧，糖尿病肾病中HIF活性的改变可能还存在其他诱因，例如三羧酸循环代谢物和mTORC活性对HIF的翻译后调控。糖尿病中TCA循环通量增加，而SGLT2i可抑制其转录本，因此HIF调控网络的紊乱可能并非主要由缺氧引起，而是糖尿病和糖尿病肾病代谢改变的次级后果。
该研究的优势在于利用多个人类队列的RNA和表观遗传测序技术对网络进行了多次验证，并在类器官中进行了实验验证。局限性包括：未能明确界定导致人类糖尿病肾病中HIF调控网络表达改变的确切机制；类器官模型在模拟糖尿病肾病慢性复杂缺氧生理方面存在局限；多组学数据来源于参照样本而非糖尿病患者样本。
综上所述，这项研究提出的HIF调控网络提供了一个强大的多组分读数，能够反映疾病阶段，适用于研究和监测SGLT2抑制剂或脯氨酰羟化酶抑制剂等治疗对人类肾组织的影响。该网络在结构损伤发生前即出现紊乱，并持续存在于整个糖尿病肾病进展过程中，这强调了跨疾病谱系检查组织的必要性。同时，HIF响应在肾组织中的细胞类型富集模式的发现，凸显了利用单细胞分辨率分子技术的价值。尽管需要进一步工作来确定糖尿病肾病中HIF网络活性改变的初始原因，但本研究为未来针对缺氧-HIF轴的治疗策略开发和评估提供了重要的平台和工具。
