《Antioxidants》：A Standardized Onion Peel-Derived Bioactive Ingredient Attenuates Palmitate-Induced Steatosis and Oxidative Stress by Modulating Mitochondrial Dynamics and Autophagy in HepG2 Cells
Ilaria Di Gregorio,
Vincenzo Migliaccio,
Maria D’Elia,
Rita Celano,
Valentina Santoro,
Anna Lisa Piccinelli,
Mariateresa Russo,
Luca Rastrelli and
Lillà Lionetti
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本研究针对代谢功能障碍相关脂肪性肝病(MASLD)中氧化应激与脂质蓄积的病理关联，开发了源自意大利Tropea红洋葱皮的标准化生物活性成分(OPI-T)。通过HepG2细胞棕榈酸(PA)诱导的脂肪变性模型，研究人员发现OPI-T可显著减轻脂质蓄积(?18%)、降低ROS生成(?75%)，并调控MFN2/DRP1比率与自噬流。该研究为洋葱皮副产物的高值化利用及MASLD的膳食干预策略提供了功能验证依据。
在现代社会，不健康的饮食模式，特别是高脂饮食，正悄然加剧着一种普遍却危险的肝脏健康问题——代谢功能障碍相关脂肪性肝病(MASLD)。这种疾病始于简单的肝细胞脂肪堆积（即脂肪变性），并可能逐步升级为伴随炎症和纤维化的更严重状态。目前，针对MASLD的有效药物疗法仍很有限，这使得通过膳食策略和功能性食品成分进行早期干预变得尤为重要。在此背景下，源自天然植物的多酚类生物活性物质，因其在调节氧化应激、炎症和代谢紊乱等方面的潜力，受到了研究者的广泛关注。然而，如何将农业加工副产物“变废为宝”，并确保其生物活性的稳定与可靠，是转化应用中的关键挑战。洋葱皮，作为洋葱加工产生的大量废弃物，富含槲皮素、花青素等酚类物质，是开发生物活性成分的理想原料。为此，一项发表于《Antioxidants》期刊的研究，深入探索了一种标准化洋葱皮成分在对抗肝脏脂肪变性和氧化应激中的作用与机制。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，采用超声波辅助提取和冷冻干燥技术，从两种具有地理标志保护(PGI)的意大利洋葱品种（Rossa di Tropea 和 Ramata di Montoro）的干外皮中制备提取物，并对Tropea提取物(OPI-T)进行了以总黄酮醇和花青素为标志物的化学标准化。其次，使用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术(UHPLC-HRMS/MS)分析了提取物的酚类成分谱。核心生物学研究则在人肝癌细胞系HepG2细胞中进行，通过棕榈酸(PA)与牛血清白蛋白(BSA)络合诱导建立脂肪变性和氧化应激模型。随后，利用MTT法和划痕实验评估细胞活性和迁移；通过油红O染色和BODIPY荧光探针染色定量与可视化细胞内脂质积累；采用DCFH-DA荧光法检测细胞内活性氧(ROS)水平；并运用蛋白质印迹法(Western Blot)分析线粒体动力学关键蛋白（MFN2, DRP1）和自噬相关蛋白（SQSTM1/p62, LC3 II/I）的表达变化。
3. 结果
3.1. UHPLC–UV–HRMS/MS分析显示OPI-T具有稳定可重复的酚类成分谱
分析证实，Tropea洋葱皮成分(OPI-T)与Montoro提取物具有高度相似的酚类指纹图谱，主要差异在于成分的相对丰度。OPI-T中槲皮素及其衍生物的信号强度更高、分布更均一，花青素（如矢车菊素-3-葡萄糖苷）也主要存在于红色品种的Tropea提取物中。这为OPI-T作为化学标准化生物活性成分的后续研究奠定了基础。
3.2. OPI-T在功能相关浓度下对HepG2细胞活力无显著影响
MTT实验表明，在24小时处理期内，浓度高达50 μg/mL的OPI-T对HepG2细胞未显示出明显的细胞毒性。相比之下，非标准化的Montoro提取物在相同浓度下导致了更显著的细胞活力下降。划痕实验进一步证实，OPI-T仅适度调节细胞迁移，未表现出过强的抗增殖效应，表明其在研究浓度下具有良好的生物相容性。
3.3. OPI-T减轻棕榈酸诱导的HepG2细胞脂质积累
油红O定量染色显示，棕榈酸(PA)处理显著增加了HepG2细胞内的脂质含量。而OPI-T与PA共处理，在24小时和48小时均能显著减轻这种脂质蓄积，在24小时、50 μg/mL浓度下减少约18%。BODIPY荧光染色直观地证实了OPI-T处理能减少细胞内脂滴的数量和荧光强度。非标准化的Montoro提取物也显示出一定的抗脂肪变性效果，但效果不如OPI-T一致和显著。
3.4. OPI-T显著降低棕榈酸诱导的氧化应激
DCF检测发现，PA处理使细胞内ROS水平显著升高。OPI-T单独处理即可剂量依赖性地降低基础ROS水平。更重要的是，在PA诱导的氧化应激条件下，OPI-T（50 μg/mL）能够将ROS产生大幅降低75%，其抗氧化效果显著优于非标准化的Montoro提取物。
3.5. OPI-T通过恢复融合-分裂平衡来调节线粒体动力学
蛋白质印迹分析显示，PA处理导致线粒体融合蛋白MFN2表达下降，并改变了动力相关蛋白1(DRP1)的水平，使得MFN2/DRP1比率降低，表明线粒体倾向于分裂状态。OPI-T单独处理即可降低DRP1水平。当与PA共处理时，OPI-T能显著逆转PA引起的改变，使MFN2/DRP1比率大幅提高至1.66，表明其能促使线粒体网络向融合表型转变，有助于改善线粒体功能。
3.6. OPI-T调节棕榈酸处理的HepG2细胞中的自噬相关标志物
研究还检测了自噬相关标志物。PA处理增加了自噬底物p62的积累和LC3-II/LC3-I的比率。OPI-T与PA共处理进一步升高了LC3-II/LC3-I比率，但未额外增加p62的积累。而非标准化的Montoro提取物与PA共处理则同时增加了p62和LC3-II/LC3-I的水平。这表明两种提取物都能调节自噬相关通路，但OPI-T可能诱导了更为协调的自噬反应。
4. 结论与讨论
本研究成功功能验证了一种源自Rossa di Tropea洋葱皮的标准化生物活性成分(OPI-T)。结论表明，OPI-T能够有效缓解棕榈酸在HepG2细胞中诱导的脂肪变性和氧化应激。其保护作用与多方面的细胞调节机制相关：首先是强大的抗氧化能力，直接清除过量ROS；其次是调控线粒体动力学，逆转PA诱导的过度分裂倾向，通过提高MFN2/DRP1比率促进线粒体融合，这有助于维持线粒体能量代谢稳态和质量控制；再者是调节自噬相关通路，可能促进了受损细胞器和脂滴的清除。
本研究的重大意义在于，它不仅展示了洋葱皮副产物在改善肝脏代谢健康方面的潜力，为农业废弃物高值化利用和循环经济提供了范例，更强调了成分标准化对于确保生物活性成分功能一致性和可重现性的关键作用。与未标准化的对照提取物相比，标准化的OPI-T展现出更优的生物相容性、更一致且更强的抗脂肪变性与抗氧化效果。这提示，基于明确化学标志物的标准化流程，是将天然提取物转化为可靠功能性食品或保健品原料的必要步骤。该研究为开发针对MASLD等代谢性肝病的天然来源干预策略提供了重要的临床前实验依据，将基础植物化学与细胞功能验证有机结合，推动了食物源生物活性成分向实际应用的转化。
当然，研究也存在一些局限性，如使用的是肿瘤来源的HepG2细胞系，且对自噬流的评估是静态的。未来需要在原代肝细胞、动物模型乃至临床研究中进一步验证，并深入探讨其作用的具体分子靶点和信号通路。尽管如此，这项工作无疑为利用标准化植物成分对抗日益流行的代谢性肝病开辟了一条富有前景的新途径。
