《Cells》：Exosomal microRNAs in Bronchial Aspirate and Other Liquid Biopsy Specimens for Lung Cancer: Current Evidence and Future Perspectives—A Narrative Review
Drago? Hu?anu,
Mara Andreea Vultur,
Corina Eugenia Budin,
Dumitru C?t?lin Sarbu,
Maria Beatrice Iano?i,
Edith Simona Iano?i,
Hédi Katalin Sárk?zi and
Gabriela Jimborean
编辑推荐：
这篇综述系统梳理了支气管抽吸物及肺泡灌洗液等气道近端液体中外泌体microRNA（EV-miRNA）作为肺癌新型诊断与预后生物标志物的前沿进展。文章在介绍液体活检（Liquid Biopsy）及细胞外囊泡（EVs）生物学背景的基础上，重点阐述了其相较于循环肿瘤DNA（ctDNA）在早期肺癌诊断中的独特优势。作者深入剖析了当前有限但充满希望的研究证据，讨论了从样品采集、外泌体分离到miRNA分析的方法学挑战与标准化（如MISEV2023指南），并展望了其在临床工作流程，特别是在资源有限但肺癌高发（如罗马尼亚）的医疗体系中整合应用的未来前景。最终，文章指出将气道EV-miRNA分析整合到常规支气管镜检查中，是迈向个性化胸部肿瘤学的潜在重要一步。
在对抗肺癌这场全球性战役中，早期发现是提高患者生存率的关键。然而，传统的组织活检具有侵入性，而低剂量计算机断层扫描（LDCT）筛查又面临假阳性率高、成本及随访能力有限等挑战。一种名为“液体活检”的微创技术应运而生，它通过分析血液、唾液等体液中的肿瘤衍生物质来提供诊断线索。其中，由细胞释放的细胞外囊泡，特别是外泌体，及其内部携带的微小RNA（miRNA），因其稳定性好、疾病特异性高，正成为液体活检领域一颗耀眼的新星。尤其值得关注的是，与肿瘤微环境直接接触的“气道近端”液体，如支气管肺泡灌洗液（BALF）和支气管抽吸物，其中肿瘤来源的外泌体miRNA浓度可能更高，为肺癌的早期诊断打开了一扇全新的窗户。
生物背景：细胞外囊泡、外泌体与miRNAs
液体活检涵盖了多种肿瘤来源的生物标志物，它们各自反映了癌症的不同生物学侧面。循环肿瘤DNA（ctDNA）揭示了肿瘤的基因组学和突变谱，而循环肿瘤细胞（CTCs）则提供了肿瘤扩散的细胞视角。相比之下，细胞外囊泡，尤其是外泌体，是肿瘤和基质细胞主动分泌的纳米级膜结合颗粒，内部装载着核酸、蛋白质和脂质等丰富的“货物”。其中的EV-miRNAs因其稳定性、丰度高且能动态反映肿瘤-宿主相互作用，已成为极具前景的生物标志物。在肺癌中，外泌体miRNAs可以作为致癌或抑癌分子发挥作用，其被脂质双分子层包裹的特性使其在体液中异常稳定，非常适合用于液体活检。为确保研究的可重复性，国际细胞外囊泡协会制定了MISEV指南，为EV的分离、定量和报告定义了最低标准。
液体活检在肺癌中的定位：EV-miRNAs的地位
在肺癌液体活检领域，尽管ctDNA和CTCs被广泛研究，但在早期肺癌中的灵敏度仍有待提高。相比之下，外泌体miRNAs是主动分泌的，可以捕捉不依赖于细胞更新的动态肿瘤过程。在所有基质中，BALF和支气管抽吸物因其与肿瘤组织的近距离接触而脱颖而出，这赋予了它们更高的特异性，但也因取样有创而可扩展性较低。
气道近端取样的方法学全景
获取BALF需要在支气管镜检查期间向目标支气管肺段灌注无菌生理盐水，然后回吸收液体。支气管抽吸物或灌洗样本的获取则相对简单。这些样本需要快速处理（理想情况是在两小时内），以保护囊泡的完整性。分离技术包括超速离心、聚合物沉淀和尺寸排阻色谱法，各有优劣。免疫捕获和微流控EV分离平台因其可扩展性和可重复性，正成为临床级的替代选择。RNA提取和定量依赖于qPCR、数字PCR或小RNA测序，但不同气道样本间的标准化仍是一大挑战。
证据总结：BALF和支气管抽吸物中的外泌体miRNAs
目前，专门评估气道近端外泌体miRNAs在肺癌中应用的研究屈指可数。现有证据虽然有限，但提供了强有力的概念验证数据。例如，早期研究发现早期肺腺癌患者BALF来源的外泌体中miR-126和let-7a水平显著升高，其诊断曲线下面积（AUC）可达0.83–0.86。近期研究则识别出BALF细胞外囊泡中的miR-1246b可作为区分良恶性肺结节的标志物，并将其表达与肿瘤促进行为相关联。来自支气管抽吸物和灌洗液的证据，尽管较少专门针对外泌体富集，也进一步支持了气道是生物标志物“宝库”的观点。这些研究表明，与血液相比，气道近端液体显示出更高的肿瘤特异性，且对外泌体的富集提高了miRNA检测的信噪比。然而，当前证据基础受限于样本量小、患者群体异质性大以及方法学差异显著等问题。
用于外泌体miRNA分析的生物流体比较概览
不同生物流体在外泌体miRNA分析中各有利弊。血浆和血清因易于获取和临床工作流程成熟而应用最广，但可能面临肿瘤信号被稀释的问题。相比之下，BALF和支气管抽吸物等气道近端样本由于与肿瘤微环境直接接触，提供了更高的肿瘤特异性，但代价是侵入性增加和标准化程度较低。其他如痰液和胸腔积液等基质可提供补充信息，但受限于样本质量的多变性或仅适用于特定疾病阶段。
气道外泌体miRNA诊断的概念工作流程——从支气管镜检查到分子诊断
将气道来源的外泌体miRNA分析转化为肺癌诊断工具，需要一个结构化、可重复的工作流程。该流程从标准化的样本采集开始，即通过支气管镜获取BALF或支气管抽吸物。随后是样本处理和前期处理，关键在于快速去除细胞、粘液和碎片，并尽量减少处理延迟，以保持EV的完整性。核心步骤是外泌体和细胞外囊泡的分离，超速离心是研究中的常用方法，但尺寸排阻色谱法、聚合物沉淀以及新兴的微流控平台在临床转化中更具吸引力。RNA提取和miRNA定量紧随其后，但气道样本的标准化是主要分析挑战，目前的最佳实践包括使用合成spike-in对照、全局平均归一化或经过验证的参考panel。最后一步，是将外泌体miRNA数据与现有诊断信息（影像学、细胞学、组织病理学等）整合。EV-miRNA特征可用于优化对性质不确定肺结节的评估，支持在支气管镜检查无明确诊断结果时的恶性可能性评估，或在特定临床背景下用于纵向监测。通过遵循MISEV2023等指南建立统一标准操作程序，并在多中心环境中进行验证，是推进临床实施的关键。
讨论
诊断意义
气道近端液体为观察肺肿瘤微环境提供了一个直接的分子窗口。其使用可显著提高细胞学检查的效能，尤其是在小型或外周病变中。由于支气管镜检查已是评估可疑病变的标准操作，增加EV-miRNA分析不会引入额外的操作风险。整合此类检测可将传统的描述性操作转化为定量的分子检测，架起细胞学与精准基因组学之间的桥梁。结合解读LDCT、细胞学和气道EV-miRNA panel，可显著减少假阳性和不必要的活检。从临床角度看，EV-miRNA特征可用于多个决策点，如在筛查中作为LDCT的辅助以减少假阳性率，在诊断中支持对不确定结节的恶性预测，并可能区分组织学亚型或反映EGFR等分子改变状态。
预后和预测潜力
特定的外泌体miRNAs与癌症进展密切相关。例如，miR-21通过PTEN/AKT信号通路驱动上皮-间质转化（EMT）和化疗耐药，miR-126调节血管生成，而miR-1246和let-7a则调节免疫逃逸和转移潜能。这些miRNA在BALF或支气管抽吸物中的存在，可反映肿瘤的侵袭性。对这些miRNA进行纵向分析，可能有助于追踪治疗反应或微小残留病。将气道来源的EV-miRNA与已建立的液体活检模式（如ctDNA、CTC）整合，有望提高诊断准确性并支持个性化肺癌管理。
方法学挑战
样本采集方案的异质性会显著影响EV产量，处理延迟则会导致囊泡降解和RNA断裂。在分析方面，不同的分离技术会产生不同的EV纯度。在miRNA定量过程中的标准化仍然存在问题，因为气道基质缺乏稳定的内参。合成spike-in和全局平均归一化是目前推荐的临时解决方案。
罗马尼亚的背景与机遇
罗马尼亚拥有欧洲最高的肺癌死亡率之一，主要是因为60-70%的病例在III/IV期才被诊断出来。鉴于支气管镜检查在呼吸科中心是常规操作，实施气道EV-miRNA分析可能具有成本效益，能够利用现有工作流程。因此，气道EV-miRNA分析不仅是一个科学机遇，也是在资源有限的环境下，弥合传统支气管镜检查与精准肿瘤学之间差距的实用策略。
未来研究重点
该领域未来的研究重点包括开展遵循MISEV2023标准的前瞻性多中心研究，建立标准化的气道样本采集和处理方案，开发和验证用于气道EV-miRNA的临床级检测方法，探索其预后和预测价值，评估成本效益，并探索多组学整合与人工智能分析。
当前证据的局限性
目前的证据基础仍然稀疏，主要以探索性小规模研究为主，且存在方法学异质性。缺乏外部验证，发表偏倚可能夸大了诊断准确性。在大型、多中心、遵循MISEV标准的研究出现之前，气道EV-miRNAs应被视为具有研究价值但生物学上引人注目的生物标志物。
结论
气道近端液体，如支气管抽吸物和BALF，作为外泌体miRNAs的来源，在肺癌早期诊断和潜在预后评估方面具有巨大前景。当前数据虽然有限，但证明了其可行性和强大的生物学理论基础。对于像罗马尼亚这样的国家，将EV-miRNA分析整合到支气管镜检查工作流程中，可以在现有基础设施内提高诊断精度。未来的多中心试验遵循MISEV2023标准，对于临床转化和国际验证至关重要。
