年龄对小鼠椎间盘组织形态与基因表达的影响：聚焦ADAM8失活模型的损伤响应研究

《Cells》：Effects of Age on Intervertebral Disc Tissue Morphology and Gene Expression in the ADAM8-Inactivation Mouse Lutian Yao, Huan Wang, Zuozhen Tian, Frances S. Shofer, Ling Qin and Yejia Zhang

本研究旨在确定在比较ADAM8突变对椎间盘（IVD）损伤响应的影响时，应使用哪个年龄段的小鼠。研究人员通过对比3、10和18个月大的ADAM8突变（Adam8EQ）与野生型（WT）小鼠在椎间盘损伤后的组织学和分子变化，发现基因表达是比组织学特征更敏感的指标，且3月龄小鼠最能揭示突变体与野生型小鼠在损伤响应中的差异，这为使用小鼠模型研究椎间盘退变提供了关键的年龄选择依据。

　　

背痛是一个全球性的健康问题，而椎间盘（IVD）退变是其常见原因。随着人口老龄化，阐明疾病进展机制并开发针对性疗法以减缓椎间盘退变、减轻疼痛变得至关重要。然而，在研究这些机制时，科学家们面临一个现实挑战：应该使用哪个年龄段的小鼠模型才最合适？毕竟，人类的背痛在中年最为普遍，但大多数动物实验却使用年轻的成年小鼠。这种年龄差异是否会影响我们对基因突变（例如影响细胞外基质降解的关键酶ADAM8）在椎间盘损伤响应中作用的观察？为了解答这个问题，由 Lutian Yao、Huan Wang、Zuozhen Tian、Frances S. Shofer、Ling Qin 和 Yejia Zhang 组成的研究团队在《Cells》期刊上发表了一项研究，系统探究了年龄对ADAM8失活（Adam8^EQ）小鼠和野生型（WT）小鼠椎间盘组织形态和基因表达的影响。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，他们建立了小鼠尾椎间盘（coccygeal intervertebral disc）的针刺损伤模型，对不同年龄段（3、10、18个月）的Adam8^EQ和WT小鼠进行手术操作，并以相邻节段作为自身对照。其次，在损伤后1周，他们采集了椎间盘组织，分别用于组织学分析和分子生物学研究。在组织学方面，对石蜡包埋的组织切片进行了苏木精-伊红（H&E）染色和番红O（Safranin O）染色，并使用标准的组织学评分系统（Melgoza等，2020）进行双盲评估，同时利用ImageJ软件对番红O染色区域的红色像素比例进行了量化，以反映蛋白多糖（proteoglycan）的含量。在分子水平，研究人员通过TRIzol法提取了椎间盘组织的总RNA，并利用定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术检测了包括Cxcl1、Il6、Adam8、Col2a1（II型胶原）和Col1a1（I型胶原）在内的多个基因的表达水平。所有统计分析均通过方差分析（ANOVA）和事后检验完成，以比较不同基因型、年龄和处理组之间的差异。

3.1. 完整椎间盘随年龄增长出现自发性退变样改变，而损伤椎间盘在WT和Adam8^EQ小鼠中均呈现中度变化

通过对H&E染色切片进行组织学评分，研究发现，无论是WT还是Adam8^EQ小鼠，其完整椎间盘的评分均随年龄增长而增加，表明存在自发的年龄相关性退变。然而，在相同年龄和损伤状态下，WT与Adam8^EQ小鼠之间的组织学评分并无显著差异。这表明，在组织形态层面，ADAM8的失活并未在H&E染色评估的退变程度上造成可观测的区别。

3.2. 番红O染色强度在Adam8^EQ和WT小鼠中均随年龄增长而降低

番红O染色用于评估蛋白多糖含量。结果显示，在所有小鼠中，损伤后1周的椎间盘组织红色染色均可见减少。更重要的是，在WT和Adam8^EQ小鼠中，10月龄小鼠完整和损伤椎间盘的番红O染色强度均低于3月龄小鼠。与组织学评分结果一致，相同年龄和状态下，两种基因型小鼠之间的染色强度没有差异。这提示番红O染色量化可能比组织学评分对年龄相关的变化更敏感。

3.3. Adam8^EQ和WT小鼠在3个年龄段胶原基因表达的差异

在基因表达层面，研究发现Col2a1（II型胶原）基因在3月龄和10月龄Adam8^EQ小鼠的完整和损伤椎间盘中，表达均显著高于WT小鼠。在18月龄时，这种差异仅在损伤椎间盘中显著存在。相反，Col1a1（I型胶原）基因的表达水平在两种基因型间无差异，但在所有小鼠中均随年龄增长而进行性下降。因此，Col2a1/Col1a1的表达比值在年轻Adam8^EQ小鼠中更高，这可能部分解释了先前观察到的该突变小鼠纤维环（AF）更厚的现象。

3.4. Adam8^EQ与WT年轻成年小鼠间炎症标志物基因表达的差异随年龄增长而减弱

这是本研究的核心发现之一。在3月龄年轻小鼠中，炎症相关基因Cxcl1、Il6和Adam8在Adam8^EQ小鼠的椎间盘（无论是完整还是损伤状态）中的表达均显著高于WT小鼠。然而，这些与损伤相关的基因表达差异随着年龄增长而显著减弱。在10月龄时，Il6在损伤椎间盘中的差异仍然存在，但Cxcl1和Adam8的差异已不显著。到了18月龄，所有这三个炎症标志物基因在两种基因型间的表达均无显著差异。这表明，与年龄相关的内环境变化“掩盖”了由ADAM8失活所引起的分子层面的细微差别。

本研究通过对3、10和18月龄ADAM8失活（Adam8^EQ）小鼠与野生型（WT）小鼠椎间盘的系统比较，得出了明确且具有重要指导意义的结论。首先，在组织形态学层面，尽管椎间盘会随年龄增长自然退变，且损伤会诱发退变特征，但ADAM8的失活并未导致可观测的组织学评分差异。其次，在更敏感的分子水平，研究清晰表明，与损伤反应和细胞外基质代谢相关的关键基因（如Cxcl1、Il6、Adam8和Col2a1）的表达差异在年轻的3月龄小鼠中最为显著。这些差异在10月龄时开始减弱，到18月龄老年小鼠中则基本消失。这强烈提示，衰老本身引起的生物学变化（可能包括基础炎症水平升高、修复能力下降等）可能主导了椎间盘对损伤的反应，从而稀释了特定基因突变（如ADAM8失活）所产生的影响。因此，如果研究的主要目的是揭示WT与Adam8^EQ小鼠椎间盘在损伤响应中的差异，那么使用3月龄的年轻成年小鼠要远优于使用10月龄或18月龄的老年小鼠。 这一结论不仅为ADAM8相关研究提供了关键的实验设计依据，也深刻地启示我们，在选择动物模型研究年龄相关疾病（如椎间盘退变）时，需要谨慎权衡模型年龄与人类疾病年龄的对应关系。单纯使用老年动物来模拟中年高发的人类疾病，可能会因为衰老相关的复杂背景噪音而掩盖特定的分子病理机制。该研究强调了在利用基因修饰动物模型探索疾病机制时，选择合适的动物年龄对于成功捕捉表型信号至关重要。