《International Journal of Molecular Sciences》：The Preliminary Study for the Trial of Using Selected miRNAs for the Laboratory Diagnosis of Colorectal Cancer
Michal Sulikowski,
Tadeusz Sulikowski,
Mateusz Kurzawski,
Damian Malinowski,
El?bieta Urasińska and
Monika Rac
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为了解决结直肠癌（CRC）早期、无创诊断的生物标志物匮乏问题，本研究探索了特定microRNAs（miRNAs）在CRC组织与健康组织中的表达差异。研究人员从120名50岁以上CRC患者手术中获取配对的组织和血浆样本，初步结果显示，在12种候选miRNAs中，有7种（如miR-181b-5p、miR-21-5p等）在癌与健康组织间表达存在显著差异，表明它们有望成为新型的CRC诊断生物标志物，为后续开发基于血浆miRNA的无创检测方法奠定了基础。
结直肠癌是欧洲第二大常见癌症，尽管诊断和治疗手段不断进步，但其预后依然严峻，尤其是一部分患者在疾病过程中会发生转移。因此，临床迫切需要能够早期、无创地发现结直肠癌的有效工具。传统的肿瘤标志物如癌胚抗原（CEA）和糖类抗原19-9（CA19-9）在敏感性和特异性上尚有不足。近年来，微小核糖核酸（microRNA， miRNA）作为一种高度稳定、存在于血液中的小分子RNA，在癌症诊断和预后预测中展现出巨大潜力。它们在细胞增殖、分化和凋亡等关键生物学过程中扮演着重要调控角色，其表达失调与多种癌症的发生发展密切相关。然而，哪些特定的miRNAs能作为结直肠癌可靠的血浆生物标志物，仍需通过严谨的临床研究进行验证和筛选。本研究正是为了回答这一问题而展开。
该研究由Michal Sulikowski、Tadeusz Sulikowski、Mateusz Kurzawski、Damian Malinowski、El?bieta Urasińska和Monika Rac团队完成，旨在通过一项为期多阶段的临床试验方案，验证特定miRNAs用于结直肠癌实验室诊断的可行性。研究论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》上。
研究采用的关键技术方法主要包括：研究计划分为四个阶段。第一阶段（本文报告重点）入组了120名50岁以上、未接受过术前治疗的结直肠癌患者（样本来源于波兰什切青波美拉尼亚医科大学）。术中同步采集患者的癌组织、远端健康结肠组织和术前血浆样本。通过TRIzol法提取组织总RNA，并使用TaqMan? Advanced miRNA试剂盒进行逆转录和定量PCR（qPCR），以检测选定的miRNAs表达水平。数据分析采用Wilcoxon符号秩检验比较癌与健康组织的表达差异，并计算相对表达量。
研究结果
初步发现与验证：研究成功从患者组织样本中检测到了可测量的miRNA水平，证实了取材和检测方法的可行性。对12种预先选定的miRNAs进行分析发现，其中7种在健康组织和癌组织之间的表达存在统计学显著差异。其中最具有潜力的包括miRNA-181b-5p、miRNA-21-5p、miRNA-221-3p、miRNA-222-3p和miRNA-93-5p。这些miRNAs在癌组织中的表达相较于健康组织有明显变化，提示它们可能作为潜在的生物标志物。例如，直观展示了包含此初步验证在内的完整四阶段研究设计。
差异表达分析：通过相对定量（RQ）分析，计算了每个miRNA在癌组织与健康组织中的表达比值。结果显示，部分miRNAs在癌组织中表达显著上调。这些数据为后续探究这些miRNAs在血浆中的存在情况及其与临床参数（如肿瘤分期、预后）的关联提供了核心依据。
候选miRNAs的选择依据：研究所选的miRNAs（如miRNA-21, miRNA-31, miRNA-181b等）均基于前期文献报道，它们或在结直肠癌组织中异常表达，或与患者较差的预后相关，并且其共同的靶基因之一是PTEN（一个重要的抑癌基因）。列出了在第一阶段计划检测的具体miRNA名单。
研究设计与样本处理流程：研究对样本的收集、保存和预处理流程进行了标准化。血浆样本在术前采集并快速离心分装，于-80°C超低温保存。组织样本则使用RNA稳定液（RNA-later）处理，以防止RNA降解。这种严谨的样本处理流程是确保后续miRNA检测结果可靠性的基础。详细描绘了第一阶段研究的详细步骤，从患者入组到样本分析。
研究结论与讨论
本研究初步证实了从结直肠癌手术标本中获取高质量RNA并进行特定miRNAs表达分析的可行性。在12个候选miRNAs中，有7个在癌组织和配对健康组织间显示出显著表达差异，其中miR-181b-5p、miR-21-5p、miR-221-3p、miR-222-3p和miR-93-5p的结果尤为突出，它们有望成为结直肠癌诊断的候选组织生物标志物。
讨论部分指出，基于多个miRNA的组合（miRNA panel）可能比单一生物标志物具有更高的诊断准确性。例如，已有荟萃分析（meta-analysis）表明，包含miR-15b、miR-21和miR-31的组合在诊断结直肠癌时显示出高达95%的敏感性和94%的特异性。本研究观察到的miR-21表达上调与多数文献报道一致，其可能通过调控细胞因子受体结合等通路促进肿瘤发展。此外，let-7家族、miR-128、miR-143等被提及为潜在的肿瘤抑制因子，而miRNA-200家族则常出现过表达，并与淋巴结转移和复发预测相关。
然而，目前该领域研究结果仍存在异质性，可能受化疗方案、肿瘤位置等因素影响。因此，本研究的意义在于提出并启动了一个系统性的四阶段验证计划：第一阶段（本文）完成组织差异表达鉴定；第二阶段将追踪患者疾病进展与治疗反应，分析生存率；第三阶段专注于开发诊断和预后检测方法；第四阶段则是在新的高危人群中前瞻性验证基于血浆的miRNA检测方法的有效性。最终目标是开发一种无创、高灵敏度和高特异性的结直肠癌诊断检测方法，并为其申请专利。
总之，这项初步研究为利用循环miRNA（circulating miRNA）实现结直肠癌的早期无创诊断迈出了重要的第一步。通过后续阶段的纵向验证和临床转化，这些特定的miRNAs有潜力弥补现有诊断手段的不足，改善结直肠癌的早期发现和患者管理策略。
