《International Journal of Molecular Sciences》：Bacillus subtilis and Trichoderma harzianum Reshape Rhizosphere Microbiome and Reprogram Root Transcriptome to Promote Mungbean Growth Under Continuous-Cropping Conditions
Xinyue Liu,
Yuting Chen,
Xintong Zhou,
Yating Xiao,
Xingxing Yuan,
Nana Su,
Chen Chen,
Qiang Yan and
Xin Chen
编辑推荐：
本文聚焦胶质母细胞瘤（GBM）治疗难题，探究缺氧信号与铁死亡相关基因特征的转录组关联。研究人员通过整合转录组与单细胞RNA测序分析，鉴定出缺氧相关基因HILPDA与铁死亡相关基因特征、免疫微环境变化显著关联。研究表明HILPDA可能通过缺氧介导的转录程序与铁死亡相关基因特征相关联，为GBM的代谢适应机制提供了新的见解。
在成人恶性脑肿瘤中，胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）以其侵袭性强、治疗抵抗和高复发率著称，堪称最凶险的“癌王”之一。尽管现有的标准治疗方案（包括最大范围手术切除、放疗和替莫唑胺化疗）不断改进，患者的预后依然极差，中位生存期仅约15个月。这种治疗困境背后，是肿瘤内部复杂而恶劣的微环境，其中“缺氧”是一个核心的驱动因素。肿瘤细胞在缺氧条件下会启动一系列生存和适应程序，变得更具侵袭性，并对化疗、放疗甚至新兴的免疫疗法产生抵抗。
近年来，一种被称为“铁死亡”（Ferroptosis）的细胞死亡方式为对抗癌症，尤其是那些难治的肿瘤细胞，带来了新的希望。铁死亡是一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡，它在形态学和生化特征上都不同于细胞凋亡。理论上，诱导铁死亡可以成为清除耐药肿瘤细胞的利器。然而，在GBM的缺氧环境中，事情变得复杂起来。缺氧不仅可能通过激活特定的信号通路（如PI3K/AKT/HIF-1α轴）上调SLC7A11等基因的表达来增强细胞对铁死亡的抵抗，还可能重塑肿瘤的代谢和免疫微环境。那么，缺氧信号与铁死亡相关的基因表达特征之间，究竟存在着怎样的转录组层面的关联？是否存在关键的枢纽基因，能够将缺氧、铁死亡以及免疫抑制这三者联系起来？解答这些问题，对于深入理解GBM的恶性生物学行为并开发新的治疗策略至关重要。
近期发表在《International Journal of Molecular Sciences》上的一项研究，正是为了回答这些问题而展开。研究人员通过整合大规模的转录组数据分析、单细胞RNA测序（scRNA-seq）以及先进的统计学模型，系统地探究了GBM中缺氧信号与铁死亡相关基因特征之间的关联。他们发现，一个名为HILPDA（缺氧诱导脂滴相关蛋白）的基因，可能是连接缺氧、铁死亡相关基因特征和免疫微环境重塑的关键候选分子。HILPDA的高表达不仅与缺氧评分、铁死亡相关基因特征评分（FerroScore）呈显著正相关，还与一系列铁代谢和活性氧（ROS）通路基因（如HMOX1、NOX4、STEAP3）的表达密切相关。更重要的是，单细胞水平的分析表明，HILPDA高表达的细胞亚群往往也位于缺氧的细胞龛中，并且结构方程模型（SEM）分析提示，HILPDA与铁死亡相关基因特征的关系很可能是通过缺氧相关的转录程序间接介导的，而非直接调控。此外，HILPDA的高表达还与特定的免疫微环境特征相关，表现为CD8+T细胞浸润、IFN-γ反应增强，但同时伴随着PD-L1（CD274）表达上调和T细胞耗竭评分升高，描绘出一种“炎症但功能失调”的免疫状态。这项研究并未直接证实HILPDA驱动铁死亡的分子机制，而是从转录组关联的角度，将HILPDA定位为GBM中缺氧-铁死亡相关转录状态的一个潜在生物标志物，为未来深入的功能性研究奠定了重要的基础。
为了开展这项研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：研究数据主要来源于癌症基因组图谱（TCGA）数据库中的胶质瘤（GBM和LGG）队列RNA测序数据，以及基因表达综合（GEO）数据库中的单细胞RNA测序数据集（GSE131928）。研究人员利用基因集变异分析（GSVA）方法，分别计算了每个样本的缺氧评分（基于Hallmark Hypoxia基因集）和铁死亡相关基因特征评分（FerroScore，基于从FerrDb数据库和文献中汇总的铁死亡相关基因集）。通过差异表达基因分析、基因集富集分析（GSEA）、相关性分析（Spearman）、生存分析（Kaplan-Meier和Cox回归）以及免疫特征分析（ssGSEA）等多种生物信息学手段，对数据进行了多层次挖掘。此外，他们还利用单细胞RNA测序数据在细胞分辨率下验证了关键发现，并应用结构方程模型（SEM）进行了中介效应分析，以探索变量间的潜在关系。
研究结果
缺氧相关铁死亡基因特征的鉴定与预后评估
研究人员首先通过比较缺氧条件下的差异表达基因与已知的铁死亡相关基因集，鉴定出29个核心候选基因，这些基因代表了缺氧与铁死亡相关基因特征的转录组重叠。热图分析显示，基于缺氧评分划分的高风险组样本中，大部分特征基因的表达呈现一致性升高。这表明缺氧信号与铁死亡相关基因表达的协调变化有关。进一步分析发现，这些候选基因在更具侵袭性的GBM样本中表达更高，且多个基因的高表达与患者总体生存期较差显著相关。单变量Cox回归分析定量证实了候选基因表达与生存风险之间的关联。
铁死亡活性在胶质瘤中的预后意义
研究人员计算了每个患者的铁死亡相关基因特征评分（FerroScore），并将样本分为高分组和低分组。生存分析显示，在TCGA-GBM队列中，FerroScore高分组的患者总体生存期显著更短，但在低级别胶质瘤（LGG）队列中，这种生存差异不显著。这表明铁死亡相关的基因表达模式可能与高级别胶质瘤的不良预后相关。多变量Cox分析表明，年龄、男性、IDH野生型状态和未甲基化的MGMT启动子状态是独立的预后因素，而HILPDA表达在多变量模型中并非独立预测因子。对FerroScore高分组差异基因的KEGG通路富集分析显示，这些基因显著富集于炎症和应激反应通路，如细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路，以及HIF-1信号通路。这支持了铁死亡相关基因特征与炎症和缺氧相关信号网络存在转录组关联。
HILPDA与铁死亡和缺氧特征相关
在确定了铁死亡相关基因特征与不良预后的关联后，研究人员进行了以基因为中心的分析。HILPDA因其与缺氧反应的直接关联以及在脂质代谢和应激适应过程中的作用，被选为突出的候选基因。FGSEA分析显示，根据HILPDA表达排序的基因列表中，铁死亡特征基因集显著富集。样本分析也证实，HILPDA表达与FerroScore呈显著正相关。功能富集分析显示，与HILPDA正相关的基因在炎症和免疫反应通路中显著富集，而与HILPDA负相关的基因则富集于神经元信号和突触组织等过程。这提示HILPDA的高表达可能与胶质瘤细胞向去分化、代谢重编程和炎症表型的转录组转变有关。
HILPDA与铁/ROS通路及缺氧相关铁死亡特征的关联
为了评估HILPDA与铁死亡特征的关系是否通过铁代谢和氧化应激轴发生，研究人员进行了更深入的分析。热图显示，在HILPDA高表达的样本中，与铁稳态、活性氧产生和缺氧反应相关的基因（如HMOX1、STEAP3、NOX4）同步上调。相关性分析定量证实了HILPDA与HMOX1、NOX4、STEAP3之间存在强正相关。功能评分显示，HILPDA高分组中，铁死亡和缺氧富集评分均显著增加。中介分析进一步表明，HILPDA表达与铁死亡相关基因特征之间的关联，可能是通过缺氧评分介导的。这支持了HILPDA通过缺氧相关转录程序与铁死亡相关基因表达模式相关联的模型。
HILPDA与免疫微环境的关联
免疫浸润特征分析评估了HILPDA与肿瘤微环境的关系。结果显示，在HILPDA高分组中，CD8+T细胞评分、细胞毒性活性、IFN-γ反应、NK细胞特征、巨噬细胞浸润和Treg评分均显著更高，表明HILPDA高水平与免疫细胞浸润增加相关。然而，相关性分析显示，HILPDA与免疫检查点基因PD-L1（CD274）表达呈正相关。更重要的是，T细胞耗竭评分在HILPDA高分组中也显著更高。这些发现共同描绘出一种HILPDA高表达所伴随的免疫微环境特征：即存在免疫细胞浸润和炎症反应，但同时也伴有免疫抑制和功能耗竭，呈现出一种“炎症但功能失调”的状态。
HILPDA-缺氧-铁死亡关系的单细胞转录组分析
单细胞RNA测序分析在细胞水平上验证了这一关联。UMAP投影显示，HILPDA表达集中在特定的肿瘤/干细胞样细胞簇中。缺氧评分与HILPDA高表达的细胞龛有显著重叠，而铁死亡评分在缺氧细胞亚群中也有增加趋势。细胞水平的相关性分析显示，HILPDA与缺氧评分呈显著正相关，但其与铁死亡评分的直接相关性很弱。结构方程模型（SEM）的中介分析显示，HILPDA对铁死亡评分的直接影响不显著，但其通过缺氧评分产生的间接效应是显著的，并且总效应几乎完全由这个间接路径解释。这进一步支持了在单细胞水平上，HILPDA表达与铁死亡相关基因特征之间的关联，可能是由缺氧相关的转录活性所链接，而非直接关联。
研究结论与讨论
本研究通过整合分析，揭示了胶质母细胞瘤中缺氧信号、铁死亡相关基因特征和免疫微环境重塑之间的转录组关联。核心发现是鉴定出HILPDA作为一个缺氧相关基因，在转录组层面与铁死亡相关基因表达程序和免疫相关特征存在稳定关联。
研究指出，本研究所用的铁死亡评分（FerroScore）反映的是铁死亡相关的转录特征，而非铁死亡细胞死亡的直接测量。因此，FerroScore高分组与GBM患者不良预后的关联，应被解读为与更具侵袭性的肿瘤表型相关的转录程序，而非纯粹的促死亡信号。缺氧是GBM微环境的核心特征，能通过HIF-1α驱动代谢重编程。本研究中，FerroScore高表型中HIF-1信号通路和炎症通路的富集，支持了铁死亡相关转录程序与缺氧、炎症微环境相关联的观点。
HILPDA因其受HIF-1α调节及在脂质代谢中的作用，成为连接缺氧与铁死亡相关代谢途径的潜在节点。数据表明，HILPDA表达不仅与铁死亡评分正相关，还与铁-ROS轴关键基因（HMOX1, NOX4, STEAP3）表达平行。值得注意的是，在多变量预后分析中，HILPDA并非独立于IDH状态、MGMT甲基化等经典标志物的预后因子，提示其更多是反映缺氧相关肿瘤生物学的生物标志物。
单细胞分析和中介模型强有力地支持了“HILPDA通过缺氧相关转录程序与铁死亡特征关联”的间接模型，而非直接调控关系。同时，HILPDA高表型所伴随的“炎症但功能失调”的免疫微环境（即免疫浸润增加但伴随PD-L1上调和T细胞耗竭），也与已知的缺氧驱动免疫抑制的机制相符。
研究者也坦率指出了本研究的局限性：结论主要基于转录组数据分析和统计建模，应视为揭示关联而非证实机制。铁死亡评分代表转录特征，而非铁死亡活性。未来需要通过HILPDA基因操作（如敲低/过表达）及缺氧条件下的功能实验来验证因果关系。因此，本研究本质上是提出假说，为后续探索GBM中缺氧-铁死亡关系的功能性研究提供了框架。
总之，这项工作构建了一个连接缺氧信号、铁死亡相关基因特征和免疫微环境重塑的整合性转录组框架，将HILPDA定位为该轴系中的一个关键关联基因。这为了解GBM在恶劣微环境中的适应和存活机制提供了新的视角，并为未来开发针对缺氧-代谢-免疫交叉对话的新型治疗策略奠定了重要的理论基础。
