《International Journal of Molecular Sciences》：The M1 Paradox: Pro-Tumorigenic Effect of Macrophage Cytotoxicity in Prostate Cancer
Olga V. Kovaleva,
Vasiliy V. Sinyov,
Madina A. Rashidova,
Olga S. Malashenko,
Polina A. Podlesnaya,
Pavel B. Kopnin,
Maria V. Vasileva,
Alexander S. Balkin,
Andrey Plotnikov and
Alexei Gratchev
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本研究探讨了经典活化的M1样巨噬细胞的持续细胞毒性，能否在前列腺癌中作为一种选择压力，促进肿瘤细胞产生具有更强恶性潜能的变异。研究人员通过重复共培养构建了巨噬细胞抵抗的PC3和DU145细胞株，发现其增殖、克隆形成及体内成瘤能力增强，但迁移能力未显著提升，并伴随部分上皮-间质转化（EMT）样改变、p38 MAPK信号通路激活及炎症适应性转录重编程。该研究揭示了巨噬细胞介导的细胞毒性可能间接驱动肿瘤进化，挑战了M1巨噬细胞必定抗肿瘤的传统观点，对靶向巨噬细胞的免疫治疗策略具有重要启示意义。
在肿瘤免疫治疗的宏大叙事中，巨噬细胞长久以来被置于一个看似清晰的道德光谱中：一方是“行善”的M1型，它们被经典激活，能释放炎症因子，直接杀伤肿瘤细胞，是抗肿瘤免疫的战士；另一方则是“作恶”的M2型，它们参与组织修复和免疫抑制，常常为肿瘤的生长和转移“保驾护航”。基于此，许多治疗策略都致力于将肿瘤微环境（TME）中富集的M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）“改造”或“重编程”为具有杀伤力的M1表型，以期扭转战局。然而，现实往往比理论更复杂。尽管在某些模型中M1极化策略显示出希望，但在广泛的实体瘤治疗中，其临床获益并不一致，有时甚至令人失望。这不禁让人深思：当我们试图用M1巨噬细胞的“火力”持续攻击肿瘤时，肿瘤本身会作何反应？是坐以待毙，还是绝地求生？
由 Olga V. Kovaleva 等学者在《International Journal of Molecular Sciences》上发表的研究，正是为了探究这个“M1悖论”。他们提出了一个大胆的假设：巨噬细胞的细胞毒性，或许并非总是一把直刺肿瘤心脏的利剑，反而可能成为一把“双刃剑”——其持续的杀伤压力，可能会像自然选择一样，筛选出那些能够抵抗这种攻击、并因此变得更强大、更恶性的肿瘤细胞变体。为了验证这一猜想，研究团队将目光投向了前列腺癌。
研究人员开展了一项构思巧妙的“压力选择”实验。他们以人源单核细胞系THP-1为起点，通过佛波酯（PMA）、干扰素-γ（IFNγ）和胞壁酰二肽（MDP）的刺激，将其诱导为具有细胞毒性的M1样巨噬细胞，这些细胞能高表达肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）等促炎因子。随后，他们让人前列腺癌细胞系PC3和DU145与这些“杀手”巨噬细胞进行了多轮“亲密接触”与共培养。那些能在巨噬细胞猛烈攻击下幸存下来的肿瘤细胞，被分离出来继续培养，如此反复，最终获得了稳定的、能抵抗巨噬细胞毒性的细胞亚系，分别命名为PC3-res和DU145-res。
为开展此项研究，作者主要应用了以下几项关键技术：1) 细胞共培养与压力选择模型，用于构建巨噬细胞抵抗的肿瘤细胞亚系；2) 多种体外功能实验，包括细胞增殖测定、克隆形成实验、Transwell迁移实验和明胶酶谱法，以评估细胞恶性表型；3) 裸鼠皮下异种移植瘤模型，用于在体内评估肿瘤细胞的成瘤性与组织病理学特征；4) 免疫细胞化学与蛋白质印迹法（Western Blot），用于分析上皮-间质转化（EMT）标志物和关键信号通路蛋白的激活状态；5) 转录组测序（RNA-seq）与生物信息学分析，结合定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）验证，用于在全基因组水平解析肿瘤细胞的转录重编程。
2.1. 抗性肿瘤细胞的增殖活性与克隆形成潜能
研究发现，经过巨噬细胞“筛选”的PC3-res和DU145-res细胞，展现出了更强的增殖能力。PC3-res细胞的群体倍增时间显著短于其亲本细胞。更重要的是，在低密度培养条件下，这些抵抗细胞形成了更多的克隆，表明其克隆原性生存能力显著增强。这意味着，抵抗巨噬细胞攻击的肿瘤细胞，不仅活了下来，还获得了更强的独立生存和扩增本领。
2.2. 巨噬细胞筛选的肿瘤细胞迁移能力保持不变
然而，这种“进化”并非全能。通过Transwell迁移实验发现，无论是PC3-res还是DU145-res细胞，其迁移能力与亲本细胞相比均无统计学上的显著增加。明胶酶谱分析显示，PC3-res细胞的基质金属蛋白酶-9（MMP-9）分泌有所增加，但DU145-res细胞无此变化。这表明，巨噬细胞选择压力主要赋予肿瘤细胞更强的定植和生长优势，而非迁移侵袭能力。
2.3. 巨噬细胞筛选的肿瘤细胞中的上皮-间质转化标志物
上皮-间质转化（EMT）是肿瘤细胞获得迁移、侵袭和干细胞样特性的关键过程。免疫细胞化学分析揭示了一个有趣的现象：PC3-res和DU145-res细胞中，间质标志物波形蛋白（Vimentin）的表达均上调，而上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）和β-连环蛋白（β-catenin）的表达则未发生显著变化。这提示细胞发生了“部分EMT”，即获得了一些间质特征以增强可塑性和适应压力，但并未完全失去上皮特性，走向全面的侵袭表型。
2.4. 巨噬细胞筛选的肿瘤细胞在体内表现出增强的致瘤潜能
体外实验的结论在动物模型中得到了有力印证。将抵抗细胞接种到裸鼠皮下后，它们形成的异种移植瘤体积更大、重量更重。组织病理学分析进一步显示，这些肿瘤具有更多坏死区域、更高的血管化程度，并出现了神经周围浸润等更具侵袭性的特征。一个有趣的发现是，这些肿瘤内部PU.1阳性的髓系细胞（主要是巨噬细胞）数量减少，暗示抵抗细胞可能改变了肿瘤微环境的免疫细胞组成。
2.5. 肿瘤细胞对紫杉醇敏感性的评估
研究还检验了这些“进化”后的肿瘤细胞对化疗药物紫杉醇（Paclitaxel）的敏感性。结果显示，无论是PC3-res还是DU145-res细胞，其半数抑制浓度（IC50）与亲本细胞相比均无显著差异。这表明，抵抗巨噬细胞压力所获得的恶性表型，并未同时带来对紫杉醇的交叉耐药。
2.6. 转录组分析
为了从分子层面理解这种适应性变化，研究人员对PC3-res细胞进行了转录组测序。分析发现，与亲本细胞相比，PC3-res细胞中有344个基因的表达发生了显著改变。基因集富集分析（GSEA）显示，上调的基因主要富集在细胞因子反应、免疫调节、NOD样受体信号通路等与炎症和应激适应相关的通路上。而下调的基因则与代谢过程、分化等相关。这描绘出一幅清晰的图景：巨噬细胞选择压力驱动了肿瘤细胞的“炎症适应性重编程”，使其激活了应对炎症和压力的基因程序，同时抑制了部分代谢和分化相关程序。
2.7. 巨噬细胞筛选的肿瘤细胞中p38 MAPK信号通路的激活
上述转录重编程伴随着特定信号通路的改变。蛋白质印迹分析显示，在PC3-res和DU145-res细胞中，p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的磷酸化水平（即激活状态）显著增加，而细胞外信号调节激酶（ERK）和蛋白激酶B（AKT）通路的激活状态则无显著变化。p38 MAPK是细胞应对炎症和应激信号的核心枢纽，其选择性激活与观测到的炎症适应性表型高度吻合。
综合以上结果，本研究得出了明确而重要的结论。持续的M1样巨噬细胞细胞毒性，确实构成了一种强大的选择压力，能够驱动前列腺癌细胞进化。这种进化并非赋予细胞全面的、经典的侵袭转移能力，而是导向一种独特的“炎症适应”状态。其特征是：增强的增殖与克隆形成能力、部分EMT样改变（如波形蛋白上调）、体内致瘤性增强，以及伴随p38 MAPK通路激活的炎症-应激适应性转录重编程。重要的是，细胞的迁移能力并未同步增强，且对紫杉醇的敏感性保持不变。
这项研究深刻地挑战了M1/M2巨噬细胞的简单二分法，并揭示了肿瘤免疫编辑中一个可能被忽视的“暗面”。它表明，旨在将肿瘤相关巨噬细胞重编程为M1表型的治疗策略，其效果可能高度依赖于具体情境。如果治疗仅仅诱导了短暂、强烈的巨噬细胞活化，可能有效清除肿瘤；但若导致了巨噬细胞细胞毒性的持续存在，则可能像本研究所揭示的那样，无意中扮演了“适者生存”的筛选者角色，反而促成了更具恶性潜能的肿瘤细胞变体的出现，最终可能不利于患者的长期预后。因此，未来的巨噬细胞靶向疗法需要更加精细地考量其作用时长和强度，避免“拔苗助长”。这项研究为我们理解肿瘤微环境中免疫细胞与肿瘤细胞之间复杂、动态的共进化关系提供了新的关键见解。
