《Infection and Immunity》：Construction and characterization of novel Mycobacterium tuberculosis-derived triple and quadruple knockout vaccines against tuberculosis
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本研究针对现有卡介苗(BCG)对成人肺结核保护效果不一致的临床困境，聚焦于开发更优的结核病(TB)疫苗。作者团队利用结核分枝杆菌(Mtb)的理性基因敲除策略，成功构建了三种新型疫苗菌株：TKO-Z (ΔfbpA-ΔsapM-Δzmp1)、TKO-D (ΔfbpA-ΔsapM-ΔdosR) 和 QKO (ΔfbpA-ΔsapM-Δzmp1-ΔdosR)。研究显示TKO-Z和QKO菌株在小鼠模型中表现出优于DKO的免疫原性，其中QKO在SCID小鼠中高度减毒，安全性更佳。结果表明，在Mtb中进行理性基因敲除是一种开发更安全、更高效结核疫苗的创新途径。
尽管与结核病的斗争已持续了数百年，但由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis， Mtb)引起的结核病(TB)至今仍是全球主要的致命性传染病之一，每年导致约160万人死亡。目前唯一广泛使用的预防性疫苗——卡介苗(BCG)，虽然沿用已近一个世纪，但它在不同人群中的保护效果存在很大差异，尤其无法为成人肺结核提供持续有效的保护，对日益严峻的耐多药(MDR)和广泛耐药(XDR)菌株更是力不从心。因此，研发一种能够超越BCG效力、保护更全面、更持久的新型疫苗，成为了全球公共卫生领域一项迫在眉睫的挑战。
在这一背景下，科学家们从不同角度探索了多种疫苗研发策略，包括亚单位疫苗、重组BCG疫苗和减毒Mtb突变株疫苗等。其中，减毒Mtb疫苗因保留了BCG所缺失的许多关键抗原（如ESAT-6和CFP-10），被视为最具潜力的候选策略之一。理想的减毒活疫苗需要在确保足够安全性的同时，具备强大的免疫刺激能力。为此，研究人员提出了一种“理性基因敲除”的思路：即有目的地删除Mtb中与其致病和免疫逃逸相关的关键基因，使其“功力”大减（即减毒），但同时“暴露”更多抗原，从而激发机体更强的免疫应答。
先前的研究已经取得了一些进展。例如，一个删除了fbpA和sapM两个基因的双敲除(DKO)菌株，已被证明比单个基因敲除或BCG具有更强的免疫原性和保护效力。fbpA基因编码一种与分枝菌酸合成相关的转移酶，而sapM基因则产生一种酸性磷酸酶，后者能够水解宿主细胞中一种对吞噬体成熟至关重要的脂质分子——磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P)。删除sapM能够阻止Mtb抑制吞噬体-溶酶体(PL)融合，从而促进抗原的加工和呈递。
然而，科研的脚步并未停止。为了进一步提升DKO菌株的免疫原性和安全性，本文的研究团队将目光投向了另外两个关键靶点：zmp1和dosR。zmp1基因编码一种锌金属蛋白酶(Zmp1)，它能抑制宿主细胞内一种名为炎症小体的免疫复合物的激活，并阻碍PL融合。之前有研究显示，在BCG中删除zmp1能增强其效力。而dosR基因则编码一个转录调节因子，它在Mtb应对低氧环境（类似于在宿主内潜伏的状态）时，调控着超过50个与休眠和持续感染相关基因的表达。删除dosR有望破坏细菌的休眠能力，促进其被宿主清除，从而增强疫苗的安全性。
基于以上科学假设，研究人员以DKO菌株为基础，成功构建了两个三敲除(TKO)菌株和一个四敲除(QKO)菌株。具体而言，他们在DKO (ΔfbpA-ΔsapM)的基础上，分别删除了zmp1或dosR基因，得到了TKO-Z (ΔfbpA-ΔsapM-Δzmp1)和TKO-D (ΔfbpA-ΔsapM-ΔdosR)；接着，又在TKO-D的基础上删除了zmp1，最终得到了QKO (ΔfbpA-ΔsapM-ΔdosR-Δzmp1)菌株。随后，他们在小鼠模型中系统地评估了这些新型疫苗菌株的免疫原性、保护效力及安全性，相关研究成果发表在《感染与免疫》（Infection and Immunity）杂志上。
为了开展这项研究，作者运用了几个关键的技术方法。首先，他们采用了基于同源重组的基因敲除技术，利用特制的敲除质粒和噬菌体转导法，在DKO菌株中实现了zmp1和dosR基因的精准、无痕（或可筛选标记消除）删除。其次，利用来自C57BL/6小鼠的骨髓来源巨噬细胞(BMDM)和SCID（重症联合免疫缺陷）小鼠，分别建立了评估细菌胞内生存、免疫应答和疫苗安全性的关键模型。此外，一系列体外和离体功能实验被用于系统评估疫苗效果，包括：1) 免疫荧光共定位分析，检测细菌与吞噬体标记物Rab7、自噬标记物LC3的共定位情况，以评估PL融合和自噬水平；2) 流式细胞术检测感染细胞的凋亡情况；3) 体外抗原呈递实验，通过测量T细胞杂交瘤BB7产生的白介素-2(IL-2)水平，评估巨噬细胞处理和呈递Mtb抗原的能力；4) 通过酶联免疫斑点(ELISPOT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)，检测免疫小鼠脾细胞在抗原刺激下产生干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子的水平，以评估免疫原性；5) 疫苗保护效力实验，通过气溶胶感染小鼠结核杆菌(Erdman株)并计数肺和脾中的菌落形成单位(CFU)，评估疫苗的保护能力。
研究结果
1. Mtb突变疫苗菌株在BMDMs中表现出更低的胞内存活
研究人员首先检测了新型菌株在巨噬细胞内的生存能力。结果显示，与野生型Mtb H37Rv相比，所有突变株（TKO-Z、TKO-D和QKO）在感染巨噬细胞4天和8天后，细菌载量(CFU)均显著降低。其中，TKO-Z的生存率与DKO相似，表明仅删除zmp1对胞内存活影响不大。而TKO-D和QKO菌株则显示出更大幅度的细菌载量减少，这表明删除dosR基因能显著削弱Mtb在巨噬细胞内的生存能力。
2. BMDMs感染Mtb突变疫苗菌株后吞噬体成熟和自噬反应增强
为了探究细菌载量降低的原因，研究人员检测了巨噬细胞对细菌的处理过程。免疫荧光结果显示，与感染H37Rv或DKO的巨噬细胞相比，感染了TKO-Z和QKO（即含有zmp1缺失）的巨噬细胞，其内部的细菌与吞噬体成熟标记物Rab7、自噬体标记物LC3的共定位程度显著更高。这表明删除zmp1促进了细菌被巨噬细胞通过吞噬溶酶体途径和自噬途径进行清除。而TKO-D菌株在这方面与DKO没有显著差异。
3. BMDMs感染Mtb疫苗菌株后凋亡性细胞死亡增加
流式细胞术分析显示，与感染野生型H37Rv相比，感染所有疫苗菌株（DKO、TKO-Z、TKO-D、QKO）的巨噬细胞，其凋亡比例均显著增加。然而，不同疫苗菌株之间诱导凋亡的能力没有明显差别，表明zmp1或dosR的缺失并未对凋亡诱导产生额外的叠加效应。
4. BMDMs感染Mtb疫苗菌株后抗原呈递增强
由于TKO-Z和QKO感染促进了PL融合和自噬，研究人员预测它们能更有效地呈递抗原。体外抗原呈递实验证实了这一点：感染TKO-Z和QKO的巨噬细胞，在与识别Mtb抗原Ag85B特定表位的T细胞共培养后，能刺激T细胞产生显著更高水平的IL-2。而感染TKO-D的巨噬细胞，其抗原呈递能力与DKO相当。这证实了增强的吞噬体处理与提升的抗原呈递之间存在关联。
5. Mtb疫苗菌株在体内能激发更强的免疫反应
接下来，研究人员在小鼠体内评估了疫苗的免疫原性。用突变菌株免疫小鼠后，取其脾细胞并用Mtb全菌裂解物刺激，这些脾细胞产生了显著高于BCG或H37Rv免疫组的多种关键Th1型细胞因子，包括IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-12和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。ELISPOT实验也显示，免疫小鼠脾细胞中能识别Mtb抗原Ag85B和CFP-10并产生IFN-γ的细胞频率更高。其中，TKO-Z和QKO菌株激发的免疫反应似乎最强。
6. Mtb疫苗菌株在小鼠中展现出保护效力
保护效力实验表明，用DKO、TKO-Z或QKO菌株免疫的小鼠，在受到有毒力Mtb (Erdman)攻击后，其肺部的细菌负荷显著低于用BCG免疫的小鼠，显示出更好的保护效果。然而，值得注意的是，尽管TKO-Z和QKO的免疫原性更强，但它们在降低肺部细菌负荷方面，与DKO提供的保护水平相当，并未显示出进一步的提升。
7. SCID小鼠感染Mtb疫苗菌株后的生存研究
安全性是活疫苗临床转化的关键。在免疫缺陷的SCID小鼠模型中，研究人员评估了各菌株的毒力。结果显示，感染野生型H37Rv的小鼠存活时间最短。所有疫苗菌株都显著延长了小鼠的存活时间，表明其毒力已大大减弱。其中，感染QKO菌株的小鼠存活时间最长，与感染BCG的小鼠存活时间最为接近，这表明QKO菌株具有高度减毒的特性，安全性良好。
结论与讨论
本研究通过理性基因敲除策略，成功构建并系统评估了基于结核分枝杆菌的新型三敲和四敲减毒活疫苗候选株。研究发现，删除zmp1基因能显著增强疫苗菌株的免疫原性，这主要归因于其促进了巨噬细胞的吞噬溶酶体融合、自噬以及抗原呈递过程。相比之下，删除dosR基因则主要贡献于细菌的减毒，降低了其在巨噬细胞内的生存能力，但对免疫原性的提升作用有限。这一对比揭示了不同毒力因子在疫苗设计中的独特作用：有些基因的缺失能有效“暴露”病原体，激发免疫系统（如zmp1）；而有些基因的缺失则主要让病原体“变弱”，提高安全性（如dosR）。这强调了在设计减毒活疫苗时，需要精心选择和组合靶点，以平衡效力与安全。
特别重要的是，尽管TKO-Z和QKO在免疫原性上优于DKO，但三者在小鼠模型中对结核杆菌攻击的保护效力相当。这表明，在达到一定的免疫刺激阈值后，单纯提高某些免疫指标（如细胞因子水平）可能不会直接转化为更强的保护效果，免疫应答的“质”（如记忆T细胞的质量、组织驻留性等）可能同样关键，这为未来的疫苗优化指明了方向。
另一方面，安全性评估带来了积极信号。QKO菌株在SCID小鼠中表现出接近BCG的高水平减毒，证明了通过多重理性基因敲除，可以有效地将高致病性的Mtb“改造”成安全性可接受的疫苗候选株。这为开发比现有BCG更安全、且可能保留更多保护性抗原的下一代结核病疫苗提供了强有力的概念验证和可行的技术路径。
综上所述，这项研究不仅展示了理性基因敲除策略在结核病疫苗设计中的巨大潜力，也为理解Mtb毒力因子与宿主免疫系统之间的复杂互动提供了新的见解。虽然从实验室到临床应用仍有长路要走，但QKO等候选株所展现出的良好安全性和免疫原性，无疑为终结结核病这一古老传染病的努力增添了新的希望。未来，通过进一步优化基因敲除组合（例如考虑引入像fadD26这样的减毒靶点），并与目前已进入临床试验的其他候选疫苗（如MTBVAC）进行头对头比较，将有望筛选出最优的下一代结核病疫苗，最终实现比卡介苗更广泛、更有效的保护。
