《Viruses》：Investigation of the Viromes of Solanaceous Weeds in Hungary Using High-Throughput Sequencing Adds New Insights to Their Hidden Complexity
Burim Ismajli,
Zsuzsanna N. Galbács,
Lilla Dorottya Péri,
Gy?rgy Pasztor,
András Péter Takács and
éva Várallyay
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本研究针对茄科作物田中的茄科杂草难以防除且可能作为病毒库的问题，利用高通量测序技术调查了匈牙利地区龙葵、曼陀罗和欧白英的病毒组。研究发现这些杂草感染了多种病毒，包括首次在欧洲或在该寄主上发现的病毒，揭示了茄科杂草病毒组的意外复杂性，强调了在植保策略中考虑其病毒库作用的重要性。
在农业生产中，除了看得见的害虫和病害，一些潜伏在田边地头的“隐形邻居”也构成了巨大威胁。茄科作物（如马铃薯、番茄、辣椒）的田地里，常常伴生着同科的杂草，例如龙葵(Solanum nigrum)、曼陀罗(Datura stramonium)和欧白英(Solanum dulcamara)。这些杂草不仅是争夺养分和水分的竞争者，更棘手的是，它们可以感染多种病毒，并在自身不表现明显症状的情况下，成为病毒的“蓄水池”和“中转站”。当传毒昆虫（如蚜虫）在杂草和作物之间移动时，病毒便悄然扩散，威胁作物健康与产量。因此，了解这些杂草究竟携带了哪些病毒，对于制定有效的病害防控策略至关重要。然而，传统的病毒检测方法可能存在偏向性，难以全面揭示其复杂的病毒组成。为此，一项发表在《Viruses》上的研究，利用高通量测序(High-Throughput Sequencing, HTS)这一“无偏见”的先进技术，对匈牙利凯斯特海伊地区采集的茄科杂草进行了深入的病毒组(Virome)调查，揭开了这些植物病毒库的神秘面纱。
为了开展这项研究，研究人员在2022年和2023年的夏季，于匈牙利凯斯特海伊附近的农田和巴拉顿湖畔的自然生境中，采集了有病毒疑似症状的龙葵、曼陀罗、欧白英以及油菜样本。研究采用的主要关键技术方法包括：1）样本制备与测序：对同种杂草的总核酸进行混合建库，分别进行了去除核糖体RNA的RNA测序(RNA-Seq)和小RNA测序(sRNA sequencing)；2）生物信息学分析：使用CLC基因组工作台对测序数据进行质量控制和de novo组装，将得到的重叠群(contig)与已知植物病毒基因组数据库进行比对，鉴定病毒种类，并将测序回帖到参考基因组以计算覆盖度；3）实验验证：通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对高通量测序鉴定的所有病毒进行验证，并使用病毒特异性引物对个体样本进行检测，以确定具体感染植株；4）系统发育分析：对通过RT-PCR获得并测序的病毒片段进行多序列比对，构建系统发育树，分析检测到的病毒株系与全球其他株系的亲缘关系。
3.1. 茄科杂草的高通量测序揭示了多种不同病毒的存在
通过对2022年(SOLKES1)和2023年(SOLKES2)的两个混合样本池进行RNA测序，研究初步鉴定出多种病毒。2022年的样本中检测到蚕豆萎蔫病毒1号(Broad bean wilt virus 1, BBWV1)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、芜菁黄花病毒(Turnip yellows virus, TuYV)和烟草脉明病毒(Tobacco vein clearing virus, TVCV)；2023年的样本中则检测到莴苣大脉伴随病毒(Lettuce big-vein associated virus, LBVaV)、奥布达辣椒病毒(Obuda pepper virus, ObPV)样病毒、马铃薯M病毒(Potato virus M, PVM)、马铃薯H病毒(Potato virus H, PVH)样病毒、红藜丝分病毒1号(Oxybasis rubra mitovirus 1, OxruMV1)样病毒和烟草脉明病毒(TVCV)。小RNA测序分析进一步揭示了病毒衍生的sRNA在大小分布上的差异，例如CMV和BBWV1的sRNA以21-22核苷酸(nt)为主，表明活跃的病毒感染状态；而TuYV和TVCV的sRNA以24 nt为主，提示可能是持续性感染或基因组整合状态。
3.2. 通过RT-PCR验证RNA测序结果，确认了九种病毒的感染
为了验证高通量测序的结果，研究对所有鉴定的病毒进行了RT-PCR检测，并确定了具体受感染的植株个体，得出以下结论：
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BBWV1与CMV：仅在个别龙葵植株中检测到感染。系统发育分析表明，检测到的BBWV1匈牙利龙葵株系(HUSn)的RNA1和RNA2可能起源于不同的进化分支，提示其为重配株系；而CMV株系则属于致病性较强的IA亚组。
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TuYV：在一株曼陀罗和一株龙葵中检测到，这是首次描述TuYV可感染曼陀罗。其序列与中欧地区油菜中流行的株系高度相似。
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LBVaV：在一株欧白英中检测到，这是首次报道该病毒可感染欧白英，也是该病毒在匈牙利的首次报告。
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ObPV样烟草花叶病毒属病毒：在两株曼陀罗和一株欧白英中检测到。其序列与已知的ObPV参考基因组相似度低于物种界定标准，研究人员认为其很可能是早年报道但未测序的欧白英黄点病毒(Solanum dulcamara yellow fleck virus, SDYFV)，并且是一个不同于ObPV的独立物种。
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PVM：在2023年采集的所有龙葵和欧白英植株中均检测到感染，表明该年份蚜虫传播压力大。其株系与中欧地区（斯洛伐克、匈牙利）的株系聚类在一起。
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PVH样病毒：在三株欧白英中检测到。其序列与亚洲报道的PVH参考基因组相似度较低，可能是一个新的、与PVH亲缘关系很近的病毒物种，这也是其在欧洲的首次报告。
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OxruMV1样丝分病毒：在三株欧白英中检测到。丝分病毒通常感染真菌，在植物中发现表明其可能来源于其真菌共生体，其在植物中的作用尚不清楚。
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TVCV：在几乎所有测试的龙葵种群和两株曼陀罗中均检测到。其序列多样性高，且sRNA以24 nt为主，强烈提示该逆转录病毒序列已多次整合到这些杂草的基因组中，成为内生植物逆转录病毒(Endogenous plant pararetroviruses, EPRVs)。
在讨论与结论部分，研究强调，尽管采样规模有限，但通过高通量测序仍高效地揭示了茄科杂草病毒组惊人的复杂性。研究发现具有重要的植物病理学意义：首先，确认了茄科杂草作为多种作物病毒“蓄水池”的角色，包括BBWV1、CMV、PVM等可能对辣椒、番茄、马铃薯造成经济损失的病毒。其次，研究取得了多项新发现：首次报道了TuYV可感染曼陀罗、LBVaV可感染欧白英；提供了SDYFV是不同于ObPV的独立物种的分子证据；首次在欧洲报道了PVH样病毒和OxruMV1样丝分病毒。第三，研究揭示了病毒感染的时空动态与机制差异：PVM在特定年份的高感染率可能与蚜虫种群暴发有关；而TVCV则广泛以基因组整合形式存在于杂草中，可能影响杂草的抗逆性。此外，不同病毒衍生的sRNA谱反映了感染的不同阶段（活跃期、持久期）或存在形式（游离病毒、整合序列）。
这项研究不仅更新了我们对特定地区茄科杂草病毒组成的认知，更重要的是，它警示了在农业生态系统中，杂草作为病毒库的潜在风险不容忽视。气候变化可能导致媒介昆虫和杂草越冬更加容易，从而延长和扩大其病毒库功能。因此，在制定可靠高效的植物保护策略时，必须考虑这些生长在作物附近的杂草及其复杂的病毒组，这对于减轻病毒传播压力、保障作物安全生产具有重要意义。最后，研究者将此文献给已故的匈牙利古典植物病毒学家József Horváth和Pál Salamon，以示对他们开创性工作的致敬与传承，他们的早期观察为现代分子研究提供了宝贵的线索和方向。
