双金属稀土纳米平台可放大DNA损伤，从而引发坏死性凋亡和免疫级联反应，实现高效且持久的抗肿瘤治疗效果

《Acta Biomaterialia》：Bimetallic rare earth nanoplatform amplifies DNA damage to trigger necroptosis and immune cascade for potent durable antitumor therapy

通过构建pH响应性双金属稀土羟基纳米颗粒（YMn(OH)?@MTX NPs），在肿瘤微环境中可控释放Y3?、Mn2?和甲氨蝶呤，协同诱导DNA损伤和RIPK3-MLKL介导的坏死，释放的DNA片段和Mn2?激活cGAS-STING通路，放大先天性免疫应答，重塑免疫抑制微环境，实现高效持久的抗肿瘤免疫治疗。

　　

金银诺|朱国清|丁雪宁|康斌|孙倩倩|钱彦荣|李春霞

中国山东省青岛市山东大学化学与化学工程学院前沿化学研究所，266237

摘要

免疫疗法是一种利用免疫系统特异性消除肿瘤细胞的创新癌症治疗方法，但肿瘤的免疫逃逸和药物耐药性往往导致暂时性缓解而非根治。诱导DNA损伤是提高免疫治疗效果的有前景的方法。本文构建了一种pH响应性的甲氨蝶呤（MTX）负载的双金属稀土氢氧化物纳米颗粒（YMn(OH)_x@MTX NPs）。这些纳米材料能够在酸性的肿瘤微环境和溶酶体内可控地释放Y³⁺、Mn²⁺和MTX，显著诱导肿瘤细胞的细胞器和DNA损伤，并激活受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）-混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）介导的坏死性凋亡。MTX抑制二氢叶酸还原酶（DHFR）的活性，从而减少四氢叶酸（THF）的生成。这抑制了肿瘤DNA的复制，阻断了受损DNA的修复，并放大了纳米材料诱导的初始DNA损伤，进一步增强了坏死性凋亡。此外，坏死性凋亡肿瘤细胞释放的损伤相关分子模式（DAMPs），以及细胞内的游离DNA和Mn²⁺，协同作用激活环状鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）信号通路，触发先天免疫。这种“先天-适应性免疫”协同作用重新编程了免疫抑制的肿瘤微环境，提供了高效且持久的抗肿瘤疗法。总体而言，这种基于稀土的纳米平台通过多途径协同作用，为先进的抗肿瘤策略提供了创新见解。

意义声明

本研究创新性地构建了一种pH响应性的双金属稀土纳米平台。通过直接诱导DNA损伤和损伤放大的双重协同策略，它触发了RIPK3-MLKL介导的坏死性凋亡。死亡的肿瘤细胞释放的损伤相关分子模式（DAMPs），以及纳米平台释放的细胞内游离DNA和Mn²⁺，协同激活了cGAS-STING通路，启动了免疫反应。这克服了肿瘤免疫逃逸和药物耐药性的挑战，打破了传统单一模式治疗的局限性。这种多途径协同设计为癌症治疗提供了新的范式，使读者能够直观地理解纳米技术和肿瘤免疫学之间跨学科创新的魅力，并激发科学研究灵感。

引言

肿瘤具有高度异质性、复杂的免疫抑制性肿瘤微环境以及强烈的转移倾向等关键生物学特征[1,2]。这些特性使得包括手术、放疗和化疗在内的传统治疗方法难以实现治愈效果[[3], [4], [5], [6]]。因此，免疫疗法作为一种变革性方法在肿瘤学中脱颖而出，通过对抗肿瘤的免疫逃逸和逆转肿瘤微环境中的免疫抑制[7,8]。通过激活或增强免疫细胞的功能，免疫疗法使身体能够更好地识别和消除肿瘤细胞[9]。大多数实体瘤表现出免疫抑制性微环境，其特征是效应T细胞浸润不足和免疫抑制细胞大量存在。这类肿瘤通常被称为免疫“冷”肿瘤[[10], [11], [12], [13], [14]]。这种“冷”状态通常与对免疫疗法干预反应不佳相关[15]。为了提高免疫疗法的效果，研究人员正在积极探索重塑肿瘤微环境并将免疫“冷”肿瘤转化为能够引发强烈抗肿瘤免疫反应的“热”肿瘤的策略[[16], [17], [18]]。一个关键策略是激活先天免疫信号通路，这是通向适应性免疫的关键桥梁[19,20]。其中，环状鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）信号通路通过感知细胞质双链DNA（dsDNA）来启动先天免疫，从而诱导干扰素-β（IFN-β）的产生并激活下游的先天免疫反应[[21], [22], [23]]。虽然已经设计出了多种STING激动剂，但其临床应用受到递送效率低和稳定性差的限制[24,25]。作为替代方案，在肿瘤细胞内持续生成内源性dsDNA被认为是一种更有效的激活cGAS-STING通路的方法[26]。例如，Cheng等人开发了CoF₂纳米催化剂，在超声刺激下能够生成活性氧（ROS），从而诱导DNA损伤并激活cGAS-STING通路[27]。同样，Guo等人设计了FeMn-NCe双金属纳米酶，在X射线照射下生成ROS，导致DNA损伤并激活cGAS-STING通路[28]。然而，肿瘤细胞具有强大的自我修复机制，能够激活多种DNA修复途径来有效对抗治疗诱导的DNA损伤[29,30]。这种增强的DNA修复能力减少了DNA损伤引起的细胞死亡，最终降低了治疗效果并促进了药物耐药性的发展。

通过抑制DNA合成来放大DNA损伤已成为一种有效的策略，甲氨蝶呤（MTX）就是一个典型的例子。作为一种经典的叶酸拮抗剂化疗药物，MTX抑制二氢叶酸还原酶（DHFR）的活性，从而减少四氢叶酸（THF）的生成，最终阻碍肿瘤细胞的DNA合成[31,32]。然而，肿瘤细胞通常对MTX具有固有的耐药性，这限制了其作为单一疗法的有效性[33]。将MTX与直接DNA损伤策略结合使用可以有效地克服这些限制，并对抗肿瘤细胞强大的DNA自我修复能力。这种组合方法诱导广泛的DNA损伤，有效触发坏死性凋亡并消灭肿瘤细胞[34]。与凋亡不同，受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）-混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）介导的坏死性凋亡会释放损伤相关分子模式（DAMPs），这些分子可以激活抗原呈递细胞并增强适应性免疫[35,36]。同时，产生的DNA片段触发cGAS-STING通路，进一步增强先天免疫反应[37]。作为cGAS的关键辅因子，Mn²⁺显著增强了cGAS-STING通路的激活。

基于坏死性凋亡驱动的免疫原性细胞死亡（ICD）与Mn²⁺增强的cGAS-STING通路之间的协同作用，我们提出了一种新的治疗策略，包括诱导双重DNA损伤（直接DNA链断裂和抑制DNA合成）以启动坏死性凋亡，同时共递送Mn²⁺以增强先天免疫激活。通过在肿瘤细胞中造成大量DNA损伤并结合两种互补的免疫调节机制，这种双管齐下的干预实现了协同抗肿瘤免疫疗法，为克服肿瘤免疫抑制提供了有希望的途径。具体来说，我们构建了一种酸响应性的双金属稀土氢氧化物纳米材料，其中负载了MTX，称为YMn(OH)_x@MTX，用于共递送MTX和金属离子（Y³⁺、Mn²⁺）（图1）。在暴露于酸性肿瘤微环境时，YMn(OH)_x@MTX纳米颗粒（NPs）发生pH响应性降解，从而可控地释放Y³⁺、Mn²⁺和MTX。释放的Y³⁺是引发严重DNA损伤的主要驱动因素。作为一种高电荷密度的金属离子，Y³⁺对核酸的负电荷磷酸骨架具有极强的配位亲和力[39]。同时，Y³⁺及相关镧系离子能够与DNA结构发生强烈的配位相互作用，从而促进DNA骨架的断裂并引发严重损伤[40,41]。与此同时，MTX抑制DHFR，减少THF的生成，从而阻断DNA合成。这种联合作用引发双重DNA损伤，选择性地激活RIPK3-MLKL介导的坏死性凋亡和随后的ICD。坏死性凋亡的肿瘤细胞释放DAMPs和片段化的DNA，与共释放的Mn²⁺协同作用，强烈激活cGAS-STING通路。这种协调诱导的坏死性凋亡和cGAS-STING信号通路重新编程了免疫抑制的肿瘤微环境，促进了树突状细胞（DCs）的成熟并增强了细胞毒性T细胞的浸润，最终实现了强效的抗肿瘤免疫。总之，这项工作展示了一种合理设计的双重DNA损伤策略，协同激活了坏死性凋亡和cGAS-STING介导的免疫，为先进的肿瘤免疫疗法提供了一个非常有前景的平台。

YMn(OH)_x@MTX NPs的合成

通过改变反应过程中的粘度，我们成功合成了基于GdNd(OH)_x NPs制备的YMn(OH)_x NPs[42]。首先，准确称量120毫克十六烷基三甲基铵溴化物（CTAB）、72毫克水杨酸钠和18毫克六亚甲基四胺，然后加入三颈烧瓶中。接下来，分别取3毫升每种预配好的溶液（2.0毫克/毫升无水柠檬酸溶液、15毫克/毫升YCl₃·6H₂O和15毫克/毫升MnCl₂·2H₂O，加入烧瓶中。

YMn(OH)_x@MTX NPs的合成与表征

在材料制备过程中，采用了一种简便的一锅法，以YCl₃·4H₂O和MnCl₂·4H₂O作为前体。选择Y和M不仅构建了一个稳定的双金属氢氧化物框架，还赋予了其双重生物功能，包括Y介导的DNA损伤和Mn诱导的cGAS-STING通路激活。通过系统比较优化了前体比例和反应条件，实现了YMn(OH)_x NPs的可控合成

结论

在这项研究中，我们设计并开发了一种负载MTX的双金属稀土纳米平台（YMn(OH)_x@MTX NPs），通过诱导双重DNA损伤来提高免疫疗法的效果。在肿瘤和溶酶体的酸性微环境中，该纳米材料可控地释放Y³⁺、Mn²⁺和MTX，触发细胞器功能障碍和DNA损伤，从而激活RIPK3-MLKL介导的坏死性凋亡。同时，MTX抑制DHFR活性并减少THF的生成，从而严重抑制

作者声明

金银诺：概念构思、数据整理、形式分析、研究、方法学、验证、初稿撰写。朱国清：数据整理、研究、形式分析。丁雪宁：概念构思、形式分析。康斌：研究、方法学。孙倩倩：资金获取、监督、验证、可视化、撰写-审阅与编辑。钱彦荣：监督、验证、可视化。李春霞：资金获取、监督、验证

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CRediT作者贡献声明

金银诺：初稿撰写、验证、方法学、研究、形式分析、数据整理、概念构思。朱国清：研究、形式分析、数据整理。丁雪宁：形式分析、概念构思。康斌：方法学、研究。孙倩倩：撰写-审阅与编辑、可视化、验证、监督、资金获取。钱彦荣：可视化、验证、监督、资金获取。李春霞：撰写-审阅与编辑