Trk1钾转运蛋白对于Candidozyma auris在皮肤上的有效定植至关重要

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Trk1 potassium transport is crucial for effective Candidozyma auris skin colonization

耳念珠菌皮肤定植依赖TRK1钾转运蛋白，其功能缺失导致低钾耐受性、膜电位异常及pH失衡，揭示该基因是新型治疗靶点。

　　

摘要

最近出现的真菌病原体Candidozyma (Candida) auris在全球医院中引发了多起侵袭性疾病的暴发。它是首个被归类为全球公共卫生威胁的真菌病原体，因为它能够轻易地在皮肤上定植、高效地在人与人之间传播，并导致高死亡率的侵袭性感染。皮肤定植不仅促进了医疗传播，还通过医疗设备插入皮肤而导致侵袭性感染。然而，C. auris在皮肤生态位中存活的机制仍不甚明了。在这里，我们发现钾（K⁺是这种环境中高效生长的关键营养素。我们表明，假设的高亲和力K⁺转运蛋白Trk1对于C. auris在体外人类皮肤上的生长是必需的。破坏TRK1会显著影响K⁺的吸收，导致质膜超极化、细胞内pH值降低以及对阳离子压力的敏感性增加。这些发现表明，TRK1对于维持C. auris在人类皮肤上的定植过程中的K⁺稳态是必要的，这为理解这一新兴威胁的发病机制提供了线索。鉴于TRK1在人类中没有已知的同源物，其基因产物可能成为开发针对C. auris在皮肤上繁殖的新策略的有希望的治疗靶点。

最近出现的Candidozyma（Candida）auris由于其抗真菌耐药性、在医疗环境中的传播能力以及在全世界范围内导致高死亡率血流感染的作用，已被列为紧急的公共卫生威胁（1）。C. auris的一个独特特征是其能够持续在人类皮肤上定植，这促进了其在医疗机构患者中的快速传播（1，2）。当医疗仪器（例如静脉导管和手术工具）穿透皮肤屏障时，皮肤定植会显著增加侵袭性感染的风险（2）。与C. auris感染相关的高死亡率强调了更好地理解、预防和/或治疗皮肤定植的紧迫性，不仅是为了阻止医院内的传播，也是为了减少严重系统感染的潜在风险（1，2）。

结果

我们最初使用了一种合成汗液培养基（SSM）来阐明C. auris在皮肤上的生长需求。与之前的研究一致，C. auris在这种培养基中迅速繁殖（图1A）（3）。为了确定生长所需的SSM成分，我们配制了一种最小SSM（MS），其中包含了SSM和常用培养基RPMI-MOPS中的成分。C. auris在MS中无法生长。我们系统地重新引入了每种缺失的成分，并发现KHCO₃可以恢复其生长（图1A）。为了区分K⁺和HCO₃^-的单独效应，我们在培养基中添加了等摩尔的KCl或NaHCO₃。添加KCl可以恢复生长，而NaHCO₃则不能，这表明K⁺是关键成分（图1A）。

图1.

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Candidozyma auris需要TRK1来吸收K⁺并在皮肤生态位中生长。（A）C. auris WT在汗液中培养24小时，使用最小SSM（MS）、MS + 12 mM KCl、MS + 12 mM KHCO₃、MS + 12 mM NaHCO₃或不含KHCO₃的汗液。（B和C）通过OD₆₀₀测量C. auris在SSM中的生长情况（B）、YPD（C）。（D）C. auris菌株在添加了不同浓度KCl的SSM中培养，并在18小时时测量OD₆₀₀。（E）C. auris在SSM中培养4小时后冻干。使用ICP-OES测量K⁺浓度。数据以K⁺%/干重表示。（F）C. auris菌株在含有100 mM KCl的YNB中过夜培养，然后在不含KCl的YNB中饥饿2小时，重新悬浮在pH 5.5的MES缓冲液中，与Rb⁺ 500 μM共孵育10分钟，洗涤后使用氦模式ICP-MS/MS分析Rb⁺。（G）C. auris细胞在10 mM MES缓冲液中重新悬浮，加入0.2 μM diS-C₃（3）并在30?C下培养1小时，根据需要用10 μM CCCP或12.5 μM AMD处理。（H）用pHrodo Green AM染色30分钟后测量细胞内pH值，并使用校准曲线进行量化。数据以平均值±标准误差（SEM）（A–F，H）或最小值到最大值（G）表示。数据使用单因素方差分析（ANOVA）和Holm–Sidak多重比较检验（A）、双因素方差分析及Dunnett多重比较检验（B–D）、多重非配对t检验（D）、非配对t检验（E，F，H）以及双因素方差分析及Sidak多重比较检验（G）进行分析。数据代表3到7次生物学重复实验（A–H）。*P < 0.05。

为了阐明K⁺对C. auris在皮肤上生长的作用，我们基于与Saccharomyces cerevisiae或C. albicans的同源性，生成了具有高亲和力K⁺转运蛋白基因（TRK1和ACU1）突变的菌株（4，5）。我们没有观察到acu1Δ的显著生长缺陷（图1B）。相比之下，trk1Δ在SSM中的生长明显低于野生型（WT）菌株，这表明TRK1是这些条件下C. auris的主要K⁺转运蛋白（图1B）。补充trk1Δ后，其生长恢复到与WT相当的水平（图1B）。当trk1Δ在富营养培养基中繁殖时，也恢复了正常生长（图1C）。为了确定trk1Δ在SSM中的生长缺陷是否是由于无法吸收足够的K+，我们在SSM中添加了K+（5）。酵母通常将细胞内K+浓度维持在200 mM到300 mM之间，先前的研究表明，向细胞外补充K+到这个范围可以支持生长，而不依赖于高亲和力的K+吸收（5，6）。我们发现trk1Δ需要250 mM K+才能达到WT的生长水平，而WT在低至1 mM的K+浓度下也能正常生长（图1D）。这些发现表明TRK1对于在代表皮肤微环境的低K+浓度下维持有效生长是必要的（7）。

接下来，我们使用电感耦合等离子体光学发射光谱（ICP-OES）直接测量了细胞内的K⁺浓度（8，9）。在SSM中生长后，我们观察到trk1Δ的K⁺浓度按重量计算减少了近20%，这与trk1Δ维持适当细胞内K+水平的能力受到严重损害一致（图1E）。为了分析K+的吸收，我们使用了铷（Rb+），这是一种具有与K+相似性质的阳离子，它通过真菌和哺乳动物细胞中的K+转运蛋白进行吸收，其动态与K+相似（5）。由于Rb+在自然界中并不丰富，其吸收速率可以更精确地测量。使用电感耦合等离子体串联质谱（ICP-MS/MS），我们发现trk1Δ的Rb+吸收显著减少（图1F），这表明Trk1在K+吸收中起作用。

由于细胞内K⁺的电化学梯度是真菌膜电位的驱动力，因此改变这种梯度会严重损害膜极化和细胞存活（10）。为了研究膜电位，我们使用了荧光探针3,3??-dipropylthiacarbocyanine iodide [diS-C₃（3）（5）。作为一种带正电的染料，细胞内吸收是由负膜电位驱动的，细胞内的染料会形成聚集体，导致最大荧光发射光谱发生蓝移（约575到585纳米）。我们观察到trk1Δ的585/575比率增加，表明膜超极化（图1G）。trk1Δ的膜超极化可以通过去极化剂carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone（CCCP）部分逆转，并且可以通过amiodarone（AMD）进一步增强，后者诱导的膜超极化与K⁺无关（图1G）（11）。酵母的K⁺稳态也与pH调节密切相关（6）。使用pHrodo Green AM指示剂，我们发现trk1Δ在汗液中生长后的细胞内pH值低于WT（图1H）。

我们还探讨了TRK1可能对保护细胞免受阳离子压力重要的可能性，因为酵母细胞必须防止环境中的阳离子积累，因为这些阳离子会破坏酶的功能并产生毒性（6）。使用LiCl作为阳离子压力的替代物，我们发现trk1Δ比WT更敏感（图2A）。这种敏感性可以通过补充K⁺来缓解（图2B）。

图2.

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TRK1可以保护细胞免受阳离子压力的影响，并且是C. auris在人类皮肤上定植所必需的。（A和B）C. auris菌株在含有或不含LiCl（A）以及250 mM K⁺的SSM中培养（B和C）。C. auris菌株在人类皮肤上培养24小时，然后进行涡旋处理，并用扫描电子显微镜成像（C）或计数活菌数量（D）。（C）条形图表示200×倍下的100 μM和1,000×倍下的20 μM。（E）C. auris WT和trk1Δ菌株在B11801和B11785背景中在SSM中培养18小时。数据以平均值±标准误差（SEM）表示（A，B，D，E）。比较使用了双因素方差分析及Sidak多重比较检验（A和B）、非配对t检验（D）或多重非配对t检验（E）。n = 3到6（A–E）。*P < 0.05。

为了评估Trk1对C. auris在皮肤上生长的影响，我们生成了基于与Saccharomyces cerevisiae或C. albicans同源性的高亲和力K+转运蛋白基因（TRK1和ACU1）突变的菌株（4，5）。我们没有观察到acu1Δ的显著生长缺陷（图1B）。相比之下，trk1Δ在SSM中的生长明显低于野生型（WT）菌株，这表明TRK1是这些条件下C. auris的主要K+转运蛋白（图1B）。补充trk1Δ后，其生长恢复到与WT相当的水平（图1B）。当trk1Δ在富营养培养基中繁殖时，也恢复了正常生长（图1C）。为了确定trk1Δ在SSM中的生长缺陷是否是由于无法吸收足够的K+，我们在SSM中添加了K+（5）。酵母通常将细胞内K+浓度维持在200 mM到300 mM之间，先前的研究表明，向细胞外补充K+到这个范围可以支持生长，而不依赖于高亲和力的K+吸收（5，6）。我们发现trk1Δ需要250 mM K+才能达到WT的生长水平，而WT在低至1 mM的K+浓度下也能正常生长（图1D）。这些发现表明TRK1对于在代表皮肤微环境的低K+浓度下维持有效生长是必要的