光照胁迫和营养介质的耗竭会诱导来自海洋红微藻Poprhyridium purpureum的外多糖的产生及其抗黑色素生成活性

《Algal Research》：Light stress and nutrient media depletion induce production and anti-melanogenesis activities of exopolysaccharides derived from marine species of red microalga Poprhyridium purpureum

本研究通过调控光照强度和培养基类型，发现红微藻P. purpureum在强光（138 μmol/m2/s）和f/2培养基条件下可显著提高胞外多糖（EPs）产量达3倍。EPs在B16-F0细胞模型中表现出优异的黑色素抑制活性（IC50≤50 μg/mL），在低浓度（≤12.5 μg/mL）下抑制率达80%，优于α-熊果苷。机制研究表明EPs通过抑制cAMP信号通路发挥作用。研究结果为藻类EPs在抗黑色素化妆品中的应用提供新依据。

　　

Asep Bayu | Siti Irma Rahmawati | Debora Christin Purbani | Diah Radini Noerdjito | Bustanussalam | Yatri Hapsari | Masteria Yunovilsa Putra

印度尼西亚西爪哇省茂物市Cibinong，Jakarta-Bogor公路KM 46号，国家研究与创新机构（BRIN）健康研究组织疫苗与药物研究中心

摘要

外多糖（EPs）是红藻属Porphyridium产生的代谢物之一，它们作为保护层支持细胞生长。尽管已知这些多糖具有多种生物活性，但关于从这些微藻中提取的EPs抑制黑色素生成的作用的信息仍然有限。在本研究中，海洋红藻Porphyridium purpureum在强光照（约138 μmol/m2/s）条件下培养时产生的EPs量是正常光照（约92 μmol/m2/s）条件下的3倍。f/2培养基中的营养耗尽也能使EPs产量增加2倍，然而，在前一种培养基中施加强光照并未显著影响EPs的产量。这些压力条件显著抑制了细胞生长以及光合色素（如藻胆蛋白PBPs）的含量，这从P. purpureum细胞的颜色变化中可以看出。在强光照条件下使用f/2培养基培养得到的EPs对B16-F0鼠黑色素瘤细胞系表现出相对良好的细胞毒性（IC50 ≤ 50 μg/mL）。这种多糖在低浓度（≤12.5 μg/mL）下能有效抑制黑色素（约80%）和酪氨酸酶活性（约13%），其效果优于α-阿鲁丁（即在100 μg/mL浓度下对黑色素和酪氨酸酶的抑制率分别为约100%和73%，p值≤α=5%）。EPs的抗黑色素生成活性与其在低浓度下抑制细胞内环腺苷单磷酸（cAMP）的能力有关。研究结果表明，来自红藻P. purpureum的EPs具有作为护肤品活性成分的潜力。

引言

如今，基于天然产品的皮肤治疗方法越来越受欢迎，这得益于消费者对产品安全性的关注以及“回归自然”的趋势。由于担心化学合成活性物质（如氢醌）在化妆品中的潜在不良影响及其在皮肤中的吸收不足，人们开始探索来自天然来源的替代性抗黑色素生成活性剂[1]。其中，来自微生物的细胞外多糖（EPs）是一种有吸引力的天然产品[3]。这些多糖因其低毒性[4]以及多种与化妆品相关的活性而受到关注，包括抗酪氨酸酶[5]、抗氧化[6]、抗菌[7]、抗炎[8][9]和免疫调节[10]作用。例如，来自真菌的EPs在抑制酪氨酸酶活性（IC50为16.5 μg/mL，50 μg/mL时抑制率为64%）、α-黑素细胞刺激激素（α-MSH）诱导的SK-MEL-5人类黑色素瘤细胞中的黑色素形成（50 μg/mL时抑制率为83%）以及去卵黄斑斑马鱼模型中的黑色素沉着方面表现出显著效果；与400 μg/mL和1.4 × 103 μg/mL浓度的 kojic酸相比，EPs具有相似的黑色素淡化效果（约25%的黑色素减少）[5]。 Porphyridium spp.是生物技术产业中重要的微藻之一，能够产生EPs[11]。这些红藻的生物量富含高价值化合物，包括碳水化合物（干重23–57%）、蛋白质（15–47%）、脂质（8–15%）和藻胆蛋白（PBPs）色素（1–8%）[12][13][14][15][16][17][18]。Porphyridium spp.的脂质中含有大量长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFAs），尤其是花生四烯酸（ARA）和二十碳五烯酸（EPA），分别占总脂肪酸的约5–40%和4–63%[11][17]。它们的PBPs主要由藻红蛋白（>70%）组成，其次是R-藻蓝蛋白（20%）和异藻蓝蛋白（10%）[18][19]，这凸显了它们作为天然红色色素来源的巨大潜力。尽管美国食品药品监督管理局（FDA）尚未正式将Porphyridium spp.的生物量认定为“普遍认为安全（GRAS）”[20][21][22]，但多项研究表明Porphyridium spp.适用于食品和/或饲料[10][23][24]。此外，Porphyridium spp.对培养条件变化具有很好的耐受性；例如，它们可以在淡水或海水（盐度12–32‰）、广泛的pH值（6.0–8.5）和温度（10–35°C）条件下生长[25][26][27]，因此大规模培养相对容易控制。 Porphyridium spp.产生的EPs成为有价值的化工产品，因为这些碳水化合物：(1) 大量分泌到培养基中[28]；(2) 可以用低分子醇轻松提取；(3) 具有水溶性[11]；(4) 稳定[29][30]且无毒[10][31][32]。这些多糖作为皮肤化妆品成分具有优异的作用，包括生物润滑剂[33]、羟基自由基清除剂[6]、免疫调节剂（诱导白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）[34]以及抗炎作用[35]。体外研究表明，来自P. cruentum的EPs在2500 μg/mL浓度下可抑制29%的弹性酶活性和97%的透明质酸酶活性[36]。此外，这些多糖还能增强皮肤保湿和弹性，并促进伤口愈合，如HaCaT表皮细胞中的aquaorin 3、filaggrin、involucrin和loricrin蛋白以及Hs68真皮细胞中的弹性蛋白和fibrillin-1蛋白的水平增加[3]。因此，许多公司正在利用Porphyridium spp.主要生产EPs[6][37][38][39]。此外，这些医用级多糖的市场价值也很高，浓度为10 g/L时价格可达150欧元/千克[40]。 培养基含有碳/氮源、缓冲系统和微量元素，这些成分对微藻的关键酶、光合色素和遗传物质至关重要，有助于支持它们的细胞生长、代谢和代谢物合成[38]。此外，光照提供了光子通量密度，这对于催化细胞代谢是必要的[41]。虽然已知这两个因素显著影响Porphyridium spp.的细胞生长和EPs的产生，但目前尚无关于从Porphyridium.提取的EPs抑制黑色素生成作用的信息。事实上，Nunes及其同事观察到在不同盐度下的Nutribloom?培养基中培养的P. purpureum分离出的EPs具有不同的免疫刺激活性[42]。当前的报告也显示了在ASW培养基中培养的P. purpureum分离出的EPs在清除羟基自由基方面的类似盐度效应[43]。 最近，Nilam等人报告称，使用B16F10鼠黑色素瘤细胞系和L-DOPA作为底物时，P. cruentum生物质的水提取物在100 μg/mL浓度下的抗黑色素生成和酪氨酸酶活性比kojic酸高出约1.2倍[1]。尽管提取物的化学成分尚不清楚，但结果表明红藻属Porphyridium含有可发挥抗黑色素生成作用的水溶性代谢物。据推测，主要的色素如藻红蛋白、β-胡萝卜素和玉米黄质可能是这些活性的原因，这基于这些色素与酪氨酸酶受体蛋白（PDB:5M8L）的强相互作用[1]。实际上，不应排除其他水溶性代谢物（如EPs）对这些活性的潜在贡献。 在本研究中，我们评估了从海洋红藻P. purpureum中提取的EPs的抗黑色素生成活性。通过使用由α-黑素细胞刺激激素（α-MSH）诱导的B16-F0鼠黑色素瘤细胞系的体外模型来评估这些活性。研究重点关注三个关键方面：1）黑色素抑制；2）在L-DOPA诱导下的酪氨酸酶抑制；3）细胞内环腺苷单磷酸（cAMP）抑制。为了了解EPs的产量和抗黑色素生成活性，我们在不同的培养基和光照强度下培养了P. purpureum。我们还讨论了这些因素与P. purpureum生长表现之间的相关性，包括生物量生产力、色素变化和细胞密度及外观。研究结果有望为将红藻属Porphyridium提取的EPs作为活性抗黑色素生成剂应用于皮肤化妆品提供新的见解。

材料与化学品

除非另有说明，所有试剂和化学品均为分析级，无需进一步预处理，购自Merck和Sigma-Aldrich。生长培养基“f/2”Guillard、Walne和IMK的制备方法如表S1所示。使用GF/C膜过滤器过滤天然海水，并通过高压灭菌器进行消毒后用作培养基的稀释剂。

微藻

P. purpureum是从印度尼西亚雅加达湾分离得到的，采用单细胞分离技术进行培养和纯化。

微藻细胞生长和生物量

显微镜图像显示了典型的球形、无鞭毛的红藻属Porphyridium细胞，呈棕红色（图S3A）。这些细胞的平均大小约为7 μm。这些形态特征代表了P. purpureum的典型特征[61][62][63][64]。使用国家生物技术信息中心（NCBI）网站上的基本局部比对搜索工具（BLAST）将部分18S序列与GenBank中的DNA序列进行了比较

结论

选择不同的培养基和光照条件会影响从海洋红藻P. purpureum中提取的EPs的生产力和抗黑色素生成活性。在Walne培养基中，强光照（约138 μmol/m2/s）条件下培养的EPs产量高于正常光照（约92 μmol/m2/s）条件下的培养。f/2培养基中的营养耗尽也能增加EPs的产量

CRediT作者贡献声明

Asep Bayu：写作——审稿与编辑，原始草稿撰写，概念构思。 Siti Irma Rahmawati：写作——审稿与编辑，方法学研究，资金获取，数据分析。 Debora Christin Purbani：写作——审稿与编辑，方法学研究，数据分析。 Diah Radini Noerdjito：写作——审稿与编辑，方法学研究，数据分析。 Bustanussalam：写作——审稿与编辑，方法学研究，数据分析。 Yatri Hapsari：

人类/动物权利声明

本研究不存在利益冲突、知情同意或涉及人类或动物权利的问题。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家研究与创新机构（BRIN）健康研究组织（编号：61/III.9/HK/2025）在2025财年“疫苗与药物计划”下的支持。作者感谢Euis Filailla和Yudhi Dwi Kurniawan在单糖分析方面提供的财务和技术支持。