《Analytica Chimica Acta》：Unidirectional-flow assay strip fabricated via an integrated process for multiplex detection of inflammatory biomarkers
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血清淀粉样蛋白A和C-反应蛋白快速检测条带设计及性能验证。采用集成工艺在带倒钩结构（BAS）的微流控膜上同步制造检测组件，消除传统试纸微孔阻力导致的检测延迟和溶液残留问题，同时无需塑料卡式座固定。经验证，新条带在7分钟内完成双重标志物检测，SAA和CRP检测限分别为0.254 μg/mL和0.285 μg/mL，临床样本灵敏度93.8%，特异性90.0%，溶液利用率达35.7%。
吴天宇|肖子涵|黄希源|李浩楠|叶培荣|肖伟|程振|刘一仁|周建华
广东省 sensing 技术与生物医学仪器重点实验室，中山大学深圳校区生物医学工程学院，中国广东省深圳市 518107
摘要
侧向流动分析（LFA）是一种低成本、快速的免疫测定方法，用于检测炎症生物标志物并评估感染严重程度。传统的 LFA 试纸由多层多孔组件组成，如结合垫和硝酸纤维素（NC）膜。然而，这些组件中的微孔会对样品溶液的流动产生阻力，从而降低流速并延长检测时间。此外，LFA 试纸通常装在试剂盒中。当为了降低成本而移除试剂盒时，试纸组件可能会在外部干扰下松动。组件的松动会破坏流动路径的连续性，导致溶液残留，从而降低检测的稳健性和灵敏度。为了克服这些限制，我们引入了一种集成工艺，在带倒钩箭头结构（BAS）膜上制造所有组件，开发出单向流动分析试纸（UFA 试纸）。集成组件（例如结合脊和测试脊）紧密附着在膜上，从而提供直线的流动路径并保持流动连续性。此外，UFA 试纸的溶液利用率达到了 35.7%，支持使用少量样本进行检测。利用 UFA 试纸，我们开发了一种快速、灵敏的免疫测定方法，可在 7 分钟内同时检测血清淀粉样蛋白 A（SAA）和 C-反应蛋白（CRP），检测限分别为 0.254 μg/mL 和 0.285 μg/mL。在检测 26 份临床样本时，该方法的灵敏度为 93.8%（15/16），特异性为 90.0%（9/10）。因此，UFA 试纸在快速、低成本的免疫测定方面表现出优异的性能，为炎症生物标志物的检测提供了一个有前景的平台。
引言
免疫测定是一种基于特定抗原-抗体相互作用来检测目标生物标志物的分析方法[1]，[2]，[3]，已广泛应用于临床诊断、公共卫生监测和环境分析[4]，[5]，[6]，[7]，[8]，[9]。在传染性疾病的临床诊断中，免疫测定可以通过检测血清淀粉样蛋白 A（SAA）和 C-反应蛋白（CRP）等炎症生物标志物[14]，[15]，帮助评估感染严重程度并区分不同类型的感染[10]，[11]，[12]，[13]。先前的研究表明，急性传染病（如败血症和心肌炎）可能迅速发展，如果不能及时诊断和治疗，可能会导致严重的并发症甚至死亡[16]，[17]，[18]，[19]，[20]。因此，迫切需要开发针对炎症生物标志物的快速免疫测定方法，以实现及时诊断并提高急性传染病患者的生存率。
常用的快速免疫测定方法包括免疫浊度法、化学发光法和侧向流动分析（LFA）[10]，[15]，[21]，[22]，[23]，[24]，[25]，[26]，[27]。免疫浊度法以其简单性和易实施性著称，但在检测灵敏度方面有限[10]，[15]，[21]。化学发光法因其高灵敏度而受到广泛关注，但由于需要昂贵的试剂和专用仪器，其应用受到成本限制[22]，[23]，[24]。相比之下，LFA 是一种快速、低成本且易于使用的免疫测定方法，可在 15-20 分钟内提供结果，适用于家庭检测和紧急护理[25]，[26]，[27]。传统的 LFA 试纸是通过依次层压多孔组件（包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素（NC）膜和吸收垫）并固定在塑料试剂盒中制成的[28]。这些试纸在过去几十年中得到了广泛应用，并在临床诊断中取得了显著成功。然而，LFA 试纸存在一些限制，影响其检测性能。首先，传统 LFA 试纸依赖 NC 膜中的微孔来驱动样品流动，这对膜的性能提出了矛盾的要求[29]，[30]，[31]，[32]。具体来说，较小的微孔提供了更大的抗体固定表面积，从而增强了检测信号；然而，它们也增加了样品溶液流动的阻力，延长了检测时间。其次，传统 LFA 试纸依赖塑料试剂盒来保护层压组件免受外部干扰[33]，[34]，[35]。当为了降低成本而移除塑料试剂盒时，LFA 试纸上的组件在外部干扰下容易松动和弯曲（图 S1）。组件的松动会破坏流动路径的连续性，导致流速不一致，从而影响检测的稳健性。同时，试纸的弯曲可能会压缩 NC 膜中的微孔，导致抗原、探针标记的抗体及其复合物滞留[36]，[37]，从而降低检测灵敏度。因此，一种不需要依赖微孔驱动样品流动或塑料试剂盒保护的、能够实现样品溶液稳定连续流动的试纸是非常理想的，因为它可以解决传统 LFA 试纸在检测时间、灵敏度和稳健性方面的限制。
为了克服这些限制，我们开发了一种快速、灵敏的单向流动分析试纸（UFA 试纸），通过我们在之前报道的带倒钩箭头结构（BAS）膜上的集成工艺制造了功能组件（图 1）。BAS 膜实现了单向、快速的液体传输，残留物少，从而减少了检测时间并提高了检测灵敏度[37]。在这个 BAS 膜上，我们使用简单的模具同时制造了结合脊、测试脊和吸收垫等组件。这些组件紧密附着在 BAS 膜上，从而在没有塑料试剂盒保护的情况下防止松动，并为样品溶液提供了直线的流动路径。通过这种集成工艺制造的 UFA 试纸表现出“快-慢-快”的流动模式。此外，UFA 试纸的溶液利用率提高了 35.7%，大约是传统 LFA 试纸的 2.3 倍。基于 UFA 试纸，我们开发了一种快速的多重免疫测定方法，用于检测 SAA 和 CRP。首先，将含有 SAA 和 CRP 的样品溶液加载到试纸上，使其流过结合脊，在那里形成 SAA-金纳米颗粒（GNP）标记的抗体复合物和 CRP-GNP 标记的抗体复合物。然后，这些复合物流到测试脊上，并被相应的固定抗体捕获，产生检测信号。这样，UFA 试纸上的免疫测定仅需 7 分钟即可同时检测 SAA 和 CRP，检测限分别为 0.254 μg/mL 和 0.285 μg/mL，并且在模拟样本中显示出最小的交叉反应性。此外，在检测 26 份疑似传染性疾病的血清样本时，该方法的灵敏度为 93.8%（15/16），特异性为 90.0%（9/10）。这些结果表明，UFA 试纸可以实现快速、低成本和低样本量的免疫测定，为炎症生物标志物的检测提供了一个有前景的解决方案。
试剂和材料
醋酸纤维素（CA，C804766，Mw = 60000）从 Macklin（上海，中国）获得；乙酸甲酯（E110414，99.0%）和丙酮（编号 2018110108，99.5%）从广州化学试剂厂（广州，中国）购买。N,N-二甲基甲酰胺（DMF，D112003，99.9%）从 Aladdin（上海，中国）购买。硝酸纤维素（NC）铸膜液从 Ealon Membrane Industry Co., Ltd.（汕头，中国）获得。复合模具用的金属板和弹性泡沫，以及 PMMA
UFA 试纸基底的集成工艺和表征
我们开发了一种集成工艺来制造 UFA 试纸的基底（图 2）。首先，我们通过依次进行激光雕刻、PDMS 成型和热压花来制备 BAS 膜。BAS 膜具有平行且等间距的微通道（图 S2A）。这些微通道由端到端的带倒钩箭头形状的凹槽组成，称为“结构单元”（图 S2A-ii）。每个结构单元由轴对称的长弧和短弧侧壁包围
结论
总结来说，我们介绍了一种在单向流动 BAS 膜上制造多个组件的集成工艺。基于该工艺，我们开发了一种用于快速多重免疫测定的 UFA 试纸。这些组件紧密附着在 BAS 膜上，为样品溶液提供了直线的流动路径，防止在外部干扰下松动并减少样品溶液的残留。
CRediT 作者贡献声明
周建华：概念化、正式分析、资金获取、研究、方法学。肖子涵：概念化、研究、正式分析、方法学。吴天宇：概念化、正式分析、研究、方法学。刘一仁：方法学、研究。程振：研究。李浩楠：研究。黄希源：研究。肖伟：研究。叶培荣：研究
数据可用性
支持本研究结果的数据包含在手稿和补充信息文件中。原始数据可根据请求从相应作者处获得。
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号 22574178, 22174167）、国家重点研发计划（2021YFA1400804, 2023YFF0714400）、深圳科技计划（授权号 JCYJ20220818102014028, JCYJ20230807111120043, JCYJ20250604174659001）、广州市科技研究计划（2023A03J0988）以及广东省 sensing 技术与生物医学仪器重点实验室基金会（编号 2020B1212060077）的支持。
