《Analytica Chimica Acta》：An Automated and Portable Magnetically-Controlled Microfluidic Chip Platform with Dual Detection Modes for Sensitive AFP Quantification
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本研究开发了一种便携式磁控微流控芯片，结合算法驱动的步进电机实现自动化检测，化学发光模式下AFP检测极限达3.66 ng/mL，显著提升早期肝癌筛查的灵敏度和效率。
张鹏|张晨琪|贾敏|潘永东|吴硕|程建新|宋璐杰|明子珍
中国农业与林业大学农业人工智能研究中心，中国福州350000
摘要
肝细胞癌（HCC）的早期诊断依赖于快速、灵敏且可靠的免疫测定方法；然而，传统的ELISA技术往往受到复杂手动操作、较长的测定时间以及灵敏度不足的限制，这严重阻碍了在疾病早期阶段检测低丰度生物标志物的能力。相比之下，微流控技术减少了试剂消耗，实现了对反应的精确时空控制，并为开发适用于便携式现场筛查应用的磁引导多步骤免疫测定系统提供了多功能平台。在此，我们开发了一种具有磁控功能的便携式微流控装置，其中算法驱动的步进电机使微流控芯片在固定的磁场阵列上移动，从而产生可调的局部磁场。该设计将数字算法控制、机械驱动、微流控芯片和功能化磁珠集成到一个无缝的控制链中，实现了无需人工干预的磁珠捕获、运输以及一系列免疫反应步骤的完全自动化。以甲胎蛋白（AFP）作为模型生物标志物，该装置在比色测量模式下达到了119.43 ng/mL的检测限，在化学发光模式下达到了3.66 ng/mL的检测限。这些结果证明了在紧凑型即时检测（POCT）格式中实现自动化多步骤免疫测定的可行性，具有在早期疾病诊断中进行快速灵敏生物标志物筛查的潜在应用价值。重要的是，该平台通过显著缩短测定时间和降低操作复杂性，大大弥补了HCC筛查中的关键缺陷，从而提高了资源有限环境下的可及性。通过在最佳治疗效果的临界点促进早期检测，它有望提高患者预后、延长生存期，并在更广泛的人群中普及先进的诊断能力。
引言
肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见恶性肿瘤，也是癌症死亡的第三大原因[1]。其在亚洲和非洲的发病率尤其高[2]。2020年，全球约有90万例新发肝细胞癌病例和超过83万例死亡病例[3]。由于早期疾病通常没有症状且进展迅速，50%至60%的患者在晚期才被诊断出来[4]。许多人错过了接受根治性手术的机会，五年生存率低于30%[5]。这些事实表明迫切需要有效的早期诊断方法[6]。血清生物标志物筛查对于肝癌的早期诊断至关重要，其中甲胎蛋白（AFP）仍然是肝细胞癌的传统生物标志物[7]。AFP在HCC中通常升高，并与疾病阶段、治疗反应和预后相关[8]、[9]。糖型AFP-L3与肿瘤侵袭性相关，将AFP与AFP-L3结合使用可将诊断特异性提高到70%以上[10]。
传统的生物标志物测定方法存在多种局限性，限制了它们对不同临床需求的适应性[11]、[12]。酶联免疫吸附测定（ELISA）作为传统的临床方法，操作简单，但需要多次孵育（1-2小时）和洗涤步骤，导致总测定时间长达3-4小时，并且对早期HCC患者中微妙的AFP变化检测灵敏度不足[13]、[14]。放射免疫测定（RIA）虽然灵敏度较高，但涉及放射性衰变风险，需要严格的防护措施，并且依赖昂贵的仪器设备，从而限制了其在初级医疗保健环境中的应用[15]、[16]。侧向流动免疫测定（例如胶体金试纸条）提供了便携性和便利性；然而，单独使用AFP对于早期HCC的检测灵敏度不足，常常无法识别早期病例[17]、[18]。化学发光免疫测定（CLIA）对AFP和其他生物标志物具有出色的分析灵敏度，但依赖于大型自动化分析仪，需要大量样本量，并且成本高昂，使得现场检测不切实际[19]、[20]。因此，开发高灵敏度、低成本的即时检测（POCT）技术已成为解决早期HCC诊断现有挑战的关键策略。
微流控免疫传感器有助于克服传统生物标志物测定的缺点。通过微型化通道和集成反应单元，这些平台使用更少的样本，加快反应速度，并支持自动化[21]、[22]、[23]。例如，朱等人开发了一种EWOD DMF微流控芯片，利用电极阵列操控液滴，在30分钟内同时测量AFP（检测限：0.24 ng/mL）和DCP（检测限：1.89 ng/mL）[24]。磁控微流控技术可以在小腔室内自动化处理磁珠，将分离和检测结合在一个步骤中[25]。这种设置避免了手动离心，减少了试剂使用，并减少了错误[26]、[27]。例如，吴等人报道了一种磁控微流控芯片，通过磁分离捕获复合微粒，并通过测量微通道内颗粒的积累长度来实现AFP的灵敏快速检测（检测限：15.8 ng/mL）[28]。
将磁控微流控芯片与自动化磁控设备集成在一起，通过精确的磁场调节进一步提高了测定的自动化程度和分析性能。郭等人报道了一种磁驱动的微流控平台，利用永磁体操纵磁珠进行顺序样本捕获、纯化和释放，从而实现了细胞外囊泡的自动化富集和高效分离，进一步提高了基于细胞外囊泡的肿瘤相关生物标志物的检测灵敏度[29]。然而，许多此类系统仍然存在结构复杂和便携性有限的缺点，其操作可能依赖于外部仪器设备，从而限制了其在即时检测环境中的应用[30]。同样，张等人开发了一种96通道多腔室磁流控芯片用于病原体检测，能够快速进行芯片内裂解、核酸提取和扩增，达到每反应10个拷贝的检测限[31]。该系统实现了完全自动化分析，并在一定程度上缩小了设备的整体体积；然而，便携性方面仍存在局限性。
尽管最近取得了进展，现有系统仍然占用较大空间，限制了其实际应用。为了解决这个问题，我们开发了一种基于磁控微流控芯片的便携式POCT设备。该系统集成了磁控阵列模块、芯片固定模块和算法控制模块，在设计层面实现了小型化和便携性的提升。在该设备中，芯片内的免疫测定通过完全集成的“捕获-洗涤-检测”工作流程进行，消除了多次离心和洗涤步骤，显著缩短了测定时间。此外，通过结合比色和化学发光检测模式，该平台能够在大约1小时内对HCC生物标志物进行定量分析。这一创新不仅提高了检测效率和灵敏度，还为HCC的早期诊断和临床应用提供了实用的方法。
材料与试剂
生物素标记的甲胎蛋白（AFP）抗体、生物素标记的AFP单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）结合的生物素、河豚毒素（TTX）、去γ-羧基凝血酶原（DCP）和增强型ECL化学发光试剂盒均购自北京Bioss生物技术有限公司。凝集素（WGA）购自上海源叶生物技术有限公司。HRP-AFP抗体的结合试剂购自北京中生物技术有限公司。链霉亲和素包被的磁珠（1
便携式免疫测定装置的开发
在本研究中，通过集成多个核心模块，开发了一种基于磁控微流控芯片的便携式免疫测定装置（图1A），该装置具有体积小巧、操作简便和适应多种测定场景的优点。所使用的微流控芯片具有双层结构，由PDMS层和玻璃基底上的微通道组成（图1B和图S1）。
磁控系统可以驱动电机向前和
CRediT作者贡献声明
宋璐杰：资金获取。明子珍：资源提供、项目管理。吴硕：资源提供。程建新：资源提供。贾敏：项目管理。潘永东：资源提供。张晨琪：撰写——初稿、撰写——审阅与编辑、数据管理、方法学研究、实验设计。张鹏：撰写——初稿、撰写——审阅与编辑、实验设计
资助
本研究得到了国家重点研发计划（项目编号：2023YFA0915200、2023YFA0915204）；中国科学院的设备研发项目（项目编号：PTYQ2024YZ0010、PTYQ2024BJ0007）；上海市科学技术委员会的项目（项目编号：XTCX-KJ-2024-038）；以及香福实验室研究的支持
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们衷心感谢非作者合作者的宝贵贡献，使这项研究成为可能。
