一种单管RAA-PfAgo系统，用于快速、灵敏地检测猴痘病毒

《Analytica Chimica Acta》：A one-tube RAA-PfAgo system for rapid and sensitive detection of Monkeypox virus

本研究开发了一种基于RAA与PfAgo的一管式检测方法，利用石蜡屏障实现同步扩增与特异性切割，可在60分钟内快速、高灵敏度区分MPXV与其他正痘病毒，适用于现场流行病学监测。

　　

赵娜|张学健|甘玉璐|李琳|王云敏|徐彤|潘尧|顾奎|赵宇

中国重庆市万州区疾病预防控制中心

摘要

猴痘病毒（MPXV）属于正痘病毒属，需要快速、灵敏的诊断策略来支持有效的疫情预防和控制。在这项研究中，我们通过将重组酶辅助扩增（RAA）技术与Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）结合，建立了一种单管、快速、高特异性和超灵敏的MPXV检测方法。利用石蜡作为物理屏障，在同一管中实现RAA扩增和PfAgo切割的时空分离。我们系统地优化了关键参数，包括RAA扩增条件、引导DNA（gDNA）筛选以及PfAgo和gDNA的浓度。该方法针对MPXV特有的F3L基因，能够特异性地区分MPXV与其他正痘病毒，并实现单拷贝水平的检测。此外，还通过临床和环境样本验证了其适用性。由于采用单管、石蜡分离的形式，操作简单，反应时间短（60分钟内完成），且不需要大型实验室设备，这种单管RAA-PfAgo检测方法为前线监测和控制提供了可靠且可现场部署的诊断工具。

引言

猴痘是一种由猴痘病毒（MPXV）引起的动物源性急性传染病，属于痘病毒科正痘病毒属[1]。该病毒于1958年首次在丹麦哥本哈根的一个研究机构中从患有类似痘病的实验猴身上分离出来[2]。20世纪70年代，非洲多个国家报告了零星的人类病例[3]，2003年美国记录了首例非非洲地区的人类感染病例[4]。自2022年5月以来，MPXV表现出前所未有的跨洲和跨区域传播模式，迅速发展成为重大的国际公共卫生紧急事件[5]。MPXV是一种双链DNA病毒，基因组大小约为200 kb，通常分为两个主要分支：西非分支和中非分支。其中，中非分支的致病性更强，报告的病例死亡率为10.6%。在临床实践中，猴痘的早期症状与水痘和其他几种发热性出疹性疾病相似，容易导致误诊。此外，MPXV与其他正痘病毒在基因组上具有高度同源性，这降低了传统血清学检测方法的区分能力，使得准确鉴定变得复杂[6],[7]。因此，开发快速、精确的诊断技术对于早期发现猴痘疫情、及时确定感染源和有效切断传播链至关重要。

目前，猴痘病毒的实验室检测主要依赖于核酸扩增技术，实时定量聚合酶链反应（qPCR）是金标准[8]。尽管qPCR具有出色的灵敏度和特异性，但其对昂贵设备、专业人员的依赖以及2到3小时的反应时间限制了其在初级医疗设施、海关检疫和现场监测等快速诊断场景中的应用。等温扩增技术作为qPCR的补充手段，能够实现快速扩增并大幅降低设备要求，成为即时诊断领域的研究热点[9],[10],[11],[12]。其中，重组酶辅助扩增（RAA）在快速病原体鉴定方面表现出巨大潜力，包括非洲猪瘟病毒（ASFV）的检测[13]，这得益于其高扩增效率和对抗抑制剂的强耐受性[13]。然而，RAA的特异性依赖于引物-靶标杂交，容易发生非特异性扩增。由于正痘病毒之间的基因组高度同源性，这一限制可能导致假阳性结果，限制了传统RAA检测方法在MPXV检测中的准确性。

可编程核酸酶技术的进步为克服这些特异性挑战提供了有希望的策略。Argonaute（Ago）核酸酶是一种能够精确识别和切割靶标的核酸引导内切酶，通过引导DNA（gDNA）或RNA来定向序列特异性活性[14],[15],[16]。其中，Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）具有几个显著优势：（1）PfAgo使用DNA引导序列，不需要protospacer相邻基序（PAM），从而在靶标设计上具有更大的灵活性[17]；（2）其最佳反应温度为95 °C，可最小化非特异性相互作用并显著减少假阳性信号；（3）其gDNA合成成本低廉，且储存稳定性优于CRISPR/Cas系统。先前的研究已成功将PfAgo与PCR、RPA、RAA和LAMP结合，建立了针对多种病原体的高特异性检测平台[18],[19],[20],[21],[22]。然而，目前尚未有针对MPXV检测的单管RAA-PfAgo方法报道。

在本研究中，首先建立并优化了传统的两步RAA-PfAgo检测方法，随后开发了利用石蜡分离的单管RAA-PfAgo平台，其中RAA扩增和PfAgo切割通过石蜡屏障实现物理分离。利用该系统，我们建立了一种快速（<60分钟）、高灵敏度和高特异性的RAA-PfAgo检测方法，并通过临床样本进一步验证了其诊断性能。本研究旨在提供一种可靠的工具，用于猴痘疫情的早期检测和快速控制，同时丰富新发传染病的分子诊断工具箱。

部分摘录

质粒和样本

< />PfAgo表达质粒以及标准质粒pUC57-MPXV-F3L、pUC57-CPXV、pUC57-VACV和pUC57-VARV由上海Sangon Biotech公司合成。详细序列信息见表S1。人类免疫缺陷病毒（HIV）阳性核酸样本由我们的机构提供并存档。共有22份疑似猴痘病毒阳性样本存放在我们的机构中以供后续检测。这些样本包括皮肤拭子和咽喉拭子

PfAgo蛋白的表达和纯化结果

重组pET28a-PfAgo质粒被转化至E. coli Rosetta感受态细胞中。经过IPTG诱导、Ni–NTA亲和纯化和超滤浓缩后，成功获得了高纯度的PfAgo蛋白（约90 kDa）。纯化后的蛋白分装并储存在-80 °C下以备后续实验使用。（图S1）。

RAA反应的优化结果

使用pUC57-MPXV-F3L标准质粒（10⁵拷贝/μL）和多种引物组合进行了RAA扩增

讨论

猴痘的全球传播威胁着公共卫生，因此需要快速准确的诊断方法[24]。尽管qPCR具有高灵敏度和特异性，但它依赖于昂贵设备、专业人员和严格控制的实验室条件，以及2到3小时的反应时间，这限制了其在快速诊断场景中的应用，如初级医疗设施、海关检疫和现场监测。等温扩增技术作为qPCR的补充手段，能够实现快速扩增并大幅降低设备要求，成为即时诊断领域的研究重点[9],[10],[11],[12]。其中，重组酶辅助扩增（RAA）因具有高扩增效率和对抗抑制剂的强耐受性，在快速病原体鉴定方面展现出巨大潜力[13]。然而，RAA的特异性取决于引物-靶标杂交，容易发生非特异性扩增。鉴于正痘病毒之间的基因组高度同源性，这一限制可能导致假阳性结果，限制了传统RAA检测方法在MPXV检测中的准确性。

可编程核酸酶技术的进步为克服这些特异性挑战提供了有希望的策略。Argonaute（Ago）核酸酶是一种能够精确识别和切割靶标的核酸引导内切酶，通过引导DNA（gDNA）或RNA来定向序列特异性活性[14],[15],[16]。其中，Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）具有以下优势：（1）PfAgo使用DNA引导序列，不需要protospacer相邻基序（PAM），从而在靶标设计上具有更大灵活性[17]；（2）其最佳反应温度为95 °C，可最小化非特异性相互作用并显著减少假阳性信号；（3）其gDNA合成成本低廉，且储存稳定性优于CRISPR/Cas系统。先前的研究已将PfAgo与PCR、RPA、RAA和LAMP结合，建立了针对多种病原体的高特异性检测平台[18],[19],[20],[21],[22]。然而，迄今为止，尚未有针对MPXV检测的单管RAA-PfAgo方法报道。

在本研究中，首先建立并优化了传统的两步RAA-PfAgo检测方法，随后开发了利用石蜡分离的单管RAA-PfAgo平台，其中RAA扩增和PfAgo切割通过石蜡屏障实现物理分离。利用该系统，我们建立了一种快速（<60分钟）、高灵敏度和高特异性的RAA-PfAgo检测方法。诊断性能通过临床样本进一步验证。本研究旨在提供一种可靠的工具，用于猴痘疫情的早期检测和快速控制，同时丰富新发传染病的分子诊断工具箱。

作者贡献声明

甘玉璐：撰写——原始稿件、方法学部分。李琳：软件开发、数据分析。赵娜：撰写——原始稿件、方法学部分。张学健：撰写——原始稿件、方法学部分。赵宇：撰写——原始稿件、项目管理、方法学、资金获取。潘尧：方法学部分。顾奎：撰写——原始稿件、资金获取。王云敏：方法学部分。徐彤：撰写——审稿与编辑

数据获取

本研究中的数据可向相应作者索取。

伦理批准

本研究遵循赫尔辛基宣言进行。涉及人类样本的研究得到了万州区疾病预防控制中心伦理委员会的批准（批准编号WZCDC-HEC-003）。委员会确认受试者的权利和利益得到充分保护，且研究符合伦理要求。鉴于本研究是对常规临床检测中剩余样本的回顾性分析，且未涉及新的伦理问题

利益冲突

作者声明没有已知的可能影响本文工作的竞争利益。

资助

本研究得到了重庆市公共卫生重点项目、重庆市自然科学基金（CSTB2025NSCQ-GPX0949）、重庆市万州区科技-健康联合医学研究计划（wzwjw-kw2024007）以及重庆市疾病预防控制局研究项目（2026JKXM001）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的可能影响本文工作的竞争财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢中国重庆市万州区疾病预防控制中心的王毅、韩金志和郑金峰在猴痘样本收集和DNA提取方面的协助。