用于高通量环境质谱分析的3D打印靶板，适用于纳升量级生物流体

《Anaerobe》：3D-Printed Target Plates for High-Throughput Ambient Mass Spectrometry Analysis of Nanoliter Biofluids

本研究首次利用3D打印技术开发定制目标板，实现纳米级生物液滴阵列的高效制备，显著提升DESI-MS检测临床肾功标志物（肌酐、尿素氮、尿酸）的灵敏度（检测限0.1-0.8 μmol/L）和分析速度（单样本仅需6.5秒），并通过汞暴露小鼠血清和尿液样本验证了方法的可靠性和实用性，为生物标志物高通量检测提供了新策略。

　　

刘昌|赵圆阳|张俊鹏|王瑞霞|胡立刚|徐明

中国科学院生态环境科学研究院环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京 100085，中国

摘要

背景

环境质谱技术，如解吸电喷雾离子化质谱（DESI-MS），为生物样本中的生物标志物分析提供了一个有前景的高通量平台。然而，其在生物流体中临床生物标志物分析的应用仍受到样品制备复杂性、定量准确性和分析重复性之间固有权衡的限制。

结果

在本研究中，我们首次报道了一种使用三维（3D）打印技术定制设计的靶板的制造方法，该靶板可用于高通量DESI-MS分析的纳米液滴阵列制备。一个2毫米×2毫米的正方形靶板可以容纳188个80纳升的生物流体液滴，从而实现生物流体中生物标志物的高通量筛选。对于三种具有临床意义的肾功能生物标志物——肌酐（Cr）、尿素氮（UN）和尿酸（UA），DESI-MS的检测限（LODs）范围为0.1至0.8微摩尔/升，比临床实验室常用的常规比色酶法提高了大约十倍。更重要的是，每个单独的尿液或血清样本的DESI-MS分析仅需6.5秒，显著短于酶法通常所需的几分钟时间。最后，通过量化暴露于无机汞（Hg(II)）的小鼠血清和尿液样本中的Cr、UN和UA，证明了所开发方法的可行性、可靠性和重复性，这证明了其概念验证的有效性。

意义

我们预计，这种强大的生物流体分析策略将推动临床医学、生物学和环境健康科学领域中的生物标志物发现和机制研究。

引言

生物流体（如血液和尿液）在临床诊断中得到广泛使用，提供了一种无创的评估个体健康状况的方法。¹例如，血液中三种关键临床生物标志物——尿素氮（UN）、肌酐（Cr）和尿酸（UA）的水平，可以为评估肾脏排泄功能提供具有临床意义的信息。²目前，酶法比色测定是临床实验室中检测这些生物标志物的主要分析方法。^{3, 4}尽管这些测定方法对各自的目标具有高特异性，但其定量准确性和分析灵敏度常常受到样品相关干扰的影响，包括浑浊度、内源性色素和pH值变化，从而增加了测量不确定性。^{5, 6}

环境质谱技术由Cooks等人于2004年首次引入，对于开放空气中的多种样本的高通量分析具有巨大潜力。⁷与常规液相色谱-质谱（LC-MS）技术不同，DESI-MS每次样本的总分析时间通常不到几秒，从而支持对生物样本中目标分析物的快速、高通量筛选。⁸尽管DESI-MS已广泛用于无需或只需少量样品制备的生物组织的无标记分子成像，但血清和尿液等生物流体通常需要先沉积在纸质或薄膜基底上并固定。^{9, 10, 11, 12}例如，微升量的血液可以直接点在卡片上生成几毫米直径的干血斑（DBS）以进行DESI-MS分析。^{11, 12}然而，已报道的协议存在一些局限性：（i）分析重复性受到不均匀分析物沉积的影响，通常称为“咖啡环”或“Marangoni”效应，这会导致信号强度的变化；（ii）该方法的应用主要限于特定生物流体，例如用于血液中目标分析物的定量测定的DBS采样；（iii）通量仍然不够理想，因为定性或定量分析仍需要微升级别的生物流体体积。

三维（3D）打印技术的快速发展使得能够以成本效益高且快速的方式制造出符合质谱分析特定需求的定制结构。值得注意的是，3D打印技术已被用于制造基质辅助激光解吸/离子化质谱（MALDI）的靶板，这些靶板具有精确控制的尺寸和点几何形状，从而简化了样品制备并提高了检测灵敏度。^{13, 14, 15, 16}在MALDI-MS中，分析通常涉及将稀释的分析物溶液与高浓度的基质溶液共同沉积在靶板上，生成适合真空MALDI-MS分析的微尺度晶体斑点。相比之下，无基质样品通常在常压下通过DESI-MS进行分析，几乎不需要样品制备。¹⁷据我们所知，尚未有使用3D打印技术制造DESI-MS靶板的研究，特别是用于生物流体的高通量分析。

在本研究中，首次开发了一种专门为高通量DESI-MS分析纳米升体积生物流体而设计的3D打印靶板（图1）。首先，系统优化了靶板的几何参数，以确保生物流体液滴阵列的可重复性和稳健性制备。其次，评估了其分析性能，包括检测三种临床生物标志物UN、Cr和UA的能力。最后，使用这种3D打印靶板，对暴露于无机汞（Hg(II)）的小鼠血清和尿液中的UN、Cr和UA进行了高通量DESI-MS分析，展示了其在实际临床生物标志物检测中的强大潜力。

章节摘录

化学品

肌酐（Cr，98%）购自上海源业生物科技有限公司（中国）。尿素（UN，99%）购自北京博瑞金科技有限公司（中国）。尿酸（UA，99%）、乙腈（99.9%）、甲醇（99.9%）和异丙醇（99.5%）购自上海麦克林生化有限公司（中国）。明胶（Wako 1级）购自富士胶片和和光纯药工业有限公司（日本）。氯化汞（HgCl₂，99.7%）购自中国化工进出口总公司。肌酐测定试剂盒

使用3D打印靶板制备纳米液滴阵列

在已发表的文献中，生物流体（例如血液或尿液）的环境质谱分析通常涉及将微升体积的样品沉积在纸张或聚合物薄膜等基底上，形成几毫米直径的斑点（表S1）。后续分析需要在几秒内扫描这些基底支持的样品。为了提高分析通量，一个可行的策略是将样品体积从微升减少到纳升。

结论

本研究开发了一种3D打印靶板，用于方便制备纳米液滴阵列。结合DESI-MS，该平台可以直接在纳升级别的生物流体（如血清和尿液）中进行临床生物标志物的高通量分析，而无需复杂的样品预处理。与传统比色酶法相比，该方法显著减少了样品体积需求和分析时间，同时提高了分析灵敏度。

CRediT作者贡献声明

赵圆阳：研究。张俊鹏：研究。王瑞霞：研究。胡立刚：撰写 – 审稿与编辑。徐明：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、资源管理、项目管理、方法学、资金获取、概念化。刘昌：初稿撰写、可视化、验证、软件使用、方法学、研究、正式分析、数据管理

未引用参考文献

17..

数据可用性

补充材料可在https://doi.org/xxx获取。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家关键研发计划（2022YFC3701300）、中国科学院青年创新促进协会（2019042）以及环境化学与生态毒理学国家重点实验室提升原始创新能力平台项目的支持。