《Analytica Chimica Acta》：A smartphone-integrated portable fluorescent biosensor for on-site detection of antibiotics
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开发了一种基于假异氰酸（PIC）荧光染料的通用便携式aptasensor，可快速检测万古霉素、氧四环素和卡那霉素，检测限分别为88.3、187.0和316.3 nM。通过3D打印便携设备和智能手机读数系统，实现了现场快速定量检测，并系统研究了PIC-aptamer-抗生素的相互作用机制，为低成本、高灵敏检测平台设计提供新思路。
Bian Jiawei | Cai Shixin | Chen Xin | Wang Xiaoli | Zhang Yuting | Zhou Nandi
江南大学生物技术学院及教育部碳水化合物化学与生物技术重点实验室，中国无锡214122
摘要
背景
抗生素残留的广泛存在对公共卫生、食品安全和环境安全构成了重大风险，因此需要快速的现场监测工具。而传统的抗生素检测方法通常依赖于复杂的仪器设备，这限制了它们的现场应用性。本研究开发了一种多功能便携式适配体传感器，利用伪异氰胺（PIC）荧光染料来检测多种抗生素。该传感机制基于目标物质诱导染料从适配体-染料复合物中脱离，从而导致荧光淬灭。本文探讨了PIC、适配体和抗生素之间的相互作用。
结果
使用微孔板读数器优化了该生物传感系统，能够检测万古霉素（VAN）、土霉素（OTC）和卡那霉素（KAN），其检测限分别为88.3 nM、187.0 nM和316.3 nM。随后，将该检测方法集成到一种定制的3D打印设备中，并配备了基于智能手机的读数功能，实现了现场定量检测，其性能与基于微孔板读数器的检测方法相当。该生物传感器在添加了抗生素的湖水和牛奶样本中表现出高度特异性和准确性，回收率在93.24%到106.54%之间。同时，本文初步讨论了使用不同目标物质/适配体的荧光生物传感器性能差异的原因。
意义
这种无标记检测方法结合合理设计的便携设备，为资源有限的环境中快速监测抗生素残留提供了一种经济高效、无需仪器且用户友好的平台。此外，对传感机制的探讨有助于未来荧光适配体传感器的设计。
引言
抗生素的广泛使用在疾病预防和水产养殖发展方面发挥了重要作用。然而，抗生素的滥用及其残留物的积累已成为全球性的公共卫生和环境挑战[1]。通过食物链进入人体的抗生素残留物不仅可能产生直接的毒性作用，还是导致抗菌素耐药性（AMR）急剧增加的主要因素，严重削弱了现代医学的效果[2][3]。此外，排放到水、土壤和食物链中的抗生素会破坏生态平衡，并促进抗生素耐药基因（ARGs）的传播[4][5]。因此，建立快速的现场监测技术对于确保食品安全、评估环境风险和保护公共卫生至关重要。
传统的抗生素检测方法主要包括高效液相色谱（HPLC）[6]、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[7]和酶联免疫吸附测定（ELISA）[8]。尽管这些方法具有高精度和高灵敏度，但它们通常需要昂贵的仪器设备、复杂的样品预处理程序以及专业操作人员，使得现场快速检测变得困难。此外，免疫测定受抗体稳定性和成本的限制，而色谱方法耗时且劳动强度大，不适合快速筛查[9]。因此，操作简单、成本低廉且适合现场部署的新型传感平台成为研究重点。最近，已经开发了三种主要用于现场应用的生物传感器类型：电化学生物传感器、光学生物传感器（例如比色法、荧光法、表面增强拉曼散射法）和压电生物传感器[10]。其中，光学和电化学平台因其与便携式读数器和智能手机的兼容性而被最广泛采用[11]。
核酸适配体作为新型分子识别元件在生物传感中展现出巨大潜力[12]。适配体是通过指数富集（SELEX）技术系统进化得到的单链DNA或RNA序列。它们能够以高特异性和亲和力结合多种目标物质，包括小分子[13]、蛋白质[14]和细胞[15]。与抗体相比，适配体具有合成简便、稳定性高、修饰容易、批次间变化小以及通过序列设计可调节结合特性等优点[12]。因此，适配体成为构建高灵敏度和特异性生物传感器的理想选择[16]。利用这些优势，基于适配体的生物传感器已被广泛用于检测食品和环境样品中的各种抗生素残留物，为传统分析技术提供了有前景的替代方案[17]。
尽管适配体传感器采用了多种信号输出模式（例如比色法、荧光法、电化学法[18]），但大多数方法仍需要对适配体进行共价标记[19]或依赖复杂的纳米材料组装[20]，这增加了生物传感器的成本和操作复杂性。基于染料位移的无标记适配体传感器因其无标记、经济高效和操作简便等优点而受到广泛关注[21][22][23][24]。花青素染料因其优异的荧光特性和与核酸的强静电相互作用，成为构建此类传感器的理想候选材料[25]。例如，Deng等人开发了一种基于奎宁适配体和花青素染料（Cy-BN-5）的染料位移传感平台，实现了对生物流体中奎宁的高选择性和灵敏度比色和近红外-II荧光检测及成像[26]。伪异氰胺（PIC）是一种经典的花青素染料，与某些适配体结合时表现出显著的荧光增强效应，并在目标物质存在下发生可逆的荧光淬灭，使其适合用于构建灵敏、快速且通用的无标记位移型荧光适配体传感器[27]。然而，当使用不同的目标适配体构建生物传感器时，这类荧光染料的检测性能会有所不同。染料、适配体和目标之间的具体相互作用机制尚不清楚。
本研究提出了一种基于PIC染料的无标记荧光适配体传感器。该传感器的工作原理是PIC与适配体结合后增强荧光，随后在目标物质存在下发生竞争性位移和荧光淬灭，从而实现定量分析。本文探讨了染料、适配体和目标之间的相互作用机制，并通过系统优化反应条件和传感界面，使得该检测方法在复杂基质中仍具有高稳定性和选择性。此外，该检测方法集成到一种定制的3D打印便携设备中，配备了基于智能手机的视觉识别系统，能够实现万古霉素（VAN）、土霉素（OTC）和卡那霉素（KAN）的灵敏、快速和现场检测。整体设计使得检测过程用户友好、成本低廉、快速且无需大型仪器。
材料与试剂
伪异氰胺（PIC）、万古霉素（VAN）、土霉素（OTC）、恩诺沙星（ENR）、红霉素（ERY）、氯霉素（CAP）、阿奇霉素（AZM）、链霉素（STR）、甲硝唑（MNZ）、替考拉宁（TEI）和四环素（TC）购自中国上海Macklin生化有限公司。卡那霉素（KAN）、磺胺嘧啶（SDZ）、青霉素（PEN）、罗红霉素（RXM）和妥布霉素（TOB）购自中国上海Aladdin生化技术有限公司。甘油、乙二醇
目标诱导位移荧光检测原理及便携设备设计
该无标记荧光适配体传感器基于目标诱导的染料位移机制（图1A）。伪异氰胺（PIC）作为一种阳离子花青素染料，在自由状态下由于分子内扭转松弛而表现出荧光淬灭现象。然而，当其与单链适配体结合时，适配体提供的刚性微环境有效抑制了这种非辐射松弛过程，从而引发显著的荧光增强（“开启”效应）。
结论
总之，本研究成功开发了一种基于目标诱导的PIC染料从特定适配体复合物中竞争性位移的多功能无标记荧光适配体传感器。阐明了其基本相互作用机制，表明荧光“开启”信号严重依赖于适配体提供的结构刚性，而有效的信号切换需要目标结合引起的构象变化，这些变化会破坏染料的结合位点。
CRediT作者贡献声明
Nandi Zhou：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取。Jiawei Bian：撰写——初稿撰写、实验研究、数据管理。Shixin Cai：实验研究。Xin Chen：验证、数据分析。Xiaoli Wang：监督。Yuting Zhang：监督
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。
数据可用性
数据可应要求提供。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：42477491、42177212）的财政支持。
