《Analytica Chimica Acta》：Deep quantitative proteomic analysis of gingival crevicular fluid for severe pediatric caries
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本研究首次利用SP3增强的GCF样本制备方法结合直接DIA-MS质谱技术，系统分析儿童健康组与龋齿组的GCF蛋白质组。鉴定出6397个蛋白，发现75个差异表达蛋白（42↑/33↓），提出MUC5B、DMBT1、PIP、PIGR、TIMP1、S100A7六联生物标志物组合（ROC-AUC 0.944）鉴别严重龋齿组。
薛阳|赵婷|于平波|蔡丹|廖瑞静|蔡燕|王俊
上海交通大学医学院附属上海第九人民医院儿童牙科，上海，200433，中华人民共和国
摘要
背景
基于质谱（MS）的蛋白质组学方法已被证明是发现龋齿诊断和管理临床生物标志物的强大工具。唾液、获得性牙釉质膜（AEP）和牙本质是三种常见的样本介质。然而，基于MS的龋齿蛋白质组学目前面临两个主要问题：（1）龋齿蛋白质组的分析覆盖范围相对有限（<3000种蛋白质），这可能会阻碍我们对关键但低丰度蛋白质功能的理解。（2）龈沟液（GCF）是一种有价值的口腔液体，但GCF蛋白质与龋齿之间的关联尚未得到充分探索，且在龋齿背景下的GCF蛋白质组学特征也尚未明确。
结果
基于我们之前开发的单罐固相增强样品制备（SP3）方法，首次使用directDIA-MS方法对健康对照组（HC组，31名受试者，DMFT = 0）和儿童龋齿组（30名受试者，DMFT > 7）的GCF蛋白质组进行了定量分析。在所有GCF样本中鉴定出6397种蛋白质。与HC组相比，儿童龋齿组中有75种蛋白质表达差异（42种上调，33种下调）。包括MUC5B、DMBT1、PIP、PIGR、TIMP1和S100A7在内的六种蛋白质生物标志物组合在区分严重儿童龋齿组和HC组方面显示出巨大潜力（ROC-AUC 0.944）。
意义与创新
首次使用基于SP3的directDIA-MS方法对龋齿的GCF蛋白质组进行了表征。我们生成了迄今为止最大的龋齿GCF蛋白质组数据集，并提出了一种六种蛋白质生物标志物的组合来预测严重儿童龋齿。所提出的方案和发现将为儿童龋齿的诊断和治疗提供重要的补充和新见解。
引言
龋齿，也称为蛀牙或龋洞，是儿童时期最常见的非传染性疾病之一[1]。尽管可以预防，但儿童龋齿会导致疼痛、不适以及进食和睡眠困难，甚至给家庭和社会带来显著的经济负担[2,3]。因此，为了筛查高风险的儿童龋齿人群，开发简单有效的方法来发现无龋齿儿童与严重龋齿儿童之间的潜在生物标志物非常重要。
基于质谱（MS）的蛋白质组学方法已被证明是识别改善龋齿诊断和管理的临床生物标志物的强大工具[4,5]。目前，唾液、获得性牙釉质膜（AEP）和牙本质是龋齿研究的三种主要样本介质。其中，唾液蛋白质组学受到更多关注，因为全唾液富含蛋白质，且唾液采集过程简单无痛[5,6]。例如，Huang等人将龋齿唾液蛋白质组的深度从几百种蛋白质扩展到约3000种蛋白质。然后他们建立了一个针对早期儿童龋齿（ECC）的角质蛋白3（KRT3）和黏蛋白21（MUC21）的目标蛋白质面板，并通过另一个独立队列进一步验证了这两种蛋白质[7]。为了更精确的预测，Ye等人量化了不同程度严重性的ECC唾液中的约2000种蛋白质，并发现差异表达的蛋白质（包括midkine（MK）、组蛋白H4、转化生长因子β3（TGFβ3）、酶原颗粒蛋白16同源物B（ZG16B）、黏蛋白20（MUC20）和下颌腺雄激素调节蛋白3B（SMR-3）在ECC进展中起关键作用[8]。与唾液采集类似，AEP采集也是无创的。然而，通常要求受试者等待一段时间以允许AEP在牙齿表面形成。目前，基于MS的AEP蛋白质组学分析仅能鉴定出<300种蛋白质[9,10]。与唾液和AEP蛋白质组学相比，从牙本质中提取蛋白质可能更为困难，因为牙本质样本的制备相对复杂（含有脱矿成分）。牙本质蛋白质组的分析覆盖范围约为几百种蛋白质[11,12]。
作为一种易于获取的替代样本来源，龈沟液（GCF）已被广泛用于发现牙周病的新生物标志物[13,14]。然而，关于GCF蛋白质与龋齿之间关联的研究远远落后。最近的研究发现，GCF中升高的基质金属蛋白酶-9（MMP-9）水平会加速组织分解并增加对更深层蛀牙的脆弱性，表明其在龋齿发展中的潜在作用[15]。此外，Seredin等人证明GCF中蛋白质组分二级结构的变化可作为龋齿进展的宝贵生物标志物[16,17]。与唾液采集相比，GCF采集具有牙齿特异性[5]。对于AEP采集，3-120分钟的AEP形成时间有时对儿童来说不方便[18]。对于牙本质样本的处理，从矿化组织中提取蛋白质本身就很复杂[11,12]。因此，GCF可能是发现龋齿新生物标志物的一个重要且互补的样本介质。
总之，基于MS的龋齿蛋白质组学目前面临两个主要问题：（1）龋齿蛋白质组的分析覆盖范围相对有限（<3000种蛋白质），这可能会阻碍我们对关键但低丰度蛋白质功能的理解。（2）GCF蛋白质与龋齿之间的关联尚未得到充分探索，且在龋齿背景下的GCF蛋白质组学特征也尚未明确。为了解决这些问题，我们旨在对儿童龋齿进行深入和定量的GCF蛋白质组学分析。此前，我们开发了一种基于单罐固相增强样品制备（SP3）的GCF样本制备方法，显著提高了GCF蛋白质组的覆盖范围（约5500种蛋白质）[19]。在这项研究中，我们将该方法与直接数据独立获取（DIA）-MS结合，对无龋齿儿童和严重龋齿儿童之间的GCF蛋白质组进行了深入比较分析，发现了儿童龋齿的候选生物标志物。
研究人群
本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得了上海交通大学医学院附属上海第九人民医院伦理委员会的批准（编号SH9H-2025-T203-1）。在招募前获得了每位参与者的法定监护人的知情同意。所有GCF样本均来自上海交通大学医学院附属上海第九人民医院的参与者。
受试者的临床特征
根据纳入和排除标准，本研究共纳入61名儿童。根据DMFT指数，31名受试者属于HC组（DMFT = 0，12名男性和19名女性，平均年龄6.5 ± 2.2岁），另外30名受试者属于龋齿组（DMFT > 7，19名男性和11名女性，平均年龄6.7 ± 1.1岁）。两组在性别、实际年龄、菌斑指数（PLI）和探查深度（PD）方面没有统计学上的显著差异。
讨论
目前，只有少数研究报道了GCF蛋白质与龋齿之间的关联，且在龋齿背景下的GCF蛋白质组学特征尚未明确。我们的目标是提供研究儿童龋齿的GCF蛋白质组图谱。此前，我们开发了一种基于SP3的GCF样本制备方法，大大提高了GCF蛋白质组的鉴定和定量[19]。基于这种有效的GCF样本制备方法，我们使用了directDIA-MS
结论
总之，基于我们之前开发的基于SP3的GCF样本制备方法，首次对健康对照组（HC组）和严重龋齿组之间的人类GCF蛋白质组进行了深入的定量分析。我们生成了迄今为止最大的人类GCF蛋白质组数据集，并提出了一种六种蛋白质生物标志物的组合用于严重儿童龋齿的预测。我们认为我们的方法和发现可以与其他方法一起用于龋齿的诊断和治疗。
作者贡献声明
薛阳：研究、撰写——初稿。赵婷：正式分析、验证。于平波：资源提供。蔡丹：资源提供。廖瑞静：概念构思、方法学设计。蔡燕：方法学设计、项目管理、数据可视化、撰写——审阅与编辑。王俊：资金获取、监督。
致谢
本工作得到了中国国家自然科学基金（NSF）（编号82571072）、上海自然科学基金（编号23ZR1437800）以及上海第九人民医院生物临床样本项目（编号YBKB202222）的支持。
