落叶松（Larix olgensis A. Henry）幼苗中氮源的差异利用与分配 曲同宝（Tongbao Qu） 严思宇（Siyu Yan） 刘玉山（Yushan Liu） 黄帆（Fan Huang） 赵蕾（Lei Zhao）

《Applied Sciences》：Differential Utilization and Allocation of Nitrogen Sources in Larix olgensis A. Henry Seedlings Tongbao Qu, Siyu Yan, Yushan Liu, Fan Huang and Lei Zhao

　　摘要：尽管近年来有许多研究关注氮源添加对植物反应的影响，但关于Larix olgensis A. Henry幼苗对不同氮源的差异利用和分布模式仍缺乏清晰的认识。具体来说，铵态氮、硝态氮和尿素在植物不同器官中的差异吸收和分布机制，以及这些过程如何与根际土壤微生物过程相互作用，仍有待阐明。本研究在野外实验条件下进行，结合了15N同位素追踪、土壤理化性质测定、酶活性分析和微生物群落功能分析，以研究三种氮源（NH4+、NO3-和尿素）及其不同添加水平对Larix olgensis A. Henry幼苗氮吸收和分布的影响。结果表明，氮源类型显著影响植物的氮吸收速率和内部分布模式。在24小时内，幼苗优先吸收铵态氮，并在根部保留较高比例的新吸收氮。高铵氯（GN）处理组的根部区域15N丰度最高，表明氮在根部快速同化并短期滞留。到48小时时，大多数处理组的器官中的15N丰度和AT%值显著高于24小时时的值，这促进了硝态氮和尿素向茎和叶部的运输，表明氮分布逐渐向地上部分转移。适量的氮添加改善了土壤养分条件，改变了pH值和导热性，增强了与脲酶和硝酸盐还原酶相关的氮转化过程，并增加了与碳代谢、氮代谢和能量代谢相关的微生物多样性和代谢功能。土壤pH值、总氮（TN）、铵态氮（NH4+-N）和有机碳（OC）是驱动土壤微生物群落结构分化的核心环境因素，不同分类水平的微生物群组对土壤理化性质的响应具有明显的特异性。

1. 引言
氮循环的加速是全球环境变化的核心问题之一。随着人类生产活动的加剧，全球氮循环呈现出显著加速的趋势，伴随着过度和不平衡的氮沉积。2020年全球氮沉积量达到了92.7 Tg N，并自2015年达到峰值后趋于稳定[1,2]。发展中国家，特别是低纬度和中纬度地区的国家，已成为新的氮沉积热点。这一变化与人均GDP高度相关，还显示出氮沉积峰值趋向于氧化氮沉积的减少[2]。特别是在中国，快速的工业和农业发展导致氮沉积量持续增加，使其成为欧洲和美国以外第三大氮沉积区域。其中，中国东北部由于其高能耗，成为氮沉积的高值区域。煤炭的广泛使用是氮氧化物排放的主要来源之一。虽然全球逐步淘汰煤炭燃烧的趋势可能减少氮氧化物排放，但短期内也可能导致其他气候变化问题，如区域变暖和极端降水事件增加[3]。氮沉积的空间分布特征为研究植物氮吸收偏好及其在区域生态系统中的影响因素提供了独特的背景[4]。

氮同位素技术在生态研究中具有广泛的应用前景，两种稳定氮同位素14N和15N的丰度比（15N/14N）是这类研究的基础；δ15N值的变化可以提供有关氮利用及其命运的定量信息。这种高精度和敏感的15N同位素追踪技术广泛应用于研究植物氮营养状况、肥料氮利用效率以及氮肥施用的环境影响，并已成为现代农业和生态研究中追踪生态系统氮流动路径、识别氮污染源和支持科学氮管理策略发展的核心工具。它对于量化植物氮吸收和分析氮吸收与环境因素（如土壤条件和气候因素）之间的相关性也是不可或缺的，为全球氮循环和氮肥的有效利用提供了关键支持。值得注意的是，近年来，氮同位素技术在农业和林业中的应用持续扩展：它不仅用于研究氮肥利用效率，还在优化施肥策略和减少环境污染方面显示出巨大潜力，并在改进氮资源管理和促进生态系统可持续发展方面发挥着关键作用——尤其是在氮沉积量高的地区，其应用价值尤为显著。

黄落叶松（Larix olgensis A. Henry）是中国东北部重要的造林树种，在维护区域生态稳定和碳汇功能方面发挥着重要作用[5]。树种多样性与生态系统稳定性之间存在正相关关系。作为中国东北部的主要树种之一，黄落叶松的丰富生物多样性有助于提高生态系统稳定性[6,7]。近年来，氮同位素技术在农业和林业中的应用持续扩展。它不仅用于研究氮肥利用效率，还在优化施肥策略和减少环境污染方面显示出巨大潜力。这项技术在改进氮资源管理和促进生态系统可持续发展方面发挥着关键作用，尤其是在氮沉积量高的地区，其应用价值尤为显著。植物的氮吸收偏好受多种因素影响，包括：（1）土壤物理和化学性质（pH值、碳氮比、酶活性）；（2）微生物群落结构（如固氮细菌、硝化细菌功能群）；（3）氮形式的生物可利用性。然而，黄落叶松对不同氮形式的吸收偏好尚不清楚，该物种与土壤微生物系统的相互作用机制尚未系统研究。这一知识空白限制了在高氮沉积条件下为该树种制定精确氮管理策略的发展。

基于此，本研究进行了多维度分析，以研究添加不同量的尿素、 ammonium chloride和钠硝酸盐对土壤物理和化学性质、微生物群落结构以及Larix gmelinii幼苗不同部位氮吸收贡献比例的影响。本研究旨在揭示温带针叶树种氮吸收偏好的生理和生态机制，加深我们对“植物-土壤-微生物”氮耦合循环的理解。它为优化高氮沉积地区人工落叶松森林的氮肥管理提供了基础，减少了氮淋失的风险，并提高了森林生态系统的可持续性。

2. 材料与方法
2.1. 野外试验
本研究在吉林省长春市吉林农业大学后侧的黄落叶松林中进行，氮添加实验始于2018年。实验区位于海拔250–350米处，属于北温带大陆性季风气候区。该地区夏季炎热潮湿，降雨集中，温度适宜；冬季寒冷且漫长，温度较低。显著的季节性差异为研究植物氮吸收特性提供了理想的气候条件。实验对象是二年生黄落叶松（Larix olgensis A. Henry）幼苗。黄落叶松适应性强，在温带-寒冷气候和湿润土壤的灰褐色森林土带广泛分布。它在深厚、肥沃、排水良好的沙壤土中生长良好，最适土壤pH值约为5。其广泛的生态适应性便于研究植物对不同土壤条件和氮形式的反应。

实验采用完全随机区组设计。实验地块设立在吉林农业大学后侧黄落叶松林内土壤条件均匀的平坦区域，每个地块面积为5米×5米，任意两个地块之间至少有2米宽的缓冲区以防止不同处理之间的干扰。氮添加处理分为三个水平：0公斤N·hm-2·年-1（对照组）、10公斤N·hm-2·年-1（低水平）和20公斤N·hm-2·年-1（高水平）。氮添加形式有三种：尿素（U）、NH4Cl（A，铵态氮）和NaNO3（N，硝态氮）。实验包括七种处理：高尿素（HU）、低尿素（LU）、高NH4Cl（HA）、低NH4Cl（LA）、高NaNO3（HN）、低NaNO3（LN）以及对照组（CK），分别用GN、DN、GL、DL、GX和DX表示。每种处理重复五次。每月施氮一次。实验前清除土壤表面的枯落物以减少非实验因素的影响。根据统一标准种植二年生黄落叶松幼苗以确保初始条件的一致性。将直径10厘米的PVC管插入土壤中，插入深度为40厘米，形成物理屏障以防止氮侧向流失。对于15N标记的氮注射，每个幼苗周围设置了四个等距注射点。每个注射点接受5毫升15N标记的氮溶液，注射点距离幼苗茎部约3厘米，注射深度为10厘米。注射针头具有四边侧孔结构，以确保溶液均匀扩散。在注射后24小时和48小时两个时间点采集幼苗及其完整根系，并同时收集根际土壤样本：用无菌软刷轻轻刷去根系表面的附着土壤（0-2毫米），使用无菌土壤采样器采集0-20厘米土层（距幼苗茎部10厘米）的土壤样本，每个地块的三个土壤子样本混合成一个复合样本。样本采集后立即进行初步处理。土壤样本分为两部分：一部分在4°C下新鲜储存，用于后续微生物群落分析和酶活性测定；另一部分在室温下风干、研磨并通过2毫米和0.15毫米尼龙筛网过滤，用于土壤理化性质测试。幼苗样本冲洗以去除表面杂质，然后分为四个部分：主茎、侧茎、根和叶。使用元素分析仪和同位素比值质谱（IRMS）测定不同部分的15N含量，以评估氮吸收情况。

2.2. 土壤理化性质测试
使用pHS-3C pH计（上海精密科学仪器有限公司制造，中国上海）在土壤与水比例为1:2.5（v/v）的条件下测定土壤pH值。使用DDS-307电导率计（上海INESA科学仪器有限公司制造，中国上海）测量土壤电导率（EC）。通过质量法测定水溶性盐含量。使用K2Cr2O7-H2SO4加热容量法测定有机物含量。使用Kjeldahl消化系统（FOSS Analytical A/S制造，Hiller?d，丹麦）测定总氮。使用离子色谱仪（ICS-6000，Thermo Fisher Scientific，Sunnyvale，CA，美国）测定铵态氮（NH4+）和硝态氮（NO3-）[8,9]。

2.3. 土壤酶活性测试
按照2.1节描述的方法收集和预处理的根际土壤样本（距根表面0-2毫米）用于酶活性测定，每个土壤样本设置三个技术重复。使用Geruisi Bioengineering有限公司（南京，中国）提供的试剂盒按照制造商的标准协议测定土壤酶活性[10]。土壤亚硝酸盐还原酶可将NO2-还原为NO3-，从而减少参与硝化反应形成粉红色化合物的NO2-量。这种粉红色物质在540纳米处具有最大的吸收峰值，土壤亚硝酸盐还原酶的活性通过测量540纳米处的吸光度变化来确定。土壤脲酶测定试剂盒使用靛酚蓝比色法来确定尿素被脲酶水解产生的NH3-N。在强碱性介质中，它与次氯酸盐和酚反应生成水溶性染料靛酚蓝，其强度与溶液中的NH3-N含量成正比。这种物质在578纳米处具有最大的光吸收，其强度与溶液中的NH3-N含量成正比，从而确定脲酶的活性。土壤硝酸盐还原酶催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，同时抑制由亚硝酸盐还原酶产生的亚硝酸盐的降解。亚硝酸盐与相应的显色剂反应生成红色偶氮化合物；这种物质在540纳米处具有最大的吸收峰值，从而确定土壤硝酸盐还原酶的活性。土壤酸性蛋白酶（S-ACPT）在酸性条件下水解酪蛋白产生酪氨酸；酪氨酸在碱性条件下与酚反应生成蓝色化合物；这种蓝色物质在680纳米处具有特征吸收峰值，从而确定S-NPT酶的活性。由于底物酪蛋白含有多种氨基酸，在检测过程中必须设置含有酪蛋白的对照组，以减去干扰背景值并排除假阳性结果。

2.4. 植物氮吸收途径及其贡献的评估与计算
收集了黄落叶松幼苗不同部位的15N丰度数据，包括叶片、根部、主干、侧枝和整株植物样本，并使用元素分析仪和同位素质谱（IRMS，IsoPrime 100，Isoprime Ltd.，Cheadle Hulme，Greater Manchester，英国）按照Hu等人（2024）[11]和Zhang等人（2020）[12]描述的方法进行了测定。计算氮吸收率及其贡献比例：结合15N标记的数据，我们计算了黄落叶松幼苗对不同形式氮的吸收率及其在各个植物器官中的分布比例，明确了不同形式氮（尿素氮、铵态氮、硝态氮）对植物总氮吸收的贡献，为优化氮管理提供了理论基础。通过比较不同形式氮的吸收效率，揭示了幼苗对特定氮形式的吸收偏好，并探讨了这种偏好在不同生长阶段的变化。

2.5. 土壤微生物群落结构
按照2.1节所述的方法收集了新鲜根际土壤样本（距离根表面0–2毫米），并在4°C下预储存，用于微生物群落结构分析；使用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，美国）从每份0.5克均质化的新鲜土壤中提取基因组DNA，每份样本进行三次技术重复实验。采样1微克基因组DNA后，使用Covaris超声破碎仪将其随机片段化为约350个碱基对的片段以构建文库。整个文库构建过程包括末端修复、添加A尾基、连接测序接头、纯化和PCR扩增等步骤。文库构建完成后，通过AATI分析评估文库片段的完整性和插入片段的大小。如果插入片段大小符合预期，使用Q-PCR（有效文库浓度>3 nM）定量有效文库的准确浓度，以确保文库质量。文库通过质量检查后，根据其有效浓度和目标数据输出要求将不同文库合并，然后进行PE150测序。

Fastp v0.23.4（https://github.com/OpenGene/fastp，2026年4月1日访问）用于预处理Illumina NovaSeq/HiSeq测序平台的原始数据，以获得高质量、无污染的读段，以便后续的生物信息学分析。在以下情况下丢弃配对末端读段：当任一读段含有接头污染；当任一读段含有超过10%的模糊核苷酸（N）；或当任一读段含有超过50%的低质量碱基（质量分数<5）。为消除潜在的宿主污染，将清洁读段与宿主基因组数据库对齐，以移除宿主来源的读段。Bowtie2 v2.4.5（http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml，2026年4月1日）用于此目的，参数设置如下：--end-to-end, --sensitive, -I 200, -X 400 [13,14,15]。MetaGeneMark v3.61（http://topaz.gatech.edu/GeneMark/，2026年4月1日）使用默认参数预测每个样本中的开放阅读框（ORFs）（≥500 bp），并从最终基因集中移除短于100 nt的预测序列[19,20,21,22,23]。对于ORF预测结果，使用CD-HIT软件（http://www.bioinformatics.org/cd-hit/，2026年4月1日）消除冗余[24,25]并获取非冗余的初始基因目录（由连续非冗余基因编码的核酸序列称为基因）[22]，参数设置如下：-c 0.95, -G 0, -aS 0.9, -g 1, -d 0 [16,20]。使用Bowtie2将每个样本的清洁数据与初始基因目录对齐，计算每个样本对齐中的基因读段数量，参数设置如下：--end-to-end, --sensitive, -I 200, -x 400 [16,20]。过滤掉每个样本中读段数量≤2的基因，最终确定用于后续分析的基因目录（Unigenes）[22]。根据对齐的读段数量和基因长度，使用以下公式计算每个样本中每个基因的丰度：r代表对齐到该基因的读段数量，L代表基因的长度[26,27,28]。基于每个样本中基因目录中每个基因的丰度，进行基本信息统计、核心泛基因分析、样本间相关性分析和基因数量Venn图分析。

DIAMOND软件（https://github.com/bbuchfink/diamond/，2026年4月1日）[26]用于将unigenes序列与Micro_NR数据库对齐，该数据库包含从NCBI的NR数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提取的细菌、真菌、古菌和病毒的序列。对齐使用blastp算法进行，参数设置如下[14]。基于每个分类水平的丰度表，进行Krona分析、相对丰度概览和丰度聚类热图，并结合PCA（R ade4包）、PCoA（R ade4包）和NMDS（R vegan包）进行维度简化[29]。Anosim分析（R vegan包）用于测试组间差异。MetaGenomeSeq和LEfSe分析用于检测组间物种差异。MetaGenomeSeq分析用于在每个分类水平上进行组间排列测试并获取p值。LEfSe软件用于LEfSe分析（默认LDA得分为4）[30]。最后，应用Random Forest分析（R pROC和randomForest包）通过梯度选择物种级别，并构建Random Forest模型。通过MeanDecreaseAccuracy和MeanDecreaseGin筛选重要物种，然后对每个模型进行10折交叉验证并绘制ROC曲线。

DIAMOND软件（https://github.com/bbuchfink/diamond/，2026年4月1日）用于将unigenes序列与功能数据库中的序列对齐，参数设置如下：blastp, -e 1 × 10?5 [16,31]。功能数据库包括KEGG数据库（http://www.kegg.jp/kegg/，2026年4月1日）[32,33]、eggNOG数据库（http://eggnogdb.embl.de/#/app/home，2026年4月1日）[34]、CAZy数据库（http://www.cazy.org/）[35]、VFDB数据库（http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm，2026年4月1日）和PHI数据库（http://www.phi-base.org/index.jsp，2026年4月1日）。从每个序列的对齐结果中选择最佳的blast hit结果用于后续分析[16,36,37,38]。根据对齐结果，计算不同功能水平上的相对丰度（每个功能水平上的相对丰度等于标注为该功能水平的基因的相对丰度之和）[13,16]。使用Resistance Gene Identifier（RGI）软件（CARD数据库提供）[40]将unigenes序列与CARD数据库（RGI内置blastp，默认evalue < 1 × 10?30）[41]对齐[39]。根据RGI对齐结果和unigenes丰度信息，计算每个ARO的相对丰度。基于ARO的丰度，生成丰度直方图、丰度聚类热图、组间ARO差异分析以及抗性基因（标注为ARO的unigenes）和抗性机制的物种归属分析（一些长名称的ARO缩写为前三词加下划线）。将unigenes与移动遗传元件（MGEs）分别与插入序列（isfinder）、integall数据库和plasmid数据库进行比较，以获取丰度信息。进一步可视化丰度直方图和相对丰度热图的结果。

本实验使用了三种形式的氮添加：尿素（CO(NH2)2）、NH4Cl和NaNO3。实验共有七种处理方式：高浓度CO(NH2)2、低浓度CO(NH2)2、高浓度NH4Cl、低浓度NH4Cl、高浓度NaNO3以及对照组，分别标记为GN、DN、GL、DL、GX和DX。

2.6. 统计分析
本研究使用SPSS 26.0进行数据分析，使用Origin 2021软件进行数据绘制。进行了描述性统计分析，以获得平均值和标准差（SD）以及显著差异，并分别分析不同氮形式和添加水平对土壤物理化学性质、土壤酶活性和土壤微生物群落结构的影响，以确定处理组之间是否存在显著差异。采用Pearson相关性分析来识别土壤微生物群落结构与土壤物理化学性质之间的协同关系。对所有确定的土壤物理化学性质、土壤酶活性、微生物α多样性指数和15N同位素特征进行了单因素方差分析（ANOVA），然后使用Tukey’s HSD方法在p < 0.05的水平上进行事后多重比较测试，以识别单个处理组间的显著差异；这些严格的统计比较有效量化了氮源类型和添加剂量的离散效应，同时确保了数据集中组间变异解释的统计可靠性。

3. 结果
3.1. 植物氮吸收途径及其贡献的分析
图1、图2和图3展示了不同氮源和添加水平对A. Henry落叶松幼苗不同部位15N丰度和分布的影响。总体而言，氮的添加显著提高了所有幼苗器官中15N的丰度（R）、δ15N值（d）和原子百分比（AT%），特别是在叶片、根部、主干和侧枝中增加了15N的水平。这一现象随时间和植物组织类型而变化。在24小时的周转时间内（图1a–d、图2a–d和图3a–d），GN、DN和GL处理显著提高了侧根、主干和侧枝中15N的丰度。值得注意的是，铵态氮处理表现出最明显的效果，表明幼苗能够快速吸收NH4+-N并优先将其保留在地下组织中。相反，GL和DN处理促进了氮向叶片的运输，突显了不同氮源在短期分布上的显著差异。这进一步验证了氮源类型和浓度对幼苗氮吸收途径和分布模式的显著调控作用。

图1. 不同处理对15N丰度的影响。(a–d) 15N注射24小时后A. Henry落叶松幼苗不同器官中的δ15N值：(a) 主干（T），(b) 侧枝（S），(c) 叶片（L），(d) 根部（R）；(e–h) 15N注射48小时后A. Henry落叶松幼苗不同器官中的δ15N值：(e) 主干（T），(f) 侧枝（S），(g) 叶片（L），(h) 根部（R）。横坐标表示不同的氮添加处理（CK、DX、GX、DL、GL、DN、GN）；纵坐标表示植物器官的δ15N（‰）值。图2. 不同处理对δ15N值的影响。(a–d) 15N注射24小时后A. Henry落叶松幼苗不同器官中的δ15N值：(a) 主干（T），(b) 侧枝（S），(c) 叶片（L），(d) 根部（R）；(e–h) 15N注射48小时后A. Henry落叶松幼苗不同器官中的δ15N值：(e) 主干（T），(f) 侧枝（S），(g) 叶片（L），(h) 根部（R）。横坐标代表不同的氮添加处理（CK、DX、GX、DL、GL、DN、GN）；纵坐标代表植物器官的δ15N（‰）值。图3. 不同处理对原子百分比的影响。(a–d) 在15N注射后24小时，Larix olgensis A. Henry幼苗不同器官中的15N原子百分比：(a) 主茎 (T)，(b) 侧枝 (S)，(c) 叶子 (L)，(d) 根 (R)；(e–h) 在15N注射后48小时，Larix olgensis A. Henry幼苗不同器官中的15N原子百分比：(e) 主茎 (T)，(f) 侧枝 (S)，(g) 叶子 (L)，(h) 根 (R)。横坐标代表不同的氮添加处理（CK、DX、GX、DL、GL、DN、GN）；纵坐标代表植物器官的15N原子百分比（AT%）。在48小时的周转时间下（图1e–h、图2e–h和图3e–h），大多数器官的15N丰度和铵氮（AT%）值显著高于24小时时的值，表明新吸收的氮仍在幼苗体内分布。值得注意的是，在DL处理下，叶子和主茎的δ15N值显著增加，这表明低浓度的硝态氮在吸收后倾向于在地上部分积累；它显著增强了叶子和茎中的氮积累，而GN处理则保持了根部最高的15N水平，表明高浓度的铵氮供应倾向于促进根系的保留并限制其向上运输。结果表明，植物在短期内优先吸收铵态氮，而在长期周转后，硝态氮和尿素更有利于氮向地上部分的运输。在GN处理下，根部的15N含量保持在最高水平，表明高浓度的铵氮可能在根部发生强烈的同化作用，导致向地上部分的运输受到限制。铵氮的有效同化主要发生在植物根部，这可能限制了氮向地上部分的运输[42]。在根部，铵氮通过谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）途径迅速同化为谷氨酰胺和谷氨酸。这些氨基酸在根部的积累可能限制了氮向植物地上部分的运输[43,44]。不同器官中15N丰度的变化表明，24小时内根系是氮积累的主要场所，尤其是铵氮处理的效果尤为显著。随着时间的推移，地上部分（叶子和主茎）中15N的比例增加，特别是在硝态氮和尿素处理中这一效应更为明显。这一结果与土壤中氮形态的移动性和转化特性密切相关：硝态氮（NO3?-N）通过蒸腾流（TF）容易快速向上运输，而铵态氮（NH4+-N）则在根部更容易被固定和同化。铵氮在根部的同化主要通过谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOGAT）的作用进行，这些酶将NH4+-N转化为有机氮化合物[45]。这种同化过程不仅有助于降低NH4+-N的毒性，还有助于植物在低氧（LO）或淹水（FW）条件下的存活[46]。就氮吸收效率和偏好而言，幼年的黄落叶松幼苗在短期内（24小时）对NH4+-N的吸收强度更高，尤其是在根部有显著的积累；然而，在较长的时间尺度（48小时）内，NO3?-N和尿素更有利于氮向地上部分的运输和分布。这表明，在高氮沉积条件下（HND），适当调节NH4+-N与NO3?-N的比例可以促进营养吸收，同时优化植物内部氮的分布模式，为施肥管理提供指导。3.2. 氮添加对土壤物理化学性质的影响氮添加显著影响土壤中的碳和氮成分、pH值、电导率和含水量，有效改善了土壤养分状况。土壤有机碳（SOC）、总氮（TN）、NH4+-N和NO3?-N的含量通常随着氮添加而增加，表明外源氮的施用可以有效改善土壤养分状况（图4）。其中，低剂量尿素（DL）对提高SOC的效果最好，其次是高剂量硝酸钠（GX）和低剂量尿素（GL），两者都与对照组（CK）相比有显著增加。TN的变化趋势与SOC相似，GL的增加幅度最大，比CK增加了181.70%。高剂量尿素（HL）对提高NH4+-N的效果最显著，比CK增加了17.06%。GX处理对提高NO3?-N的效果最明显。图4. 土壤物理化学性质分析图表。该图表显示了不同氮添加处理（CK、GN、DN、GL、DL、GX、DX）下关键土壤物理化学性质的变化，包括(a) 硝态氮（NO3?-N，mg/kg），(b) 总氮（TN，g/kg），(c) 土壤有机碳（SOC，g/kg），(d) 铵氮（NH4+-N，mg/kg），(e) 土壤pH值，(f) 电导率（EC，μs/cm），以及(g) 土壤含水量（SWC，%）。每个指标都以独立子图的形式展示，横坐标表示处理组，纵坐标表示相应的性质含量/值；误差条表示三次生物重复实验的标准偏差。低浓度的尿素更有利于NH4+-N的积累，而高浓度的硝酸钠更有利于NO3?-N和TN的提高。研究表明，土壤中氮的可用性控制着植物对不同氮形态的吸收，大多数植物更倾向于吸收NO3?-N而非NH4+-N[47]。这可能与氮的转化、微生物利用偏好和土壤氮循环（SNC）密切相关[48]。就土壤pH值和电导率（EC）而言，低剂量硝酸钠（DX）可以显著提高pH值以缓解酸化并保持低EC值；GX处理可以提高pH值以缓解酸性土壤条件，但它也会导致EC值升高。先前的研究发现，使用离子液体如1-烷基-3-甲基咪唑鎓硝酸盐（[Cnmim]NO3）也会产生类似的结果，随着施用量的增加，土壤电导率显著升高，从而增加盐胁迫的风险，这与本研究的结果一致[49]。就土壤含水量（SMC）而言，高剂量氯化铵（GN）对提高水分保持能力的影响最显著，比CK增加了53.56%。GX和DX处理的SMC低于CK，可能是由于高浓度NaNO3施用导致的渗透压增加和盐胁迫。研究表明，混合森林带可以显著提高土壤的水分保持能力和养分保持能力，NH4+-N含量的增加是关键因素[10]。这与本研究的结果一致。3.3. 土壤酶活性图5显示了不同氮处理对土壤酶活性的影响。本研究涉及的土壤酶包括亚硝酸盐还原酶（图5a）、脲酶（图5b）、硝酸盐还原酶（图5c）和酸性蛋白酶（图5d）。结果表明，所有处理都导致土壤亚硝酸盐还原酶活性下降，其中GN处理的下降幅度最大，比CK处理下降了9.94%。这一结果表明高水平的NH4+-N输入可能抑制反硝化过程（DP）中亚硝酸盐还原步骤的酶活性。先前的研究使用二甲基亚砜（DMSO）作为选择性抑制剂，发现它显著降低了NIR的基因表达和酶活性，这可能是亚硝酸盐还原酶活性下降的重要原因[6]。所有处理中的脲酶活性都高于CK处理，其中HL处理的增加幅度最小（2.74%），而DN和DL处理的增加幅度最大，均为44.83%[50,51,52]。这可能与低水平氮添加促进了脲酶合成和氮矿化速率有关。所有处理中的硝酸盐还原酶活性都显著增加，超过了100%。其中，GX处理的增加最为显著，大约是CK处理的三倍。这表明高水平的硝态氮输入显著增强了土壤中的硝酸盐还原过程。反硝化和异化硝酸盐还原为铵（DNRA）是主要的硝酸盐还原途径，在这些环境中DNRA过程占主导地位，显著影响氮的利用效率和作物产量[53]。此外，硝酸盐还原酶活性可能受大气CO2浓度变化的影响，升高的CO2可能通过一氧化氮（NO）途径调节硝酸盐还原酶活性[54]。HN和HL处理中的酸性蛋白酶活性显著增强，分别比对照组（CK）增加了26.32%和22.22%，表明这些处理可能增强了有机氮的水解和氨基酸的释放。从功能角度来看，脲酶（UE；EC 3.5.1.5）是一种含有镍的寡聚酶，专门催化尿素的水解，释放NH3和CO2。其活性与土壤有机质、总氮和有效氮含量呈正相关，反映了氮的供应状况。土壤中的脲酶活性与有机质含量密切相关，意味着可以通过脲酶活性评估土壤肥力和健康状况[55]。亚硝酸盐还原酶是反硝化过程中的关键酶，其活性的变化可以反映氮的转化效率。亚硝酸盐还原酶在反硝化过程中通过催化亚硝酸盐还原为一氧化氮（NO）起着重要作用[56]。酸性蛋白酶广泛参与土壤有机氮的降解，其活性直接影响土壤氮的矿化速率。各种形式的氮的添加增加了土壤矿质氮含量，并增强了硝酸盐还原酶和脲酶的活性。综合结果表明，不同氮来源和施用水平对酶活性的调节存在显著差异，这与氮形态、土壤微生物群落结构和氮循环过程密切相关。图5. 不同氮添加对土壤酶活性的影响。(a) 土壤亚硝酸盐还原酶（NiR）活性变化率（%），(b) 土壤脲酶（UE）活性变化率（%），(c) 土壤硝酸盐还原酶（NR）活性变化率（%），(d) 土壤酸性蛋白酶（AP）活性变化率（%）。横坐标代表不同的氮添加处理（CK、DX、GX、DL、GL、DN、GN）；纵坐标表示相对于对照组（CK）的酶活性变化百分比。正值表示酶活性增加，负值表示酶活性减少；误差条表示三次生物重复实验的标准偏差。3.4. 土壤微生物多样性分析图6和图7显示了不同氮来源和添加水平对土壤微生物群落的影响。在eggNOG功能注释结果（图6a–f）中，DN和DL处理的ACE、Chao1和观察到的物种指数显著高于CK处理，表明少量氮的添加有助于增加土壤微生物物种丰富度。此外，DN和GL处理中的Shannon和Simpson指数保持在较高水平，表明群落多样性和均匀性都有所改善。GX和DX处理中的多样性指数显著下降，表明硝酸钠的添加可能抑制某些微生物群体的生长，从而降低多样性。先前的研究表明，在含油生物反应器中，硝酸钠和硝普钠（SNP）协同作用，有效抑制了硫酸盐还原细菌（SRB）的活性[57]。β多样性分析结果如图4g所示，不同处理之间的微生物群落结构存在显著差异。PCoA结果显示，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）累积解释了大部分群落变异。在聚类分析中，相同氮源类型的处理在系统发育距离上相对接近，表明氮源类型是驱动群落结构差异的重要因素。eggNOG功能注释结果显示，代谢相关功能在COG功能分类中占主导地位。在这些功能中，与物质代谢和能量转换相关的功能，如COG0477、COG2114和COG2205，在DN和DL处理下显示出相对较高的相对丰度，表明高氮浓度增强了土壤微生物的代谢潜力。图6. 不同处理对土壤微生物多样性的影响（KEGG）。(a) ACE指数；(b) Chao1指数；(c) 观察到的物种指数；(d) Simpson指数；(e) Shannon指数；(f) 不同处理下核心eggNOG功能类别（COG0477、COG2114、COG2205等）的相对丰度；(g) 基于eggNOG功能注释的土壤微生物群落β多样性的PCoA分析（Bray–Curtis距离），其中PC1和PC2分别代表第一和第二主成分，百分比表示主成分对群落变异的解释率；不同颜色代表不同的氮添加处理（CK、DX、GX、DL、GL、DN、GN）。所有多样性指数都带有三个生物重复测样的标准偏差误差条。(h) 使用Bray–Curtis距离构建的层次聚类树状图和核心eggNOG功能直系同源组的相对丰度热图（包括COG0477、COG2114、COG2205等），树状图展示了样本间微生物功能谱的相似性，热图使用从蓝到红的颜色渐变来表示每个COG的相对丰度，蓝色表示低丰度，红色表示高丰度，揭示了特定处理下的微生物功能特征富集模式。所有α多样性指数都以箱形图呈现，包含单个数据点，反映了每种处理下三个生物重复测样的变化。图7. 不同处理对土壤微生物多样性的影响（eggNOG）。(a) ACE指数；(b) Chao1指数；(c) 观察到的物种指数；(d) Simpson指数；(e) Shannon指数；(f) 不同处理下核心KEGG酶委员会（EC）功能类别（7.1.1.2、2.7.11.1等）的相对丰度；(g) 基于KEGG功能注释的土壤微生物群落β多样性的PCoA分析（Bray–Curtis距离），其中PC1和PC2分别代表第一和第二主成分，百分比表示主成分对群落变异的解释率；不同颜色代表不同的氮添加处理（CK、DX、GX、DL、GL、DN、GN）。所有多样性指数都带有三个生物重复测样的标准偏差误差条。(h) 使用Bray–Curtis距离构建的层次聚类树状图和显示所有土壤样本中关键KEGG EC功能类别相对丰度的热图，树状图反映了不同处理重复测样间微生物功能谱的相似性，热图使用从蓝到红的颜色渐变来表示EC功能类别的相对丰度（蓝色表示低丰度，红色表示高丰度），从而揭示了特定处理下的微生物功能特征富集模式。所有α多样性指数都以箱形图呈现，包含单个数据点，反映了每种处理下三个生物重复测样的变化。KEGG功能注释结果（图7a–f）与eggNOG分析趋势一致。ACE、Chao1和Shannon指数在DN和DL处理中较高，而GX和DX处理的这些指数相对较低。PCoA和聚类分析（图7g–h）也表明不同氮源类型在功能水平上导致了群落的显著变化。KEGG功能相对丰度结果表明，与氮代谢、碳代谢和能量代谢相关的途径在DN和DL处理中更为丰富，而GX和DX处理的丰度相对较低。总体而言，低浓度氮的添加，特别是在DN和DL处理中，可以有效增强土壤微生物群落的物种多样性和代谢能力。这些微生物变化可能增强根际氮转化和养分周转，使吸收的氮在48小时内不断从根部分 transported 到地上部分。总之，植物内的氮分配模式受到氮形式、根系生理需求和微生物介导的根际过程的共同调控。这也是为什么不同的氮源会导致作物不同的氮吸收和分配策略的原因。因此，合理调节氮源的类型和应用水平不仅有助于维持土壤微生物多样性，还有助于促进其代谢功能的稳定性和可持续性。3.5. 土壤微生物群落功能不同的氮源和添加水平不仅影响土壤微生物多样性，还会显著改变其功能组成和潜在的代谢能力（图8）。如KEGG注释结果所示（图8a），微生物功能主要集中在代谢上，包括碳代谢、氨基酸代谢、能量代谢以及辅酶和维生素代谢，占总注释基因的很大比例[58]。其次是环境信息处理（如膜 transport 和信号转导）和细胞过程（如细胞运动、细胞生长和细胞死亡）。这些研究表明，土壤微生物群落在维持碳和氮循环及能量流动中起着关键作用[59]。氮肥的应用可以通过调节土壤微生物群落多样性来影响生态系统的多功能性，从而增强土壤碳营养功能和作物生产力[10,60]。图8. 不同处理对土壤微生物群落功能的影响。(a) KEGG通路注释：柱状图显示了不同KEGG功能类别中注释基因的数量，包括代谢、环境信息处理、遗传信息处理、细胞过程、生物系统和辅助活动（AA）；横轴是功能类别，纵轴是注释基因的总数。(b) CAZy功能分类：柱状图显示了核心CAZy家族中注释基因的数量，包括碳水化合物结合模块（CBMs）、碳水化合物酯酶（CEs）、糖苷水解酶（GHs）、糖基转移酶（GTs）和多糖裂解酶（PLs）；横轴是CAZy家族，纵轴是注释基因的总数。(c) eggNOG功能分类：柱状图显示了25个eggNOG功能类别（A–Z）中注释基因的数量，横轴是功能类别代码，纵轴是注释基因的总数；关键功能类别包括C（能量生产和转化）、E（氨基酸运输和代谢）、G（碳水化合物运输和代谢）。所有数据代表三个生物重复测样的总和。CAZy功能分类的结果（图8b）表明，糖苷水解酶（GHs）和糖基转移酶（GTs）是主要功能，其次是多糖裂解酶（PLs）和碳水化合物结合模块（CBMs）。这些功能类群与有机物质分解和多糖代谢密切相关。eggNOG的功能分类结果（图8c）显示，微生物群落功能主要由代谢相关功能主导，包括氨基酸运输和代谢（E）、碳水化合物运输和代谢（G）、能量生产和转化（C）、辅因子和维生素代谢（H）等。此外，信息存储和处理功能如转录（K）和复制与修复（L）也占了一定比例。总体而言，氮的添加显著调节了土壤微生物群落的功能结构，特别是增强了与养分循环、能量代谢和有机质降解相关的功能潜力。3.6. 土壤微生物与土壤理化性质之间的相关性土壤微生物群落结构与土壤理化性质之间的相关性在图9中有所体现。土壤pH值、总氮（TN）、（NH4+-N）和有机碳（OC）是驱动微生物群落结构差异的核心环境因素。不同分类级别的微生物群体对环境因素的反应显示出显著的特异性。p_Acidobacteriota与土壤pH值呈高度显著的正相关（p < 0.001），表明它是最敏感的群体。p_Gemmatimonadota与pH值呈显著正相关（p < 0.01）。p_Pseudomonadota与（NH4+-N）呈显著正相关（p < 0.05）。p_Myxococcota与土壤pH值呈显著正相关（p < 0.05）。p_Bacillota与总氮（TN）呈显著负相关（p < 0.05）。p_Actinomycetota与电导率（EC）呈显著负相关（p < 0.05）。p_Chloroflexota与有机碳（OC）呈显著负相关（p < 0.05）。c_Blastocatellia与土壤pH值呈高度显著正相关（p < 0.01）。c_Gammaproteobacteria与氨氮（NH4+-N）呈显著正相关（p < 0.05）。c_Betaproteobacteria与电导率（EC）呈显著正相关（p < 0.05）。c_Myxococcacia与土壤pH值呈显著正相关（p < 0.05）。c_Thermoleophilia与有机碳（OC）呈高度显著负相关（p < 0.001），表明它是对土壤有机碳反应最强的群体。c_Thermoleophilia和c_Clostridia都与总氮（TN）呈高度显著负相关（p < 0.01）。c_Gammaproteobacteria和c_Terriglobia与土壤pH值呈显著负相关（p < 0.05）。图9. 映射了土壤微生物分类单元与关键土壤理化性质之间皮尔逊相关系数的热图。分析聚焦于门（p_）和纲（c_）级别的优势微生物分类单元，包括Pseudomonadota、Actinomycetota、Acidobacteriota、Candidatus Rokubacteriota、Chloroflexota、Gemmaimonadota、Bacteroidota、Myxococcota和Bacillota以及Gammaproteobacteria、Blastocatellia、Thermoleophilia纲，以及关键的土壤理化性质（电导率 [EC]、pH值、总氮 [TN]、土壤含水量 [SWC] 和氨氮 [NH4+-N]）。横轴列出了测量的土壤理化性质，纵轴列举了微生物分类单元；颜色渐变从蓝到红表示相关系数的大小和方向，范围从-1（强负相关）到1（强正相关）。星号符号表示相关系数的统计显著性，***表示在p ≤ 0.001时高度显著相关，**表示在p ≤ 0.01时显著相关，*表示在p ≤ 0.05时边缘显著或趋势相关；空白单元表示无统计学上的显著相关性（p > 0.05）。该可视化突出了影响Larix olgensis A. Henry幼苗根际土壤中优势微生物群落分布和丰度的关键环境因素。4. 结论本研究阐明了Larix olgensis A. Henry幼苗对氨氮（NH4+-N）、硝态氮（NO3?-N）和尿素的不同利用方式，以及在不同氮添加方式下植物-土壤-微生物氮循环的耦合调节。Larix olgensis幼苗表现出时间依赖的氮吸收和分配策略：NH4+-N在24小时内迅速被吸收并滞留在根部，而NO3?-N和尿素在48小时时优先运输到地上部分，这是由于GS-GOGAT通路介导的根部NH4+-N吸收以及NO3?-N在土壤中的高流动性。不同形式的氮对土壤性质产生针对性影响：高浓度的NaNO3可以缓解土壤酸化并丰富硝酸盐池，低剂量的尿素促进NH4+-N积累，高浓度的NH4Cl可以增强土壤持水能力；适度添加氮可以上调脲酶和硝酸盐还原酶的活性，而低浓度的氮输入（尿素/NH4Cl）显著改善土壤微生物多样性和碳/氮/能量代谢的功能潜力。土壤pH值、总氮（TN）、NH4+-N和有机碳（OC）被确认为微生物群落差异的核心驱动因素，群体在门和纲水平上显示出对土壤理化因素的特定响应。对于中国东北部高氮沉积地区的人工Larix olgensis森林，推荐的实用施肥策略是以1:1的比例结合应用低浓度尿素（10 kg N·hm?2·yr?1）和适量硝酸盐氮（10 kg N·hm?2·yr?1）。这种方案符合幼苗的时间依赖性氮吸收偏好，通过协调根部的NH4+-N吸收和地上部分的NO3?-N运输来提高氮的利用效率；它还保持了土壤微生物多样性和稳定的氮转化能力，减轻了土壤酸化和盐胁迫风险，并减少了氮的淋溶。这种施肥做法可以优化植物-土壤-微生物氮循环的耦合效率，维持土壤肥力，并最终增强Larix olgensis人工森林生态系统的结构稳定性和碳汇功能的可持续性。研究结果为全球氮沉积变化下温带针叶林植物的精确氮管理提供了生理和生态基础。