《Bioelectrochemistry》：Plasma discharge intensity modulates cell death pathways in pulsed electric field-treated Chlorella vulgaris
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等离子体预处理强度通过改变脉冲电场（PEF）引发的微藻细胞死亡机制，导致膜通透性增加与结构保留的分化响应。低强度（130V）下GAD+PEF与单独PEF效果相似，表现为蛋白质（20-24%）和DNA（>20mg/L）大量释放，代谢完全抑制及细胞解体。高强度（≥210V）下，尽管渗透性提升4倍，但抑制了生物大分子外泄（<6%蛋白，<5%DNA），减少caspase-3样活性，维持细胞架构72小时。次级效应（温度、电导率、长寿命活性物种）被排除后，证实直接等离子体-细胞互作或短寿命活性物质驱动了机制分化。
Kamile Jonynaite | Raimonda Celiesiute-Germane | Skirmantas Kersulis | Rolandas Uscila | Zydrunas Kavaliauskas | Mindaugas Aikas | Henri Gerken | Liutauras Marcinauskas | Voitech Stankevic | Arunas Stirke
功能材料与电子学系，立陶宛物理科学与技术研究中心，Savanoriu大道231号，邮编02300，维尔纽斯，立陶宛
摘要
连续的物理处理可以产生与单独处理质量上不同的细胞反应，然而在微藻中调控这种相互作用的原则仍然知之甚少。我们研究了普通小球藻在滑弧放电（GAD）等离子体（供电电压130–250?V）处理后，再经过固定脉冲电场（PEF；25?kV/cm，7?μs）处理的效果。与剂量依赖性的增强效应不同，等离子体强度导致了细胞失活表型的分叉。在低等离子体强度（130?V）下，GAD+PEF与单独使用PEF没有区别，表现为大量大分子的释放（蛋白质占干生物量的20–24%；DNA >20?mg/L）、完全的代谢失活以及与PEF介导的程序性细胞死亡一致的细胞解体。在高等离子体强度（≥210?V）下，GAD+PEF导致膜通透性显著增加（>70%），但大大抑制了大分子的释放（蛋白质<6%；DNA<5%），降低了caspase-3样活性，并在72小时内保持了细胞结构，同时仍然完全抑制了代谢。高强度处理增加了游离氨基酸的释放，表明发生了非caspase途径的蛋白水解。对照实验表明，次级等离子体效应（温度升高、导电性增加以及长寿命H?O?/NO??/NO??的积累）无法解释这种分叉现象，这暗示了等离子体与细胞之间的直接相互作用或短寿命物质的参与。这些发现表明，等离子体的预处理强度可以改变微藻中由PEF引发的细胞死亡反应，从而实现膜的通透性增加而不导致细胞结构崩溃。
引言
细胞对连续物理应激的响应可以揭示应激整合和细胞死亡途径选择的基本原理。当多种能量输入与生物系统相互作用时，根据机械相互作用和细胞处理这些信号的机制，结果可能是叠加的、协同的，或者与单独处理质量上不同。普通小球藻作为研究模型具有优势：其单细胞结构便于进行单细胞分析，具有植物谱系的坚硬细胞壁[1]，[2]，以及文献中详细记录的程序性细胞死亡机制[3]，[4]，[5]。这为评估处理效果提供了一个基准。
脉冲电场（PEF）处理会在细胞膜上产生跨膜电位。超过临界阈值时，它会破坏脂质双层并形成孔洞，允许通常不可渗透的分子通过[6]。在微藻中，参数因物种和目的而异，电场强度范围为5–40?kV/cm，脉冲持续时间从1到1000?μs[7]，[8]。大气压等离子体技术代表了一种独特的应激方式——等离子体不仅直接破坏细胞膜，还会产生活性氧和氮物种（RONS）、电磁场、紫外线辐射和热能[9]，[10]，[11]。在各种等离子体源中，滑弧放电（GAD）产生的“温等离子体”具有高电子密度，能产生复杂的氧化和热应激[11]，[12]。其强度随供电电压变化，提供了一种可控的方式来调节对细胞的生物效应。这些机制上不同的处理方式在连续应用时的相互作用仍是一个未解之谜。
在普通小球藻中，PEF会触发调节性的程序性细胞死亡（PCD）途径，而不仅仅是简单的膜破裂[13]，[14]。处理后立即，细胞对小分子变得通透，但在随后的24–48小时内会出现大分子的释放和细胞解体[14]。Krust等人进一步发现，PEF诱导的通透性使得普通小球藻释放一种可溶的、对蛋白酶敏感的死亡诱导因子，该因子能启动caspase样活性并在未处理的邻近细胞中传播细胞死亡[13]。由于这一过程依赖于主动的生物信号传导而非被动破裂，因此具有内在的可塑性[5]。这为通过利用等离子体产生的RONS来调节PEF引发的细胞死亡提供了机会，这些RONS作为氧化还原信号分子发挥作用，而不仅仅是简单的应激源[15]。
这种结合等离子体和PEF的方法已在包括细菌[16]、食品基质[17]以及各种真核细胞[18]，[19]，[20]，[21]在内的多种生物系统中进行了研究。最深入的机制研究是在哺乳动物癌细胞模型中进行的。通常，这种方法会产生量化的增强效果：膜通透性增加、细胞毒性增强以及caspase活性升高[18]，[19]，[20]，[21]。然而，微藻在膜结构、细胞壁组成和细胞死亡机制上与这些哺乳动物系统有所不同。目前尚未直接研究结合等离子体和PEF处理是否在微藻中产生类似的反应，以及等离子体强度如何影响这些反应。
本研究系统地研究了普通小球藻在GAD等离子体和PEF联合处理下的反应，等离子体放电强度（供电电压130–250?V）逐渐变化，随后进行标准化的PEF处理（25?kV/cm，7?μs）。我们在48小时内监测了细胞的通透性、代谢活动、大分子释放和细胞死亡标志物。为了区分等离子体的直接效应和次要因素，我们开发了独立的实验方案来分离温度效应、导电性变化和长寿命活性物质的贡献。我们的发现揭示了细胞死亡机制中一个意外的等离子体强度依赖性分叉现象：高强度等离子体导致完全的膜通透性增加，但没有物质释放，这种反应与简单的剂量依赖性增强效应不一致。
实验部分
微藻悬浮液
普通小球藻 UTEX 395细胞在以下条件下培养：温度22?±?1?°C，荧光灯提供的光合光子通量密度为90?μmol/m2/s，光照与黑暗周期为16:8?h，并提供CO2和空气-气体混合物。悬浮液培养至第7天达到稳定生长阶段。通过离心（3000?×?g，15?min）将藻类生物量浓缩至5?g/l。生物量浓度通过光学密度（OD）测定。
概述：等离子体放电强度决定了不同的细胞结果
普通小球藻在等离子体和PEF联合处理下产生了两种不同的反应模式，这取决于等离子体放电强度（图2，图3）。在较低的供电电压（Vs?=?130?V）下，联合处理的结果与单独使用PEF相似。细胞表现出渐进的膜通透性增加、大量蛋白质（占干生物量的20–24%）和DNA（>20?mg/L）的释放、代谢活动丧失，以及72小时后可见的细胞解体（图2，图3；SM图2D）。
不同的
讨论
在本研究中，单独使用PEF处理产生的反应与先前描述的普通小球藻中的PEF诱导的细胞死亡一致[13]，[14]。普通小球藻的膜通透性迅速发生，并且在2?小时内与剂量和脉冲强度相关，伴随着caspase-3样活性的升高（比热休克对照组高2.5倍）（图2A和5）。24小时后，藻细胞表现出与程序性细胞死亡一致的标志：代谢不活跃、细胞内化合物（蛋白质、DNA）的释放。
结论
等离子体和PEF联合处理产生了强度依赖性的反应。单独使用PEF会引发程序性细胞死亡，伴随caspase-3样活性、DNA和蛋白质的释放以及细胞解体。当等离子体预处理在130?V进行时，联合处理遵循单独使用PEF的模式。而当等离子体在250?V生成时，反应发生了变化：通透性增加了约4倍并持续存在，同时伴随着完全的代谢丧失——但caspase-3样活性
CRediT作者贡献声明
Kamile Jonynaite：撰写初稿、可视化、验证、研究、数据分析、概念化。Raimonda Celiesiute-Germane：撰写初稿、可视化、研究、数据管理。Skirmantas Kersulis：方法学。Rolandas Uscila：方法学。Zydrunas Kavaliauskas：方法学。Mindaugas Aikas：方法学。Henri Gerken：方法学、概念化。Liutauras Marcinauskas：撰写、审稿与编辑、资源管理、项目协调、资金支持
资助
本工作得到了立陶宛研究委员会（Research Council）的资助，项目编号为P-MIP-22-257。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
