墨西哥金塔纳罗奥州两个Brachionus cf. ibericus（轮虫纲，单巢目）品系的生殖隔离

《Biodiversity Data Journal》：Reproductive isolation in two strains of the marine rotifer Brachionus cf. ibericus (Rotifera, Monogononta) from Quintana Roo, México

　　

在尤卡坦半岛，针对褶皱臂尾轮虫（Brachionus plicatilis）物种复合体（species complex）克隆的繁殖分析尚未开展，该类群具有重要的经济、生态及演化意义。近期研究已鉴定出15个不同的遗传谱系。因此，本研究旨在培养并表征该群体内的克隆，以研究尤卡坦半岛金塔纳罗奥州（Quintana Roo）的生殖隔离（reproductive isolation）。研究人员使用54 μm网目的Wisconsin型浮游动物网（Wisconsin-type zooplankton net）在金塔纳罗奥州东南部和西北部采集样本。浮游动物样本经分离后，置于25°C生物气候培养箱（bioclimatic chamber）中培养，光周期为12 h光照:12 h黑暗。分离后，轮虫投喂密度为1×10⁶ cells ml^-1的Nannochloropsis oculata微藻。经过两个月的实验室条件驯化后，研究人员开展了分类学鉴定、建立单克隆培养、形态学测量（morphometric characterisation）、种群增长测定、休眠卵（resting eggs）孵化率测定以及杂交交配实验（cross-mating experiments）。研究人员从金塔纳罗奥州西北部和部分别获得12个和11个克隆。结果显示，雌体、雄体和休眠卵的产生以及休眠卵孵化率存在差异。研究人员确定了金塔纳罗奥州东南部和西北部的两个不同轮虫品系，由于两区域间存在生殖隔离，因此提出金塔纳罗奥州海岸存在两个种群：Brachionus cf. ibericus "Cancún"品系和"Sian Ka'an"品系。

该研究聚焦于海洋轮虫Brachionus plicatilis物种复合体的生殖隔离与种群结构问题，具有重要的生态学与演化生物学价值。B. plicatilis（轮虫纲，单巢目）长期被视为广布种，分布于盐生水环境中，但实际上是一个隐存物种复合体（cryptic species complex），即形态、生理和生物学行为相似但彼此间存在生殖隔离、因而在系统发育上不同的物种集合。这些物种可共存于同一生态位，因近期物种形成（recent speciation）而被视为姊妹种（sibling species）。目前已知该复合体包含15个物种，其中正式描述的有6种。这些隐存物种的识别最初依赖于两种不同形态生态型——大型（L）和小型（SS）形态型的发现，后续分子标记和生殖隔离实验进一步确认了这些形态型的物种地位，并鉴定出中型（SM）等第三形态型。该复合体在进化历史、生态互作、生态毒理学、渗透调节、有性生殖进化、系统地理学、衰老研究及进化过程等领域具有广泛应用价值。该复合体表现出高度的遗传变异性，遗传距离与地理距离密切相关。物种间的基因交流及空间隔离群体间的杂交取决于扩散能力、同步化繁殖过程及定居种群的存在。有性生殖由食物数量与质量、种群密度和光周期等环境因素诱导。Stelzer和Snell的研究证实，遗传距离较远的复合体成员可相互诱导有性生殖，表明姊妹种间存在杂交可能性；但雄虫对同种雌虫的响应强度高于姊妹种雌虫，这种信号特异性构成了生殖隔离或允许杂交的复杂机制。然而，尤卡坦半岛的B. plicatilis物种复合体尚未得到充分研究，缺乏解释其复杂性的关键生态、生殖、分布和遗传信息。理解该复合体物种和谱系的分布对于物种保护决策至关重要。尤卡坦半岛具有岩溶水文地质系统特征，裂隙、洞穴和天然井（cenotes）众多。坎昆市成立于1974年，近50年来人口和基础设施急剧扩张，领土延伸至1664 km2，导致土地利用变化和对水生生态系统的持续影响；而锡安卡恩生物圈保护区（Sian Ka'an Biosphere Reserve）则于1986年建立，1987年被列入世界遗产名录，致力于保护丰富的动植物多样性，涵盖海滩、天然井、红树林、热带森林和珊瑚礁等生态系统。因此，明确该区域轮虫的生殖隔离和种群结构具有重要科学价值。

研究人员选择金塔纳罗奥州西北部旅游城市坎昆和东南部受保护的锡安卡恩生物圈保护区作为采样点，分别代表旅游影响导致水生生态系统破碎化的区域和重要的水生物种保护生态区。样本采集使用54 μm网目的Wisconsin型浮游生物网，依据Ciros-Pérez等学者的分类学信息进行物种鉴定。研究人员利用光学显微镜和图像采集系统对轮虫进行拍照，基于被甲（lorica）的软硬程度、形状、头孔宽度、背缘棘数量和形状、 sinus形状、背缘叶状突形状和数量、足的数量和形状、胃腺结构及体基部等特征进行鉴定，并绘制代表性克隆的形态图。轮虫培养采用盐度15 g l^-1的人工海水，于25±2°C、12 h:12 h光周期的生物气候培养箱中进行，投喂Nannochloropsis oculata微藻（浓度1×10⁶ cells ml^-1）。经过至少24个月的实验室培养，研究人员建立了稳定的单克隆培养体系。

形态学测量方面，研究人员从两个品系的克隆中分别选取20只雌体、雄体和休眠卵进行测量，包括体长和体宽，以及中、中央和前背棘间距，使用Bouin氏液和福尔马林固定样本。数据分析采用基于排列的多变量方差分析（PERMANOVA）和单因素方差分析（ANOVA），并运用多维标度分析（MDS）评估群体间相似性。种群增长实验在驯化六个月后进行，将5只轮虫置于2 ml培养液中培养4天，统计雌体、雄体和休眠卵总数。休眠卵孵化实验将取自单克隆培养库的休眠卵于4°C黑暗条件下储存15天后，置于24孔培养板中在培养箱内孵化15天，每12小时检查并记录孵化数量。杂交交配实验选取坎昆和锡安卡恩各3个克隆，按体型（小型、中型、大型）分类，将30只雄虫和15只24小时内羽化的雌虫组合，测试18种不同的杂交组合，以48小时后休眠卵产生情况作为主要结果指标。

研究结果显示，所分离的克隆可初步鉴定为Brachionus cf. ibericus，其关键形态学区别在于：坎昆克隆将休眠卵携带于体内，而锡安卡恩克隆将休眠卵携带于体外。研究人员在坎昆获得12个克隆，锡安卡恩获得11个克隆，每个地点均鉴定出三种形态型——坎昆：小型（109–113 μm）、中型（120–141 μm）、大型（160–163 μm）；锡安卡恩：小型（107–135 μm）、中型（143–149 μm）、大型（152–159 μm）。PERMANOVA分析表明不同地区个体大小类别存在显著差异（p < 0.05）。种群增长实验显示，锡安卡恩雌体克隆产生更多雌体，而坎昆克隆产生更多休眠卵；两地点的小型和中型形态型比大型形态型具有更高的繁殖成功率。休眠卵孵化率方面，锡安卡恩小型形态型克隆C8S呈现最高孵化率（75%），坎昆小型形态型克隆C6C孵化率达65%；而大型形态型通常具有最低的孵化率。中型形态型的孵化率均匀性最佳，平均超过50%。

杂交交配实验结果揭示了重要的生殖隔离模式。18种杂交组合中仅7种可育。总体而言，坎昆雄虫无法使锡安卡恩雌虫受精，而锡安卡恩雄虫可使坎昆雌虫受精。特别值得注意的是，所有锡安卡恩雄虫与坎昆雌虫交配时均具生育能力；中型形态型克隆C2S的雄虫能够受精坎昆所有三种形态型雌虫；但小型锡安卡恩雄虫不能使小型坎昆雌虫受精，大型锡安卡恩雄虫也不能使大型坎昆雌虫受精。克隆C2S在杂交中产生大量休眠卵，而大型克隆C4S对坎昆雌虫的受精能力最弱。

讨论部分，研究人员将两个品系置于B. plicatilis物种复合体的框架下进行分析。虽然研究引入了额外的形态型，但其尺寸均在B. plicatilis的SM和SS形态型测量范围内。形态学、生态学、生殖和遗传变异已被用于区分复合体中至少15个物种。种群增长实验中克隆间雌体、雄体和休眠卵数量的变异，暗示了姊妹种的潜在共存乃至地点间的杂交可能性，这种变异受有性生殖选择过程的影响。休眠卵孵化率的差异可能代表了种群在不可预测环境中的生存策略，确保高孵化率和大量休眠卵生产。

该研究强调了水文连通性在岩溶环境中促进轮虫姊妹种相遇、从而实现潜在杂交和基因流的关键作用。坎昆和锡安卡恩品系间表现出独特的形态和生殖特征，存在杂交过程。这与Arroyo-Castro在轮虫Lecane bulla中的发现相呼应，该研究在尤卡坦半岛岩溶生态系统中鉴定了两个形态型和四个谱系，遗传分化达3.1%至16%。休眠卵库代表了轮虫隐存物种化的进化历史，可能是这些生态系统中最重要的种质资源库之一。两个品系在休眠卵大小、形状及携带方式上存在显著差异：坎昆克隆体内携带休眠卵，可能获得被甲提供的额外保护，但产量受限且卵可能死亡；锡安卡恩克隆体外携带休眠卵，产量更高、沉留沉积物的机会增加，但分散潜力降低。坎昆休眠卵平均孵化成功率（44.28%）高于锡安卡恩（27.57%），这可能源于坎昆品系近期物种形成和杂交过程。

基于杂交交配观察，研究人员提出以下解释：锡安卡恩雄虫起源于雌体在体外产生休眠卵的种群，其与坎昆雌虫交配时可诱导产生体内携带休眠卵的雌体；而体内携带休眠卵种群的雄虫无法使体外产生休眠卵种群的雌虫受精。这在一定程度上表明了生殖隔离的存在，提示该区域近期发生了物种形成。中型形态型C2S能够受精坎昆所有形态型，显示其在杂交中的特殊地位；大型克隆C4S的受精能力最弱，表明雄虫体型可能影响受精成功率。

研究人员注意到坎昆品系克隆间，特别是棘和被甲形状方面，存在显著的形态变异，即使在相同实验室培养条件下亦然。除C11C外，所有坎昆克隆均在体内携带休眠卵，这是B. ibericus的特征性态。锡安卡恩的C2S雌体在体内携带休眠卵，其余克隆则在体外携带。由此推测金塔纳罗奥州可能存在B. cf. ibericus的两个变种。这两个种群可能正在经历或已经完成物种形成，但仍存在生物连通性，表明隔离尚不完全。

该现象可能受尤卡坦半岛地质和水文特征影响。Alvarado-Flores等学者分析了尤卡坦半岛轮虫的空间分布，报道了9种Brachionus、3种Keratella和44种Lecane，其中观察到南部小型和北部大型两种形态型。Arroyo-Castro等的研究表明两种不同L. bulla形态型可能共存于同一地理区域——小型分布于金塔纳罗奥州西北部，大型分布于西南部。基于此，研究人员提出第二假说：金塔纳罗奥州东南部和西北部均发生物种形成，区域间存在生物连通性，该地区典型的水文地质差异可能有利于轮虫及其他浮游动物的物种形成。该假说与Suárez-Morales等关于尤卡坦半岛浮游动物的早期研究一致，他们将半岛南部识别为浮游动物的祖先区域，可能是北部其他浮游动物物种的来源地；祖先物种从南部扩散至北部，随时间和空间推移促进物种形成。近期对介形虫的研究也支持这一物种形成过程，揭示了半岛北部和南部介形虫物种间的形态和遗传差异。

研究人员基于证据和结果，提出了尤卡坦半岛浮游动物物种形成的观点。界定和识别区域尺度的生物连通性至关重要，因为尤卡坦半岛受农业和旅游业影响，生态系统正发生改变。保护区域主要位于半岛南部，北部保护区域仅限于沿海地带。海洋物种形成发生于北部沿海地区，涉及B. plicatilis物种复合体及其他浮游动物，而大陆类似区域则不存在此类过程。

该研究分析海洋轮虫B. plicatilis的分布和进化后，识别出两个关键的浮游动物进化事件，并据此构建了概念模型。模型整合了尤卡坦半岛的地质起源背景：约3300万年前第三纪渐新世，B. plicatilis可能已栖息于其海岸；随后中新世半岛西北部开始隆起，轮虫分布随之改变；随着半岛继续生长，轮虫扩散模式进一步改变，至上新世到达东北部和东部；最终第四纪，轮虫定居于现今所知的尤卡坦半岛海岸。B. plicatilis分布于沿海地区，研究检测到的种群仍表现出一定程度的连通性，可能与墨西哥湾的B. plicatilis存在演化关联。Rico-Martínez等和Moha-León等的研究描述了韦拉克鲁斯州沿海泻湖的一个品系，形态测量和遗传分析显示其属于SM形态型（即193.5 μm的B. ibericus和164–231 μm的B. almenara）。因此，分布于墨西哥湾和整个尤卡坦半岛的海洋轮虫物种，特别是Brachionus属，可能存在进化关联，但由于地质时期和地理距离的差异，可能正在经历物种形成。

研究结论：坎昆种群（B. cf. ibericus "Cancún"品系）在体内携带休眠卵，而锡安卡恩种群（B. cf. ibericus "Sian Ka'an"品系）在体外携带休眠卵。形态学分析表明，由于观察到生殖隔离以及种群增长和休眠卵孵化率的差异，这些品系正在经历物种形成。地点间的杂交证实了杂交种的存在，暗示它们可能已被正式认定为不同物种。该研究对种群结构和生殖隔离的探讨，对于该物种复合体的遗传多样性保护至关重要。