综述：去泛素化酶的解码：功能、机制及治疗意义

《Biophysica》：Decoding Deubiquitinases: Roles, Mechanisms, and Therapeutic Implications Ashish Kabra

　　

去泛素化酶，或DUBs，已成为细胞稳态的关键调控因子，协调蛋白质泛素化与去泛素化之间的精细平衡。其多样化功能涵盖从蛋白质周转控制到信号转导通路调节等多个层面，从而影响多种细胞过程，包括DNA损伤修复、细胞凋亡和免疫应答。本综述系统梳理了当前对DUBs的认识，阐明了其结构多样性、催化机制、生理功能及其在人类疾病中的意义。此外，研究人员讨论了在多种病理状态下靶向DUBs的治疗潜力，重点概述了DUB特异性抑制剂开发方面的最新进展与面临的挑战。

1. Introduction

文章首先从泛素-蛋白酶体系统（UPS）切入，指出该系统是维持细胞内蛋白质选择性降解与稳态平衡的核心机制。UPS通过清除不需要或受损蛋白质，保障细胞正常功能，并参与细胞周期进程、信号转导和免疫应答等多种生物学过程。文中进一步概述了泛素化过程的酶学级联机制，即泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）协同作用，将泛素共价连接到底物蛋白上，其中E3决定底物特异性。多聚泛素化蛋白随后被蛋白酶体识别并降解。作者强调，UPS不仅承担蛋白质质量控制功能，还通过选择性降解关键调节蛋白参与细胞生长、分化和凋亡等信号调控；其失衡与肿瘤、神经退行性疾病及免疫相关疾病密切相关。在此基础上，文章引出去泛素化过程，指出去泛素化酶（DUBs）通过切除底物蛋白上的泛素链来精细调节泛素依赖性信号，从而维持细胞平衡，并奠定了全文讨论DUBs分类、功能与疾病意义的理论基础。

2. Structural Diversity and Catalytic Mechanisms of DUBs

本节围绕DUBs的发现历程、结构异质性及催化原理展开。文章指出，早期对细胞内泛素切除活性的研究促成了首批DUBs的鉴定，如泛素C末端水解酶（UCHs）与泛素特异性蛋白酶（USPs）。随着研究扩展，DUBs被主要分为两大类：半胱氨酸蛋白酶型DUBs与金属蛋白酶型DUBs。这一分类依据其催化机制而定，反映出DUB家族在结构与功能上的广泛多样性。

2.1. Cysteine Protease DUBs:

半胱氨酸蛋白酶型DUBs是研究最深入的一类，其催化中心通常由半胱氨酸（Cys）、组氨酸（His）和天冬氨酸（Asp）或天冬酰胺（Asn）构成催化三联体。催化过程中，Cys作为亲核基团与泛素C末端甘氨酸形成瞬时共价中间体，从而促进异肽键水解并释放泛素。作者指出，此类DUBs除催化结构域外，常含有额外的结构域或基序，用于底物识别、酶活调控或蛋白-蛋白相互作用，因此能够精确控制不同长度和不同连接类型的泛素链。文章还提到，由于催化Cys具有反应活性，该类DUBs可受活性氧（ROS）调控。按照氨基酸序列与结构域构型，半胱氨酸蛋白酶型DUBs进一步分为UCH、USP、OTU、MJD、MINDY和ZUFSP六个亚家族。

2.1.1. Ubiquitin C-Terminal Hydrolase (UCH) Family

UCH家族具有保守的UCH结构域，通常约230个氨基酸，呈β-grasp折叠。该家族成员通常更擅长从小肽加合物或蛋白质C末端切除泛素，而非高效处理长链多聚泛素，因此其链连接特异性相对有限。文章列举了UCH-L1、UCH-L3和UCH37等代表成员。UCH-L1主要在神经元中表达，与帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病相关；UCH-L3广泛表达，参与DNA修复、蛋白质周转和细胞周期调控；UCH37则定位于26S蛋白酶体调节复合体，参与蛋白酶体相关调控。该部分强调了UCH家族在神经系统稳态与蛋白降解调控中的重要性。

2.1.2. Ubiquitin-Specific Protease (USP) Family

USP家族以USP结构域为特征，长度一般约350–400个氨基酸，形成典型的“右手样”构象，包括掌状（palm）、指状（fingers）和拇指状（thumb）区域。除催化核心外，USP蛋白通常带有辅助结构域以调节活性和底物特异性。文中重点讨论了USP7、USP8和USP14。USP7可调控p53、PTEN、Mdm2和β-catenin等多种底物，在DNA损伤应答、染色质重塑和蛋白稳态中具有关键作用。USP8调控受体酪氨酸激酶（RTKs）如EGFR的转运与降解，参与细胞增殖和分化。USP14与蛋白酶体相关，通过在底物降解前修剪泛素链来调节降解效率与选择性，从而维持蛋白稳态。该部分显示USP家族在细胞信号调控中的广泛枢纽作用。

2.1.3. Ovarian Tumor (OTU) Family

OTU家族由保守的OTU催化结构域定义，具有中央扭曲β折叠片及周围α螺旋组成的特征折叠。文章强调了OTUD1、OTUD5和OTULIN。OTUD1主要调节先天免疫和NF-κB信号网络，通过作用于关键信号中间体调节免疫反应强度和持续时间。OTUD5又称DUBA，在基因组稳定性与转录调控中具有双重功能，其C末端多个丝氨酸位点可被CK2和ATM等激酶磷酸化，从而增强其酶活性和底物选择性，支持基因毒性应激下的DNA修复与细胞存活。OTULIN则对线性泛素链具有高度特异性，在炎症和免疫信号中具有独特意义。该节突出了OTU家族活性受构象变化和翻译后修饰精密调控的特点。

2.1.4. Machado-Josephin Domain (MJD) Family

MJD家族由约180个氨基酸的Josephin结构域构成，具有混合α/β拓扑结构。代表成员Ataxin-3（ATXN3）是研究该家族的核心模型。文中指出，ATXN3中多聚谷氨酰胺（polyQ）序列扩增可导致蛋白错误折叠与聚集，引发Machado-Joseph病的神经元功能障碍与变性。另一成员Josephin-1（JOSD1）则参与细胞运动、膜动力学与胞吞调控。该部分主要强调MJD家族与神经退行性病理之间的紧密关联。

2.1.5. Motif-Interacting with Ubiquitin Domains (MINDY) Domain Family

MINDY家族的特征在于包含一个或多个泛素结合结构域，可与泛素或泛素样蛋白发生特异相互作用。其结构通常由紧凑排列的α螺旋与β链组成，能够识别泛素疏水表面，实现高亲和力结合。文中提到MINDY-1和MINDY-2是该家族最早鉴定的成员，参与蛋白降解、DNA修复和信号转导等过程，并通过对多种泛素链类型的去泛素化活性广泛影响细胞生理。该家族体现了“泛素识别”与“催化去除”一体化的结构功能耦联特征。

2.1.6. Zinc Finger-Containing Ubiquitin-Specific Protease (ZUFSP) Family

ZUFSP家族是新近表征的一类半胱氨酸DUBs，具有ZUFSP催化结构域和多个泛素结合模块，包括锌指基序及泛素相互作用元件。文章指出，这些辅助结构赋予其对K63连接多聚泛素链的高度特异性。人类成员ZUP1（亦称ZUFSP）在DNA损伤应答中发挥重要作用，通过选择性切除DNA损伤位点的K63连接泛素链，调节修复因子的募集与更新，维持基因组稳定性。该部分强调了ZUFSP在泛素链连接特异性和基因组维护中的独特地位。

2.2. Metalloprotease DUBs:

金属蛋白酶型DUBs不同于半胱氨酸依赖机制，而是依赖Zn²⁺等金属离子催化，主要属于JAMM家族。其催化中，Zn²⁺由组氨酸和天冬氨酸残基配位，激活水分子对异肽键进行亲核攻击。文中依次介绍了若干关键成员：RPN11是26S蛋白酶体19S调节颗粒的组成部分，是与蛋白酶体结构性耦联的DUB，对底物去泛素化及后续降解至关重要；JAB1/CSN5属于COP9信号体，主要通过去除Cullin-RING连接酶（CRLs）上的NEDD8修饰调节蛋白稳定性；AMSH调控内体运输并影响EGFR等膜受体的溶酶体降解命运；BRCC36参与BRCA1-A复合体介导的DNA损伤修复；MYSM1则通过去泛素化组蛋白H2A参与表观遗传调控与免疫系统发育。总体而言，该类DUBs在蛋白质降解、受体运输、染色质调控和DNA修复中具有关键作用。

3. Physiological Functions of DUBs

文章指出，DUBs通过逆转蛋白质泛素化，在多个生理过程中维持细胞稳态。首先，在蛋白质质量控制方面，DUBs可通过切除泛素链挽救部分错误折叠或功能必需蛋白，防止其过早被蛋白酶体降解，例如USP14通过修剪泛素链调节蛋白酶体降解速率，UCHL1则有助于维持神经元突触蛋白稳态。其次，在DNA损伤修复方面，USP1通过去泛素化FANCD2参与Fanconi贫血通路，BRCC36则在DNA损伤位点调控组蛋白泛素化，促进同源重组修复。再次，在细胞信号传导中，CYLD通过移除TRAF2和NEMO上的K63连接泛素链抑制NF-κB通路，A20兼具DUB与E3连接酶活性，可终止炎症信号，USP7则通过调节MDM2与p53轴参与应激反应。此外，在免疫调控中，USP18、OTULIN和USP21分别参与干扰素信号、线性泛素信号及T细胞活化调节。文中还概述了DUBs在自噬、发育与分化中的作用，如USP36参与核仁自噬，ATXN3调控自噬通量，USP9X和OTUB1则分别参与神经发育与TGF-β信号调控。该节体现出DUBs在细胞命运和组织稳态中的广泛生理意义。

4. Dysregulation of DUBs in Human Diseases

本节系统讨论DUBs失调与人类疾病之间的关联。文章指出，DUB活性异常可由基因突变、异常表达或翻译后修饰改变引起，并进一步破坏细胞稳态。在肿瘤中，USP7过表达可稳定MDM2和MDMX，降低p53水平，从而促进白血病、前列腺癌和结直肠癌进展；USP28通过稳定c-Myc和c-Jun等致癌转录因子促进肺癌和结直肠癌；而CYLD作为抑癌因子，其失功能可导致NF-κB通路过度激活并促进皮肤肿瘤和血液系统恶性肿瘤。RPN11的高表达也被认为与乳腺癌相关。在神经退行性疾病中，USP14、UCHL1和ATXN3等DUBs失调可导致错误折叠蛋白积累、polyQ聚集和神经元损伤，参与阿尔茨海默病、帕金森病及脊髓小脑性共济失调3型（SCA3）的发生。免疫与炎症疾病方面，CYLD、A20（TNFAIP3）、USP18和OTULIN等异常可触发慢性炎症、自身免疫和自炎症反应。文章还指出，病毒可利用DUB机制逃避免疫监视，如SARS-CoV-2的PLpro具有去泛素化和去ISGylation活性，HSV的VP1/2削弱STING介导的天然免疫反应，HIV-1则借助USP7促进病毒蛋白稳定。除上述疾病外，USP2、USP10和USP9X等还与代谢及心血管病理有关。整体而言，该节强调DUBs失衡是多系统疾病发生发展的重要分子基础。

5. Therapeutic Targeting of DUBs

文章认为，鉴于DUBs在肿瘤、神经退行性疾病和炎症中的关键作用，其已成为极具前景的治疗靶点。首先，小分子抑制剂是当前研究最广泛的策略。USP7抑制剂FT671和XL177A可破坏MDM2-p53调控，恢复p53抑癌功能；USP30抑制剂则被用于调节线粒体质量控制与线粒体自噬；RPN11抑制剂可抑制蛋白酶体相关去泛素化并诱导癌细胞凋亡。除直接抑制催化位点外，文章还提到别构调节策略，如USP14的IU1和IU1-248，以及USP7的MS-8。其次，蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）可通过诱导DUBs降解实现更持久的功能抑制，USP7和USP28靶向PROTACs已在前临床模型中显示抗肿瘤活性。与之相对，去泛素化酶靶向嵌合体（DUBTACs）则通过招募DUB稳定目标蛋白，例如稳定ΔF508-CFTR、WEE1、AMPK等。文章还介绍了RNA干扰（RNAi）和反义寡核苷酸（ASOs）等RNA层面的抑制策略，以及通过不可逆结合催化Cys实现持续抑制的共价抑制剂，如VLX1570和b-AP15。该节表明，DUBs靶向治疗已从单纯酶抑制逐渐扩展到蛋白降解和蛋白稳定化等多种药理模式。

6. Challenges in Targeting DUBs

尽管DUB靶向治疗前景广阔，但文章指出其临床转化仍面临多重障碍。首先，DUB催化结构域在家族内高度保守，尤其是USP和UCH家族，这使得获得高选择性抑制剂极具挑战，非特异性抑制可能扰乱蛋白稳态、DNA修复和免疫信号。其次，DUBs具有显著的结构复杂性与构象可塑性，其构象会因底物结合、翻译后修饰或蛋白互作而改变，从而降低针对单一构象设计的小分子抑制剂效力。再次，许多DUBs处于多蛋白复合体中，如RPN11位于26S蛋白酶体、JAB1/CSN5位于COP9信号体，这使催化位点可能被部分遮蔽，增加药物进入与结合难度。文章还提到，可逆性抑制往往作用时间有限，疾病状态下可能不足以维持持续疗效，因此共价抑制剂和PROTACs受到重视。此外，耐药性与代偿通路激活也是重要问题，癌细胞可通过上调替代性DUBs或激活相关网络绕开抑制效应。最后，许多DUB抑制剂仍存在药代动力学不足，如溶解度差、代谢稳定性低和体内清除快等。作者因此强调，需要通过结构优化、纳米递送及提高靶点驻留时间等策略改善药物性质。

7. Future Perspectives and Concluding Remarks

在总结部分，文章指出，随着对DUB生物学认识不断加深，其在精准医学和新药研发中的价值日益凸显。结构生物学、高通量筛选和化学生物学的发展正在加速高选择性DUB调节剂的发现。与此同时，蛋白质组学（proteomics）和转录组学（transcriptomics）等组学技术有助于解析DUB底物谱及相互作用网络，从而更全面地认识其生理功能。作者认为，未来研究应更加关注DUBs在特定组织、应激或疾病背景下的情境依赖性功能，以及其与磷酸化、SUMO化等其他翻译后修饰之间的互作关系。总体而言，DUBs是维持细胞稳态不可或缺的调节因子，也是极具潜力的治疗靶标；若能解决底物特异性与抑制剂选择性等关键问题，DUB靶向治疗有望为泛素系统相关疾病带来突破性干预策略。