《Fish & Shellfish Immunology》：Immunoglobulin M response in different intestinal segments of largemouth bass (Micropterus salmoides) following largemouth bass virus (LMBV) infection
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肠道免疫异质性|IgM|病毒感染模型|中性化抗体|鲈鱼（Micropterus salmoides）
王新友|程高峰|孙杰|蔡昌|蒋志浩|林瑞琪|李顺|李莉|赵娟|徐振|孔卫光
中国农业部水产养殖营养与饲料重点实验室、教育部海洋大学渔业学院海水养殖重点实验室，中国青岛，266003
摘要
在硬骨鱼类中，肠道不仅作为主要的营养消化和吸收场所，还是重要的黏膜免疫器官。尽管不同肠道段之间的营养吸收功能异质性已被充分研究，但肠道免疫反应的段特异性特征仍知之甚少，尤其是在黏膜IgM反应方面。在本研究中，我们通过腹腔注射建立了病毒感染模型，发现病毒能够触发大口黑鲈（Micropterus salmoides）肠道中的强烈先天性和适应性免疫反应，并伴随着多种免疫相关基因的显著上调。二次感染引起的IgM反应比初次感染更为强烈，表现为IgM+ B细胞比例显著增加以及LMBV特异性IgM滴度显著升高。此外，LMBV–IgM滴度的上升可能与它们对病毒的特异性中和活性密切相关。值得注意的是，肠道IgM反应表现出明显的段特异性，后肠的IgM反应明显强于前肠和中肠。总体而言，本研究突显了后肠在抗病毒肠道免疫中的关键作用，并为硬骨鱼类黏膜疫苗的开发提供了理论基础。
引言
肠道是鱼类消化系统中表面积最大的部分，是病原体进入的主要门户[1,2]。因此，除了在营养消化和吸收中的重要作用外，肠道还能够发起强烈的免疫反应以清除入侵的病原体[3,4]。与哺乳动物不同，硬骨鱼类缺乏有组织的黏膜相关淋巴结构，导致参与肠道免疫反应的各种免疫细胞分散分布在整个肠道黏膜中[5]。由于免疫细胞在肠道中的分布不均，不同肠道段的免疫反应存在差异[6]。例如，某些硬骨鱼类的后肠含有更多的抗原呈递细胞，可能有助于更有效地激活局部免疫反应[7]。此外，最近的研究表明，后肠的T细胞密度高于前肠和中肠，表明该肠道段的免疫活性较高[8]。然而，关于硬骨鱼类肠道免疫反应的段特异性差异的研究仍然有限。
体液免疫反应是宿主免疫反应的重要组成部分，其中B细胞及其分泌的免疫球蛋白（Igs）起着核心作用。硬骨鱼类肠道免疫反应的空间异质性表明，不同肠道段在Igs反应上可能存在显著差异。到目前为止，已知硬骨鱼类具有三种主要的免疫球蛋白亚型：IgM、IgD和IgT[9]。作为在硬骨鱼类中首次发现的免疫球蛋白，IgM通常以四聚体形式存在[10]。它在体液免疫反应中可执行多种效应功能，包括补体激活、病原体中和和病原体凝集[11]。此外，IgM还被证明可以介导巨噬细胞对细菌病原体的特异性调理和吞噬[12]。相比之下，IgD的免疫功能尚不明确，尽管有证据表明它可能参与维持黏膜稳态[13]。IgT是一种新近发现的免疫球蛋白亚型，被认为专门负责黏膜免疫[14]。在寄生虫感染后，虹鳟鱼的黏膜组织（如肠道和鳃）中观察到IgT浓度显著升高[15,16]。相反，IgM水平的变化似乎仅限于系统循环部分，黏液中的IgM滴度极低或几乎无法检测到[17]。有趣的是，最近的研究表明，鲤鱼的病毒和细菌感染会导致肠道组织中IgM+ B淋巴细胞的显著增殖，并伴随黏液中病原体特异性IgM水平的升高[18,19]。这些发现表明IgM+ B细胞和IgM也可能参与硬骨鱼类的黏膜免疫防御。然而，目前关于硬骨鱼类肠道IgM+ B细胞和IgM反应的研究大多将肠道视为一个功能上均匀的器官，从而忽略了不同肠道段之间免疫反应的差异。
原产于北美的大口黑鲈已成为中国重要的淡水养殖物种[20]。然而，频繁的疾病爆发严重阻碍了其养殖业的发展，其中由LMBV引起的感染最具破坏性[21]。LMBV是一种属于科的二十面体病毒[22]。感染LMBV的大口黑鲈通常会出现皮肤溃疡和肌肉坏死等临床症状[23]。先前的研究表明，使用LMBV重组主要衣壳蛋白进行疫苗接种可以显著提高LMBV特异性抗体滴度并增强对LMBV感染的抵抗力[24]。此外，最近的证据表明，针对LMBV感染的肠道免疫反应可能与IgM有关[25]。阐明LMBV感染引发的肠道体液免疫反应对于黏膜疫苗的开发具有重要意义。然而，相关研究仍然较少。
本研究旨在探讨LMBV感染后大口黑鲈不同肠道段的体液免疫反应，特别关注IgM+ B细胞和IgM反应。结果表明，LMBV感染导致肠道绒毛损伤，并诱导了多种与先天性和适应性免疫相关的基因上调。再次感染后，肠道中观察到LMBV特异性IgM分泌显著增加。值得注意的是，后肠的IgM反应比前肠和中肠更强。此外，肠道黏液中的IgM能够中和病毒，从而保护细胞免受感染。总之，这些结果突显了后肠在肠道免疫防御中的关键作用以及黏膜IgM在抵抗LMBV感染中的重要性，为鱼类黏膜疫苗的开发提供了理论基础。
研究片段
鱼类饲养
大口黑鲈来自中国武汉，在受控的水产养殖条件下饲养。我们每天检查水质，包括温度（28–30°C）、pH值（6.5–8.5）和氧气水平（5–12 mg/L）。所有鱼至少经过两周的适应期，在此期间每天喂食两次商业饲料颗粒。在采样前两天，对照组和感染组都停止了喂食。此外，所有用于实验的健康大口黑鲈
不同肠道段的肠道绒毛形态和免疫细胞分布
在本研究中，我们明确了大口黑鲈前肠、中肠和后肠的解剖位置（图1A）。H&E染色显示，三个肠道段的肌肉厚度相当，而绒毛数量和形态存在显著的区域差异（图1B–E）。具体来说，前肠的绒毛数量最多，且其绒毛长度明显长于其他肠道段。
讨论
在硬骨鱼类的体液免疫中，IgM是主要的免疫球蛋白亚型，在介导病原体中和和凝集过程中起关键作用[28,29]。尽管IgM在系统免疫组织中的功能已被广泛研究，但其在黏膜免疫组织（尤其是肠道）中的反应特征仍相对较少被探索。肠道是病原体进入鱼体的主要门户，其不同部分的结构和功能特化
CRediT作者贡献声明
王新友：数据整理、正式分析、初稿撰写。程高峰：方法学、研究、数据解释。蔡昌：研究、正式分析。蒋志浩：正式分析、方法学。林瑞琪：数据整理。李顺：研究。孔卫光：正式分析、研究、初稿撰写。徐振：资金获取、监督、审稿与编辑。
资助
本研究得到了中国湖北省自然科学基金（2023AFA002）、国家自然科学基金（32225050, U24A20461, 32403046）和武汉市自然科学基金（2024040701010071, 2025041001010361）的财政支持。我们还要感谢中国科学院水生生物学研究所的王岩在流式细胞术方面的宝贵帮助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢中国科学院水生生物学研究所的王岩在流式细胞术分析方面的宝贵帮助。
