《International Journal of Biological Macromolecules》：Site-2 protease-like protein 2 mediates phenol tolerance in Rhodococcus ruber through transcriptomic and functional analyses
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苯酚耐受相关蛋白S2PLP2的功能及机制研究，通过生物信息学、膜定位分析、蛋白表达纯化及互作实验，发现S2PLP2为含HExxH锌结合位点的跨膜金属蛋白酶，其过表达增强苯酚胁迫下细菌生长能力，并调控682个基因表达，涉及外排泵、膜稳定蛋白、氧化应激防御及能量代谢等通路。GST pull-down结合质谱鉴定出316个潜在互作蛋白，其中SPFH/Band7/PHB域蛋白SBP与S2PLP2结合亲和力最强（Kd=625±4.42nM）。
梅芳伟|周树伟|苏玉斌|尚天宇|童晶晶|毕慧敏|匡素芳|彭仁
江西师范大学生命科学学院，南昌，330022，中国
摘要
像酚这样的有机化合物对大多数微生物具有高度毒性，因为它们会破坏膜稳定性和细胞功能。在耐酚的Rhodococcus ruber SD3菌株中，先前发现的一种类似site-2蛋白酶的蛋白质1（S2PLP1）与酚耐受性有关，尽管其机制尚不清楚。通过生物信息学和膜定位分析，我们确定了另一种潜在的类似site-2蛋白酶的蛋白质2（S2PLP2），它是一种疏水性跨膜蛋白，含有保守的HExxH结构（其中H代表组氨酸，E代表谷氨酸，x表示任意氨基酸）和LDG基序、两个peptidase_M50结构域（PFAM02163）以及两个CBS结构域。S2PLP2的异源表达和纯化使得能够生成特异性抗体。Western blot分析显示，在酚胁迫下S2PLP2的表达显著上调。过表达< />基因后，细菌在0.02%和0.04%的酚浓度下生长速率加快。过表达菌株的转录组分析发现了682个上调基因和944个下调基因。关键的上调功能类别包括外排泵、膜稳定蛋白、氧化应激防御系统、蛋白质稳态维持因子和能量代谢途径。为了阐明蛋白质-蛋白质相互作用，我们采用了GST pull-down结合质谱技术，鉴定出了316个潜在的结合伴侣，其中22个是单次跨膜蛋白。值得注意的是，含有SPFH/Band7/PHB结构域的蛋白质（SBP，UniProt ID：A0A098BIA4）与S2PLP2（H68C）的结合亲和力最强，通过微尺度热泳实验测得的Kd值为625 ± 4.42 nM。这些发现为Rhodococcus ruber中S2PLP2的生物学作用提供了新的见解。
引言
酚是一种常见的有机化合物和环境污染物，它通过多种机制发挥毒性并触发多种应激反应。作为一种膜活性化合物，酚通过增加膜的流动性和通透性来破坏膜稳定性，从而导致质子驱动力和细胞稳态的丧失[1]、[2]、[3]。除了膜损伤外，酚还会导致蛋白质变性和错误折叠，从而影响重要的酶功能，进而触发热休克蛋白和分子伴侣蛋白的诱导[4]、[5]、[6]。此外，酚的代谢会产生活性氧（ROS），对蛋白质、脂质和DNA造成氧化损伤，可能引发突变和细胞死亡[7]。在酚胁迫下，响应细胞包膜或氧化应激的替代sigma因子会上调相关基因的表达[8]。
能够在高浓度有毒有机化合物环境中生存的微生物代表了一类独特的极端微生物[9]。这些微生物在恶劣的化学胁迫下仍能保持生存能力，并因其在环境生物修复、生物降解和生物燃料生产中的潜在应用而受到越来越多的关注[10]、[11]、[12]、[13]。Rhodococcus菌对环境胁迫表现出显著的适应性，包括对多种有机化合物的高耐受性[14]、[15]、[16]。它们对酚胁迫的适应性反应包括应激蛋白的上调、膜稳定性的调节以及DNA修复系统的激活[6]、[8]、[17]。R. ruber SD3是工业生物催化和有机化合物富集环境中生物修复的极具吸引力的候选菌株。因此，了解R. ruber SD3如何缓解这些多方面的毒性效应对于阐明其有机化合物耐受机制至关重要。
膜蛋白构成了抵御有机化合物胁迫的第一道防线。有三类功能蛋白驱动微生物的适应：负责排出有机化合物的转运蛋白；检测膜损伤并触发应激反应的信号转导传感器；以及在有机化合物诱导的胁迫下维持能量或营养稳态的代谢酶[18]、[19]、[20]。Site-2蛋白酶（S2P）是一类广泛存在于原核生物和真核生物中的膜整合金属蛋白酶[21]。这些酶在调控的膜内蛋白水解（RIP）中起关键作用，参与信号转导途径和膜稳态[22]。通常，S2P的切割活性依赖于site-1蛋白酶（S1P）的预先切割，使S2P能够对底物进行二次切割[21]、[23]、[24]、[25]。在细菌中，S2P参与了多种适应过程，主要是通过维持细胞膜稳定性[26]。虽然S2P的同源物在模式细菌中调节应激反应，但它们在有机化合物耐受性中的作用以及与转运蛋白、信号蛋白和代谢酶的相互作用仍不清楚。
我们之前的研究在R. ruber SD3中发现了类似S2P的蛋白质1（S2PLP1），它有助于有机化合物的耐受性，这突显了S2P同源物在应激适应中的潜在调控作用[27]、[28]、[29]。最近，我们发现R. ruber SD3还含有另一种新的S2P，即潜在的类似S2P的蛋白质2（S2PLP2），其功能尚未被报道。因此，本研究旨在探讨S2PLP2在R. ruber SD3中在酚胁迫下的功能和可能机制。
菌株和培养
R. ruber SD3或过表达< />的甘油菌株被划线接种在Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，并在35°C下培养48小时。然后，将单个菌落接种到5 mL LB培养基中，在35°C下以200 rpm的速度摇动培养，直到OD595 nm达到1.0，以便后续转移和实验。
R. ruber SD3中S2PLP2蛋白的生物信息学分析
为了研究< />基因及其编码蛋白的功能特征，我们使用了多种生物信息学工具。< />的完整序列
S2PLP2的结构和功能分析
S2P是一种膜内金属蛋白酶，通常由多个嵌入细胞膜的跨膜螺旋组成，它含有一个保守的HExxH结构（H代表组氨酸，E代表谷氨酸，x表示任意氨基酸），该结构作为锌结合位点，负责催化底物跨膜区域的水解[36]、[38]、[39]。使用Jalview 2.11.4.1对R. ruber SD3中的S2PLP2及其同源序列进行比较分析后发现
讨论
R. ruber SD3是一种革兰氏阳性细菌，以其卓越的代谢多样性而闻名，特别是在有机化合物胁迫下降解芳香化合物方面[5]、[14]、[16]。在该菌株中，我们之前发现S2PLP1有助于有机化合物的耐受性[27]、[28]。在这里，我们确定了S2PLP2在R. ruber SD3对酚适应中的作用，并鉴定了与其相互作用的蛋白。
生物信息学分析表明，S2PLP2具有保守的
结论
本研究表明，R. ruber SD3中的一种新的潜在跨膜金属蛋白酶S2PLP2显著增强了细菌对酚胁迫的适应能力。转录组分析显示，其过表达会导致参与外排系统、膜稳定性、氧化应激反应、蛋白质折叠和能量代谢的基因上调。我们进一步通过GST pull-down方法确定了SPFH/Band 7/PHB结构域蛋白（SBP，UniProt: A0A098BIA4）是S2PLP2的直接相互作用蛋白
CRediT作者贡献声明
梅芳伟：研究、数据整理、概念构建、初稿撰写。周树伟：研究、资金获取、正式分析、数据整理。苏玉斌：研究、资金获取、正式分析、数据整理。尚天宇：正式分析、数据整理。匡素芳：方法学设计、正式分析、数据整理、撰写——审稿与编辑。彭仁：监督、资金获取、概念构建、撰写——审稿与编辑。童晶晶：撰写——
伦理批准声明
本研究中的所有动物实验均获得了江西师范大学动物伦理委员会的批准，并按照机构关于实验动物护理和使用的指导原则进行。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：32160011）、江西省教育厅研究生创新基金项目（编号：YC2025-S079）和广州校企合作项目（编号：2024A03J0379）的支持。
