一种多功能DNA酶-纳米酶级联系统，用于葡萄糖代谢重编程及胰腺癌的诊疗

《International Journal of Biological Macromolecules》：A multifunctional DNAzyme-nanozyme cascade system for glucose metabolic reprogramming and theranostics of pancreatic cancer

糖酵解靶向纳米系统通过DNAzyme沉默GLUT1、AuNPs催化葡萄糖消耗及产氧、MnO2释放Mn2+激活DNAzyme并作为MRI对比剂，协同阻断糖代谢并实现治疗监测。

　　

王思宇|吴家雄|张东东|李晓|潘建雄|滕刘勤|孟庆高|庄成凯|徐家辉|陈婷|陈珊珊|林霞辉|洪珊妮

福建医科大学医学影像学院，中国福建省福州市，350122

摘要

为了破坏对胰腺癌（PC）至关重要的糖酵解代谢，我们开发了一种级联放大且针对PC的纳米系统HMAD@EP-XQ2d。该系统整合了用于GLUT1基因沉默的DNA酶、基于AuNPs的纳米酶以发挥催化作用，以及包裹在适配体修饰的红细胞膜中的HMnO₂载体。该系统能够主动靶向CD71过度表达的PC细胞。在肿瘤微环境（TME）中积累后，HMnO₂发生降解，引发一系列治疗效应：释放出的Mn²⁺具有双重功能——它们激活DNA酶以阻断葡萄糖的摄取，并作为磁共振成像（MRI）的造影剂，实现药物输送和积累的实时监测；同时，暴露的金纳米酶表现出类似葡萄糖氧化酶（GOx）的活性来消耗葡萄糖（下游消耗），以及类似过氧化物酶（POD）的活性将生成的H₂O₂转化为细胞毒性羟基自由基（氧化应激）。这种三管齐下的协同攻击机制导致PC细胞出现严重的能量危机。体外和体内研究均证明了其强大的抗肿瘤效果、良好的生物相容性和MRI造影能力。通过将基因沉默、酶催化和成像集成到一个由TME触发的响应系统中，这一一体化诊疗平台为胰腺癌提供了一种新颖的精准代谢干预策略。

引言

胰腺癌（PC）是一种高度恶性的肿瘤，五年生存率仅为12% [1]。早期诊断具有挑战性，大多数患者在发现时已不适合进行根治性手术，而放疗和化疗的效果有限 [2], [3], [4], [5]。PC细胞表现出一种称为“瓦尔堡效应”的代谢重编程，即使在氧气充足的情况下，也优先依赖糖酵解产生ATP以支持快速增殖和转移 [6], [7]。这种现象是由增强葡萄糖摄取和利用的基因突变驱动的，导致葡萄糖依赖性 [8]。这种代谢适应为PC细胞提供了更多的能量，促进了药物耐药性，并有助于免疫逃逸 [9], [10]。因此，针对胰腺癌的代谢途径是一种有前景的治疗策略。

针对癌症代谢的治疗策略主要涉及三种方法：使用PGMI-004 A等小分子直接抑制关键的糖酵解酶 [11]；使用2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）等底物类似物竞争性阻断葡萄糖代谢 [12]；或通过葡萄糖氧化酶等酶通过饥饿疗法耗尽细胞外葡萄糖供应 [13], [14]。更直接的方法是从基因源头上破坏这些途径。在这里，DNA酶作为一种有吸引力的治疗工具应运而生。作为具有催化活性的DNA链，它们具有几个关键优势：可以合理设计以高特异性识别和切割目标mRNA，易于修饰，并且已被证明具有较低的免疫原性 [15], [16]。在PC中，这允许精确靶向如葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）等基因，这些基因通常上调以促进肿瘤生长 [17]。通过工程化DNA酶来沉默GLUT1，可以阻断葡萄糖进入癌细胞的主要途径。尽管前景广阔，但其临床转化目前仍受到稳定性差、被核酸酶降解以及在没有金属辅因子的情况下催化活性低等重大障碍的阻碍 [18]。

为了提升治疗效果，除了简单的基因沉默之外，DNA酶还可以与其他功能性纳米材料结合使用。例如，金纳米颗粒（AuNPs）不仅是载体，还具有纳米酶的酶样特性，可以独立促进代谢重编程治疗 [19], [20]。当两者结合时，会产生强大的协同效应：DNA酶通过沉默GLUT1来阻断葡萄糖摄取（上游阻断），而AuNP的葡萄糖氧化酶样活性同时消耗肿瘤中的可用葡萄糖（下游消耗）。为了使这种双重作用疗法在体内成功应用，必须解决DNA酶的核心弱点。这时，二氧化锰（MnO₂）纳米颗粒就成为一个关键的使能平台。MnO₂作为智能纳米载体，保护整个DNA酶-AuNP结构免受降解 [21]。更重要的是，它被设计为在肿瘤微环境中分解，从而实现两个关键目标：确保治疗载体的精确、靶向释放，并提供必要的锰离子辅因子以显著提升DNA酶的催化活性 [22]。最后，这些锰离子还具有MRI造影剂的功能，允许实时成像和治疗引导 [23], [24]。

有效的代谢干预依赖于一个能够克服多种体内障碍的合理设计的递送系统。为此，我们构建了一个多层纳米平台。首先，模仿红细胞膜（EM）的隐身涂层提供了天然的生物相容性，使系统能够逃避免疫清除并延长其循环半衰期 [25], [26]。为了解决在血流动力学压力下保持这种涂层的完整性问题，研究人员发现添加辅助磷脂DOPC可以增强膜流动性，从而防止药物过早泄漏 [27], [28], [29], [30], [31]。解决了循环问题后，下一个挑战是精确的肿瘤靶向。这是通过用核酸适配体-寡核苷酸功能化载体表面来实现的，这些适配体能够高特异性和亲和力地识别特定的细胞表面分子，同时具有较低的免疫原性 [32], [33], [34]。实际上，我们之前的研究已经证实，用适配体修饰红细胞膜可以实现精确的肿瘤识别 [35], [36]。具体来说，使用适配体XQ2d来主动靶向在PC细胞上过度表达的转铁蛋白受体（CD71）[37]。这种主动靶向机制显著增强了代谢药物在肿瘤组织中的积累，确保了精确的递送。

在这里，我们首先开发了一个集成多功能纳米酶和DNA酶的级联催化系统，旨在实现PC中葡萄糖代谢重编程的精确调控以及一个集成的诊疗平台。如图1A所示，纳米系统HMAD@EP-XQ2d是通过将DNA酶与装饰有AuNP的空心二氧化锰（HMnO₂纳米颗粒结合，然后将其封装在掺有DOPC的红细胞膜（EP）中，并用CD71靶向适配体XQ2d进行功能化而构建的。静脉注射后，该纳米系统通过结合胰腺癌细胞上高度表达的CD71受体优先在肿瘤组织中积累。在酸性的TME中，HM外壳发生降解，引发一系列事件。首先催化内源性H₂O₂产生O₂以缓解缺氧。这种降解还释放出Mn²⁺离子，这些离子作为激活DNA酶的必需辅因子，导致GLUT1 mRNA的切割和葡萄糖摄取的阻断（上游阻断）。同时，释放的AuNPs发挥其催化活性：它们的葡萄糖氧化酶样（GOx样）功能消耗葡萄糖和O₂产生H₂O₂（下游消耗），然后它们的过氧化物酶样（POD样）功能将H₂O₂转化为高毒性的羟基自由基（·OH）（氧化应激）。这种智能纳米系统利用TME触发的释放机制实现协同的三管齐下干预（上游阻断-下游消耗-氧化应激），有效破坏代谢网络，从而增强胰腺癌的治疗效果。

材料

高锰酸钾（KMnO₄）、无水乙醇、（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）、过氧化氢（H₂O₂（30%）、三钠柠檬酸二水合物和柠檬酸一水合物由国药化学试剂有限公司提供。己酸（99%）、三氯化金（HAuCl₄·3H₂O）、三（2-羧基乙基）膦盐酸盐（TCEP）、D(+)-葡萄糖、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）、辣根过氧化物酶（HRP）和三（4,7-二苯基-1,10-菲）钌（II）二氯化物

HMAD@EP-XQ2d的制备和表征

我们首先通过己酸还原高锰酸钾制备了空心二氧化锰（HM）纳米颗粒。透射电子显微镜（TEM）图像显示其具有均匀的、类似红毛丹果的形态和明确的结构（图1A）。随后，通过胺化将金纳米颗粒（AuNPs）固定在HM纳米颗粒上，然后结合硫醇修饰的DNA酶。所得复合物被封装在掺有DOPC的红细胞膜囊泡（EP）中并进一步功能化

结论

总结来说，我们开发了一种集成的复合纳米系统HMAD@EP-XQ2d，它结合了多功能纳米酶的活性和MRI功能。通过红细胞膜涂层提高了系统的生物相容性，而通过XQ2d适配体实现了肿瘤特异性靶向，从而解决了传统纳米载体常见的高系统毒性和脱靶效应问题。在T₁加权MRI引导下，HMAD@EP-XQ2d采用自给自足的级联反应

CRediT作者贡献声明

王思宇：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据管理、概念化。吴家雄：研究、形式分析。张东东：研究。李晓：可视化。潘建雄：研究。滕刘勤：验证。孟庆高：数据管理。庄成凯：研究。徐家辉：研究。陈婷：研究。陈珊珊：研究。林霞辉：撰写——审稿与编辑、监督。洪珊妮：撰写——审稿与编辑

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

我们衷心感谢福建省科技创新联合基金（编号：2025Y9489, 2023Y9273）和福建医科大学科研启动基金（编号：XRCZX2020026）的支持。