《International Journal of Biological Macromolecules》：Design and development of tri-layered functionalized chitin nanocrystals (ChNC) based enzyme membrane system for antifouling and selective production of oligosaccahrides
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绿聚合材料甲壳素纳米晶体（ChNC）经棕榈酸/硬脂酸酰化功能化后，作为催化剂用于多糖水解。采用三明治膜结构设计，上层为长松针纤维多孔膜负载酶，中层为功能化ChNC催化层，底层为微纤纤维素分离膜实现目标产物（低分子量寡糖）的高效分离与抗污性优化。实验表明该体系可稳定运行且无酶失活现象，水通量达2500 L·h?1·m?2，抗生物污性提升5-6倍，并实现产物分子量选择性截留。
Zoheb Karim|Mohd Jahir Khan|Mohammad Jawaid
阿拉伯联合酋长国联合阿拉伯酋长国大学（UAEU）工程学院化学与石油工程系，阿尔艾因，阿拉伯联合酋长国
摘要
在这项研究中，研究人员分离出了一种基于生物的绿色聚合物——高表面积（370平方米/克）的几丁质纳米晶体（ChNC），并通过酰基化抗污剂（棕榈酸和硬脂酸）对其进行了功能化处理，然后将其用作水解反应的催化剂。为了限制酶的活性，研究人员采用包埋法将葡聚糖酶固定化，随后通过共价交联进一步处理。在这一阶段，引入了一种新型的酶膜反应器（EMR），该反应器具有三层膜结构。最上层是长松纤维（LPF）多孔膜，用于固定酶；中间层是功能化的ChNC（ChNC-PA/SA-E）膜，用于催化多糖的水解；最底层是微纤化纤维素（MFC）分离膜，用于从低分子量和高分子量的寡糖混合物中选择性分离产物（寡糖）。所制备膜材料的孔径分布范围为0.1至30微米，其致密度顺序为：ChNC-PA/SA-E > MFC分离膜 > LPF多孔膜。LPF多孔膜的水渗透率非常高，约为2500升/小时·平方米；原始MFC膜的水渗透率为约600升/小时·平方米；而功能化的ChNC负载膜的水渗透率较低（<500升/小时·平方米）。此外，与原始MFC分离膜相比，接枝PA和SA后，接触角增加了5至6倍，BSA的排斥率提高了3倍。
引言
酶膜反应器（EMR）结合了酶催化和膜分离技术[1]。该反应器作为一个接触器，将含有催化剂的反应介质与另一个腔室分隔开来。科学界对绿色催化系统的推动使得EMR在分子选择性分离方面更具应用价值[2][3][4]。此外，该系统还能防止有害副产物的产生[5]，但同时也存在催化活性低、酶易失活、表面难以改性以进行有效功能化等缺点[2]。
通过将酶固定在固体载体上，可以克服EMR的主要缺点[4]。为了提高EMR的效率和产量，专家们正在努力将酶系统更有效地整合到膜分离系统中，使膜在运行过程中能够稳定地承载负载的酶。通过分离膜，可以实现分子连续生物转化成低分子量产物[6]。然而，这类EMR面临的最大问题是中间产物的大量生成。例如，葡聚糖酶可以水解高分子量的多糖（100千道尔顿）生成麦芽糖（342道尔顿），但这种快速过度聚合过程难以控制。而且，低分子量产物在食品和健康产业中的价值较低[7]。
因此，最佳的处理方法是直接将高分子量多糖转化为中等分子量的寡糖，避免任何操作障碍和产物溢出。已有研究表明，可以在膜上固定多种酶以实现寡糖的选择性生产，例如多巴胺[8]、单宁酸和3-氨基丙基三乙氧基硅烷[9]等。此外，碳纳米管（CNTs）[10]和磁性纳米颗粒[11]等3D材料也被用于酶的固定。一些已发表的研究[12]还报道了在改性纤维素静电纺丝膜上固定胆固醇氧化酶以实现寡糖的选择性生产。
研究还指出，污染是EMR运行中的另一个主要问题。例如，Shao等人[13]报告称，连续运行EMR会导致产物产量（以毫克计的糖浓度）下降。催化产物在分离膜孔内的结合可能是产量低的主要原因[14]。文献中关于材料/纳米材料“表面功能化（SF）”的方法非常有限，这表明了膜的抗污染性能。在一项研究中[15]，通过涂层在纳米颗粒上引入了硫醇基团；随后使用戊二醛进行共价固定，以制造抗污染表面[16]。
我们团队多年来一直致力于表面功能化研究。在已发表的文章中，我们使用微纤化纤维素（MFC）引入了多种极性和非极性功能基团[17][18][19][20][21]。其中一项研究报道了“化学-酶法功能化”的概念，即先对MFC进行磷酸化（单体上的C6位），再通过酯化反应在C2和C3位连接脂肪酸。功能化的分离膜在抗污染性能和减少牛血清白蛋白（BSA）吸附方面表现出优异效果（吸附量<1毫克，而参考膜为>4毫克）[21]。
寻找具有天然抗污染特性的生物纳米聚合物是一个挑战。但有研究表明，几丁质纳米晶体（ChNC）本身具有抗污染性能。在一项研究中[22]，纤维素醋酸酯膜表面涂覆了ChNC，结果表明这种层状膜显著降低了生物污染和生物膜的形成，并提高了对BSA和腐殖酸溶液的抗污染能力[12][22]。此外，ChNC的高表面积（370平方米/克）为酶的固定提供了丰富的功能基团。ChNC还具有其他独特性质，如高长宽比（>100）、结晶度（82–95%）、拉伸强度（300–400兆帕）、弹性模量（9–13吉帕）以及低ζ电位（-35毫伏），使其成为酶固定的理想候选材料[23][24][25]。ChNC在干燥后仍能形成稳定的多孔网络，使其成为生物催化负载的理想选择[13][24]。因此，选择了ChNC作为活性生物纳米聚合物，并进一步对其进行功能化处理，以实现高酶负载量和抗污染性能。
本研究采用了一种现代方法，确保EMR高效运行且不受污染的严重影响。ChNC通过棕榈酸（PA）和硬脂酸（SA）进行功能化处理，这两种脂质均使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）系统进行接枝。为了进一步提高效果，进行了浓度依赖的功能化处理，同时保持了系统的均匀性和尺寸稳定性。随后，该系统还被用于固定葡聚糖酶。酶的选择性固定（靠近分离膜）实现了高酶负载量。
此外，EMR的三层结构使其在寡糖的选择性生产方面具有独特优势。首先，选择了在干燥过程中具有合适孔径分布的MFC来制备分离膜；MFC的天然特性使其在酶催化后能够有效分离寡糖。其次，表面修饰后的ChNC（接枝了PA和SA）被负载在MFC分离膜上，这对EMR运行过程中的抗污染性能有直接影响。最后，制备的长松纤维多孔膜使负载的酶更加稳定和活跃，从而提升了催化效率。这种多孔载体对多糖的流动（宽孔径分布）没有影响。因此，本研究展示了三层EMR系统在高效生产稳定分子量寡糖方面的潜力，为优化酶固定策略和膜选择提供了借鉴。
材料
高质量MFC（Exilva P 01-V）购自挪威的Borregaard AB公司。MFC的电荷密度为28.54±4.09微摩尔/克，干燥度为9.3%（重量百分比）[19]。蟹壳几丁质、盐酸、透析袋、葡聚糖（DXT 70 K，分子量70千道尔顿）、葡聚糖酶、麦芽糖、棕榈酸、硬脂酸、葡萄糖、牛血清白蛋白、Bradford试剂、多糖、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）、genipin以及其他所有化学品均购自美国的Sigma Aldrich公司。
光谱分析
使用Veeco公司的Atomic Force Microscopy Nnaoscope V（共振频率70 KHz，弹簧常数1-5牛顿/米）分析了分离出的ChNC的纳米-微观形态。所有引入的功能基团均通过傅里叶变换红外光谱（FTIR，varian 670-IR-FTIR光谱仪）进行了检测。修改后的变化也通过红外光谱进行了测量。ChNC的分离、功能化和表征
图2a显示了分离良好且分散均匀的ChNC。图2b中的AFM图像显示ChNC呈典型的棒状形态，直径约为10–30纳米，长度接近400纳米。这些结果与其他关于几丁质纳米晶体尺寸的已发表数据一致[23]。分离出的ChNC的形态也通过扫描电子显微镜（SEM）进行了分析，相关图像（图S1）见支持信息部分。
结论
本研究的所有结果表明，所设计的EMR系统非常出色。最底层的MFC分离膜在寡糖的选择性分离方面表现出优异性能；第二层负载的功能化ChNC层有效防止了产物污染；接枝在ChNC上的脂肪酸使得EMR运行更加平稳，并具有出色的抗污染性能。
作者贡献声明
Zoheb Karim：可视化、软件开发、方法设计、实验研究、数据分析、概念构建、初稿撰写。Mohd Jahir Khan：软件开发、资源协调、项目管理、数据管理。Mohammad Jawaid：结果验证、资源支持、文章修订与编辑。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢阿拉伯联合酋长国通过基金代码12R287资助了这项工作。
M.J Khan还获得了泰国玛希隆大学国际关系办公室提供的2025财政年度国际博士后奖学金。
