Structural determinants for the monomeric and phospholipid-transport P4B-ATPase via comprehensive in silico analysis of P4-ATPase structures

《Biochemistry and Cell Biology》：Structural determinants for the monomeric and phospholipid-transport P4B-ATPase via comprehensive in silico analysis of P4-ATPase structures

　　

P4-ATP酶家族是一类磷脂翻转酶，在维持膜不对称性、细胞蛋白运输和真核生物稳态中起着关键作用。已有多种磷脂翻转酶的结构得到解析，并对其底物转运特性进行了广泛的生化表征。然而，一个重要的单体磷脂翻转酶亚家族——P4B-ATP酶，仍有待深入表征。虽然P4B-ATP酶在脂质转运特性上似乎与其异源二聚体对应物P4A-ATP酶相似，但其作为单体进行底物转运的分子基础目前尚不清楚。在本研究中，研究人员通过基于结构的序列保守性分析，研究了P4B-ATP酶与其他P型ATP酶的差异。结果表明，在P4B-ATP酶中，底物转运通路关键残基附近存在保守和非保守的口袋与路径。P4B-ATP酶还表现出一个不变脯氨酸与一个保守的TM1-2芳香族簇之间的独特相互作用，分子动力学模拟证实了该保守芳香簇与磷脂和胆固醇的相互作用。研究人员观察到一个关键的TM6残基朝向一个保守的P4B通路，其功能目前未知但却是疾病突变热点，这表明P4B-ATP酶可能具有新颖的转运和/或调节机制。本研究结果为对这一必需的单体磷脂翻转酶亚家族开展进一步研究提供了分子框架。

一、 研究背景与目的

P型ATP酶是真核和原核生物中一个庞大且必需的膜转运蛋白家族。其中，P4-ATP酶亚家族（磷脂翻转酶）通过水解ATP驱动磷脂分子在生物膜脂双层中的跨膜翻转，从而维持膜磷脂分布的不对称性，该过程对蛋白质运输、细胞信号转导和整体稳态至关重要。近年来，随着冷冻电镜等技术发展，对异源二聚体型P4A-ATP酶（如Drs2， 与β亚基CDC50形成复合物）的结构与功能机制已有较多了解。然而，另一个重要的亚家族——单体P4B-ATP酶（如酵母的Neo1、人类的ATP9A/ATP9B）的生化与结构表征则远不充分。尽管P4B-ATP酶能够转运与P4A亚家族相似的底物（如磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酰肌醇-4-磷酸PI4P），但其作为单体蛋白，如何实现与异源二聚体类似的功能，其结构基础和分子机制仍是未解之谜。此外，P4B-ATP酶在细胞发育、细胞内运输（如ER-Golgi运输、内体循环）以及多种疾病（如神经发育障碍、肝细胞癌）中扮演关键角色，其功能缺失通常是致死性的。因此，系统比较P4A与P4B-ATP酶在结构和功能关键位点上的异同，对于理解单体翻转酶的工作原理、亚家族功能分化及疾病机理至关重要。

本研究旨在通过结合序列保守性分析和现有结构数据（包括实验结构与AlphaFold预测模型），系统性地鉴定P4B-ATP酶在底物转运通路上的独特结构特征，并与已知的P4A-ATP酶结构进行对比，以揭示单体P4B-ATP酶实现磷脂转运的可能分子基础，为未来深入的机理研究和疾病干预提供框架。

二、 主要技术方法概述

研究人员采用了多种计算生物学和生物信息学方法进行研究。首先，他们从UniProt获取了代表性P型ATP酶的序列，并利用ClustalOmega进行了序列比对和同源性分析，生成了进化树和同源性热图。其次，为了获得结构上可比对的数据集，研究使用了AlphaFold模型以及已解析的P型ATP酶结构。通过PROMALS3D生成了结构指导的多重序列比对，以识别P4A、P4B和整个P型ATP酶家族中的保守残基。然后，研究人员将P型ATP酶与配体结合的冷冻电镜结构导入ChimeraX，利用Contacts工具识别了与配体相互作用的残基。此外，为了探究P4B-ATP酶与膜脂的相互作用，研究对Neo1（PDB ID: 7RD8）进行了粗粒度分子动力学（CG-MD）模拟。蛋白被嵌入到模拟的高尔基体异质膜模型中，使用GROMACS2021.4软件和MARTINI2.2力场进行了总计6.25微秒的模拟，以分析磷脂和胆固醇在蛋白附近的分布和停留时间。

三、 研究结果与发现

1. P型ATP酶转运蛋白中不变脯氨酸的微环境

通过比较P4A-和P4B-ATP酶的结构，研究人员发现了一个关键差异区域。在P4A-ATP酶中，TM4上PISL基序（在所有P型ATP酶中保守）中的脯氨酸朝向一个由TM5 FFKY(N/S)基序和保守的TM6天冬酰胺形成的“脯氨酸口袋”（Proline Pocket），这对底物选择性、结合和稳定以及启动去磷酸化至关重要。N1050形成的口袋（PDB: 6PSX），而P4B-ATP酶如Neo1（PDB: 7RD6）和ATP9A（PDB: 9VDN）显示这个脯氨酸完全远离这个口袋。(C) 在底物结合后，Drs2-PS（PDB: 7OH6）和Neo1-PI4P（PDB: 9BS1）结构显示出相似的脯氨酸口袋取向，而ATP9A-PL（推定的PS）（PDB: 9VDK）部分形成了这个口袋，尽管同源位点S881朝向口袋外。值得注意的是，P4B-ATP酶中高度保守的残基ATP9A^T882朝向这个口袋，更接近磷脂底物。">

然而，在P4B-ATP酶中，这个脯氨酸朝向完全不同的方向，并且TM5的基序变为VMHRG，TM6的对应残基是丙氨酸或丝氨酸。最近ATP9A的冷冻电镜结构显示，VMHRG基序中的精氨酸直接参与磷脂酰丝氨酸（PS）的配位，这与P4A-ATP酶中仅起稳定作用的FFKY(N/S)基序中的赖氨酸不同。这表明P4A和P4B-ATP酶可能采用不同的结构策略来处理相同底物。

2. 用于脂质-转运蛋白相互作用的保守芳香族通道（Conserved Aromatic Aisle for lipid–transporter interaction）

在P4B-ATP酶中，TM4的脯氨酸并非指向上述脯氨酸口袋，而是指向一个先前未识别的TM1芳香族通道。这是一个在所有P4-ATP酶中保守的苯丙氨酸或酪氨酸阵列。在Neo1中，这个脯氨酸的头部被芳香族通道的两个残基（Neo1^Y201和F²⁰²）“夹”在中间。这个芳香族通道还包含两个推定的胆固醇感应基序。先前的突变研究表明，这些芳香族残基在形成疏水门、调节底物特异性及转运中起关键作用。Y222与不变的脯氨酸形成了一个P4B-ATP酶特有的口袋。(D) 在ATP9A结合磷脂的状态下，这个口袋坍塌，脯氨酸转而朝向底物而非口袋。">

为验证其功能，研究人员对Neo1进行了粗粒度分子动力学模拟。结果显示，棕榈酰-油酰磷脂酰肌醇（POPI）和胆固醇分子在芳香族通道区域表现出更长的停留时间，而已知的底物脂质如PS和PE在跨膜区的停留时间较短。这表明POPI和胆固醇等脂质可能与这些跨膜螺旋在底物转运周期中保持结合。

3. P4B-ATP酶独有的保守特征

除了芳香族通道，P4B-ATP酶的脯氨酸周围还被额外的芳香族残基（如Neo1^F196、Y¹⁹⁸、Y²²²）包围，这在P4A-ATP酶中不存在。功能研究表明，这些残基对P4B-ATP酶的折叠和功能至关重要。例如，Neo1^Y222S突变是存活的，但对应的P4A-ATP酶 Dnf1的S243Y突变却赋予了新的PS转运能力。而Neo1^Y222S/S452Q双突变是致死的，证实了脯氨酸附近形成的口袋对P4B的功能必不可少。同源口袋在ATP9A的闭合状态（无底物）中存在，但在结合磷脂的开放状态中消失，表明此口袋是底物结合前所需的。

另一个关键差异在于TM6残基的取向。在P4A-ATP酶中，关键的TM6天冬酰胺（如Drs2^N1050）直接朝向底物。而在P4B-ATP酶中，同源残基（如ATP9A^S881）在底物结合状态下远离底物，转而朝向一个位于TM5、TM7和TM8之间的保守通路。这个通路的功能未知，但却是多种疾病（如进行性家族性肝内胆汁淤积症1型、帕金森病）的突变热点区域。N1050 朝向这个通路，与是否结合底物无关。而P4B同源残基的取向则更为复杂，Neo1-PI4P与Neo1-E2P状态无差异，而ATP9A-PS则显示同源残基S881的位置和取向发生了变化。(E) 尽管存在底物诱导的ATP9A^S881取向变化，结构检查发现，在底物结合后，这个残基远离底物并朝向这个通路。">

此外，这个TM5/7/8界面也与β亚基（CDC50）的结合、正确的膜定位以及多种底物和调节性脂质（如磷酸肌醇）的结合有关。MD模拟也支持POPI在TMH7和TMH10附近有相互作用。因此，这个保守的TM5/7/8界面是一个关键的多功能枢纽，整合了疾病相关突变、亚基折叠与稳定性以及底物和调节性脂质的结合。

四、 讨论与结论总结

讨论总结：

本研究通过整合P4-ATP酶的多种已解析结构和基于序列的分析方法，揭示了P4B亚家族的独特特征。尽管P4A-和P4B-ATP酶具有可重叠的核心结构并转运相似底物，但单体P4B亚家族在脂质配位和门控等关键步骤上进化出了不同的结构解决方案。研究鉴定出的P4B特异性变体，特别是围绕关键脯氨酸的独特微环境、TM1芳香族通道以及TM5/7/8通路，为未来机理研究提供了明确靶点。这些发现表明，P4B-ATP酶可能用特化的芳香族结构替代了P4A-ATP酶的静电门控机制。理解这两个亚家族在处理相同底物上的分化，将有助于阐明它们生理功能的分化，并为相关疾病（如PFIC）的治疗策略提供指导。此外，研究还观察到在某些P4-ATP酶（如Dnf3, ATP8B3）中保守残基存在更高频率的替换，暗示了功能分化。对膜组成（如胆固醇）可能变构调节不同P4-ATP酶的推测，也值得通过系统突变和重建体系实验进一步验证。

研究结论翻译：

总而言之，我们的综合分析表明，尽管P4A-和P4B-ATP酶共享一个可重叠的核心结构并转运相似的底物，但单体P4B亚家族在脂质配位和门控的关键步骤上已进化出不同的结构解决方案。本文所鉴定的保守基序和P4B特异性变异为这些必需膜转运蛋白的未来机理研究和结构-功能分析提供了一个框架。通过将这些发现与生化和结构方法相结合，我们可以增进对P4B-ATP酶如何实现脂质翻转以及其功能障碍如何导致人类疾病的理解。