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本研究针对现有体外肝模型难以模拟生理性胆汁流动及肝-胆连接（Hepatobiliary Junction）功能的瓶颈，构建了基于成人肝细胞与胆管细胞的3D多细胞球体模型（aHBOs）。该模型成功再现了胆汁从肝细胞胆小管（Canaliculi）向胆管样结构（Ductule）的定向转运，并结合缺氧-复氧（H/R）干预，揭示了移植相关缺血损伤中肝细胞功能可逆性抑制与胆管细胞选择性死亡的不同步病理机制，为胆道疾病的药物筛选提供了高表型相关性的体外平台。
背景：肝脏的“下水道”工程与体外模型的缺失
肝脏是人体最复杂的代谢器官，其中胆汁的合成与排泄是其核心功能之一。在生理状态下，肝细胞（Hepatocytes）将胆汁酸排入细胞间形成的微小管道——胆小管（Bile Canaliculi），这些胆汁再通过肝-胆连接（Hepatobiliary Junction，即Hering管）汇入由胆管细胞（Cholangiocytes）衬里的胆管树，最终排出肝脏。这一过程高度依赖肝细胞与胆管细胞之间的结构连接与功能协同，任何环节的堵塞都会导致胆汁淤积（Cholestasis），这是肝移植失败和多种肝病的重要原因。
然而，在实验室研究中，这一关键结构一直难以“复刻”。传统的2D肝细胞培养或单一的肝类器官（Organoid）虽然能产生胆汁，但缺乏胆管结构，导致胆汁“有进无出”，无法模拟真实的生理流动。尽管近年来胆管类器官技术取得进展，但缺乏上游肝细胞的胆汁供应，使其功能研究受限。因此，构建一个包含功能性肝-胆连接的人源3D模型，成为研究胆道疾病机制和药物筛选的迫切需求。
技术方法概览
本研究建立了一套高通量的3D球体培养与表型分析体系：
- 1.
细胞来源与构建：利用原代成人肝细胞（Primary human hepatocytes）、成人肝内胆管细胞（源自活检组织建立的类器官）及小鼠成纤维细胞，按特定比例（2:2:1）自组装成成人肝-胆类器官（aHBOs）。
- 2.
功能与病理评估：采用荧光胆汁酸类似物（CLF） 示踪技术，结合AI图像分析，定量评估胆汁流动动力学；并建立缺氧-复氧（H/R） 模型模拟移植中的缺血损伤。
- 3.
结构验证：通过扫描透射电镜（STEM） 和3D共聚焦成像确认胆小管与胆管样结构的超微形态。
研究结果解析
1. 构建具有极性功能的肝细胞球体（Biaggregates）
研究人员首先在无胆管细胞的情况下，优化了由人肝细胞和成纤维细胞组成的双聚体球体（Biaggregate spheroids）培养条件。他们发现，在添加EGF等因子的特定培养基中，球体内的肝细胞能高度极化，形成典型的F-actin环绕的胆小管网状结构。通过电镜和免疫荧光证实，关键转运蛋白BSEP和MRP2定位于胆小管膜上。更重要的是，利用CLF荧光示踪技术，他们直观地捕捉到了胆汁酸被主动摄取并分泌到胆小管腔内的过程，且这一功能随培养时间（至8天）逐渐增强，表明模型具有成熟的胆汁排泄功能。
2. 成功组装功能性肝-胆类器官（aHBOs）
在此基础上，研究人员引入了第三类细胞——人肝内胆管细胞，构建了三聚体aHBOs。结构分析显示，aHBOs中同时存在CK7阳性的胆管样结构和白蛋白阳性的肝细胞区域，且两者之间形成了F-actin标记的连续连接，酷似体内的Hering管。最令人兴奋的功能证据来自CLF实时成像：在aHBOs中，CLF首先在肝细胞胆小管中积聚，随后定向排入相连的胆管样结构中，并随时间推移在胆管腔内持续富集。这一过程完美模拟了生理性胆汁流动，是体外模型构建的重大突破。
3. 揭示缺氧-复氧损伤的细胞特异性机制
利用该模型，团队模拟了肝移植过程中常见的缺氧-复氧（H/R）损伤。结果发现，肝细胞和胆管细胞对H/R的响应存在显著差异：
- •
肝细胞：在缺氧期，其胆小管功能（CLF排泄）出现可逆性下降，但在复氧后能迅速恢复，细胞死亡率较低。
- •
胆管细胞：在缺氧期表现相对耐受，但在复氧期却发生了选择性死亡，导致胆管结构破坏和胆汁流动中断。
这一发现揭示了移植后胆道功能障碍（如缺血性胆管病变）的可能机制：并非缺氧本身，而是复氧过程中的再灌注损伤特异性攻击了胆管细胞，而肝细胞具备更强的修复能力。
结论与意义
本研究成功构建了首个基于成人源细胞的3D功能性肝-胆连接模型（aHBOs），该模型不仅再现了生理性的胆汁流动，更成为了研究胆道病理的“显微镜”。通过模拟缺氧-复氧损伤，研究揭示了胆管细胞在复氧阶段的脆弱性，为理解移植后胆道并发症提供了新的病理生理学解释。该平台具有高通量、人源化、表型真实等特点，未来有望广泛应用于胆道疾病（如原发性硬化性胆管炎PSC）的机制研究、药物毒性筛选及再生医学领域，为开发保护胆管功能的疗法提供了强大的体外工具。
