《Journal of Colloid and Interface Science》：π–π-Anchored sorafenib on carbon black as a stable molecular redox electrocatalyst for thiol oxidation and point-of-care sensing in cancer cells
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本研究开发了一种基于碳黑电极的索拉非尼表面修饰系统，通过电化学固定形成稳定双巯基结构（SF-NH-NH-SF），实现了低电位（-0.1V vs Ag/AgCl）高效氧化还原信号介导。该系统检测巯基灵敏度达0.96μA/μM，检测限2μM，并成功用于HCT116癌细胞内还原型巯基的实时监测，为药物-生物分子相互作用研究提供了新方法。
Kondusamy Vignesh|Ayyakannu Arumugam Napoleon|Subhajit Sarkar|Kavitha Thirumurugan|Annamalai Senthil Kumar
纳米与生物电化学研究实验室，二氧化碳研究与绿色技术中心，维洛尔理工学院，维洛尔 632 014，印度
摘要
索拉非尼（SF）是一种一线靶向治疗肝细胞癌的药物，它通过与自由巯基团的相互作用调节氧化还原过程来诱导肿瘤细胞死亡。将这些氧化还原活性分子固定在电极表面为实时监测巯基化学提供了强大的平台，这对生物医学诊断具有重要意义。在这项研究中，我们开发了一种原位电化学策略，将SF功能化为一种表面限定的氧化还原活性物质（CB@SF-Redox），并将其应用于碳黑（CB）修饰的电极上。所得到的界面显示出明确的形式电位（E0 ≈ 0.1 V vs Ag/AgCl）和高表面覆盖率（Γ ≈ 16 nmol cm?2）。SF与CB的石墨结构之间的强π–π相互作用促进了其稳定的固定。原位电化学石英晶体微天平（EQCM）和高分辨率质谱（HR-MS）证实了在电化学过程中形成了二聚体中间体（SF-NH-NH-SF）。电化学研究表明，CB@SF-Redox界面在非常低的电位（约?0.1 V vs Ag/AgCl）下有效地介导了巯基的氧化和还原，这一电位比大多数报道的电催化剂低300–1000 mV。该平台进一步被用于即时检测，采用三合一丝印电极和单滴样品方法，实现了2 μM的检测限和0.96 μA μM?1
引言
癌症仍然是全球主要的死亡原因之一，其特征是细胞增殖失控、代谢重编程以及细胞氧化还原稳态的破坏[1]、[2]。在当前的治疗策略中，如酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）等靶向药物通过选择性调节参与肿瘤生长和血管生成的信号通路，显著推进了癌症治疗[3]。索拉非尼（SF）是一种临床批准的肝细胞癌TKI，通过抑制RAF激酶和受体酪氨酸激酶（包括VEGFR和PDGFR）来发挥抗癌作用，从而抑制肿瘤进展[4]、[5]。除了其在信号抑制方面的传统作用外，新的证据表明SF还通过诱导活性氧（ROS）来扰乱细胞内氧化还原平衡，导致氧化应激介导的细胞毒性[6]。作为响应，癌细胞增强了含巯基抗氧化剂（如半胱氨酸（CySH）和谷胱甘肽（GSH）的产生，这些抗氧化剂对于维持氧化还原稳态和防止氧化损伤至关重要[7]、[8]。细胞内巯基水平的升高常与药物耐药性相关，因为这些分子可以与亲电或氧化还原活性药物分子发生化学反应并中和它们[9]、[10]。因此，SF与含巯基生物分子之间的化学相互作用是其作用机制和治疗效果的一个关键但尚未充分探索的方面。同时，在细胞内系统中，还原型（R-SH）与氧化型（R-S-S-R）巯基的比例被广泛认为是细胞氧化还原状态的关键指标。还原型巯基池，主要是GSH，在清除ROS、介导巯基-二硫键交换反应以及调节氧化还原敏感的信号通路和基因表达方面起着核心作用。因此，巯基代谢和氧化还原平衡的失调与癌症的发生、进展和治疗耐药性密切相关，这突显了细胞内巯基作为重要生物标志物和潜在治疗靶点的作用。尽管基于荧光的方法已被广泛用于检测细胞内巯基[11]、[12]，但电化学方法，特别是那些适用于即时检测的方法，仍然相对较少被研究。2008年，Wang等人首次报道了使用基于吡唑硒醇的电子转移探针在乳腺癌细胞中检测细胞内巯基的方法[13]。最近，在2026年，Zhang等人利用基于铂纳米粒子的电极研究了与二硫键积累相关的巯基/二硫键失衡，这是一种由氧化还原失衡驱动的新形式的调节性细胞死亡[14]。这些研究强调了电化学工具在探究癌症生物学中巯基动态方面的日益重要性。然而，开发简单、灵敏且高效的电化学平台以检测癌症系统中的巯基仍然是一个重大挑战。在这项研究中，我们提出了一种原位电化学方法，用于在碳黑（CB）修饰的电极表面上对SF进行氧化还原分析。我们特别研究了其与含巯基生物标志物的相互作用，并探讨了其对肿瘤细胞抗氧化防御机制的影响。这项工作为SF的电化学行为及其与细胞内巯基的化学相互作用提供了新的见解，为治疗策略和生物标志物分析提供了潜在的意义。本研究的主要目标是：（i）在操作条件下在碳纳米材料表面电化学生成SF的氧化还原活性形式（SF-Redox）；（ii）在生理环境中研究巯基与SF-Redox的相互作用；（iii）研究SF-Redox介导的巯基氧化；（iv）开发一种用于连续监测HCT 116人类结肠癌细胞中巯基浓度的电分析传感平台。
化学修饰电极（CMEs）是一类独特且多功能的材料，在异质电化学系统中具有广泛应用[15]、[16]。它们本质上是功能化的电极，意味着其表面经过特殊化学修饰以赋予所需的性质或功能。在某些情况下，CMEs被设计用来模拟生理环境，从而能够详细研究酶系统或其他生物氧化还原过程中的关键电子转移功能[17]。这种仿生学方法使研究人员能够在更可控和易于访问的电化学环境中研究复杂的生物电子转移。例如，一种电化学方法被用来研究特定药物对抗活性氧（ROS）的机制[18]。在这项研究中，疟疾色素血红素被限制在多壁碳纳米管（MWCNTs）的表面上，形成了一个高度氧化还原活性的表面限定系统，便于研究涉及过氧自由基的电子转移反应，揭示了该药物的抗疟疾机制。基于这一概念，在另一项独立研究中，我们之前证明了电化学活性的氧化还原位点可以在聚合物基质内稳定[17]。这种工程化系统成功模拟了天然酶系统的功能，其中活性氧化还原中心通常被大分子蛋白质结构所封装和稳定[17]。这项工作突显了合成聚合物基质复制天然生物分子提供的保护和功能环境的潜力。在此基础上，当前的研究重点是在CB修饰的电极表面上原位合成一个高度氧化还原活性的系统（SF-Redox），该系统能够作为一个高效的电化学信号平台。在这项研究中，我们通过两种互补的方法研究了巯基与SF系统的相互作用：（i）我们通过研究SF与巯基分子之间的相互作用来研究SF-Redox产物的形成。在此转化过程中，巯基与SF的活性位点结合，从而影响电子转移信号行为，这模拟了实际系统中的药物-巯基相互作用行为。（ii）我们探讨了SF-Redox系统的电催化能力，特别是其介导巯基分子氧化的能力。这证明了该平台作为有效的仿生电分析工具的实用性。
由于缺乏发色团，像CySH和GSH这样的巯基生物标志物的定量通常依赖于基于衍生的检测技术，如比色法、紫外-可见（UV–Vis）光谱、荧光和气相色谱-质谱（GC–MS）[19]、[20]、[21]、[22]。相比之下，电分析技术提供了一种直接且无标记的方法，通过利用其在生理条件下的电化学氧化来定量CySH。对于CySH的电催化氧化，已经使用了铂（Pt）、金（Au）和掺硼金刚石（BDD）等固体电极，其氧化电位约为+1.0 V vs Ag/AgCl [23]、[24]、[25]。然而，这些系统存在局限性，包括产生不稳定的巯基自由基中间体、需要较高的过电位以及由于不稳定性导致的电极表面污染[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。为了解决这些挑战，已经研究了结合有机染料、金属氧化物和金属有机框架的CMEs以增强CySH的氧化[28]、[29]、[30]。其中，氧化还原介导的电催化因其高效的电子转移能力、较低的过电位和分子水平的特异性而受到特别关注[31]、[32]。在这项研究中，我们展示了使用带有氧化还原活性SF-Redox系统的CB修饰电极对巯基的有效电催化氧化，并进一步将这种方法扩展到基于即时检测的原型设备系统中来监测癌细胞系统中的巯基。总体而言，这项工作通过将药物化学与界面电化学相结合，克服了现有巯基传感策略的关键限制，建立了一类新的功能性、药物衍生的氧化还原界面，适用于机制研究和先进的生物电分析应用。
试剂和材料
以下物品从美国的Sigma-Aldrich购买：索拉非尼（纯度>98%）、D(+)-葡萄糖（Glu）、谷胱甘肽（GSH；纯度>98%）和L-半胱氨酸（CySH；含量：97%，光学纯度：96%）。30%过氧化氢（H2O2）从印度的Avra Synthesis购买。L(+)-抗坏血酸（AA；含量：99.7%）从Rmagundam Fertilizers and Chemicals Limited（RFCL）购买。石墨化介孔碳（GMC；粒径500 nm，痕量金属纯度>99.95%）
SF-药物在CB表面的电化学响应
首先，将用原始SF-药物修饰的GCE（标记为GCE@SF）在?0.4 V至+0.8 V vs Ag/AgCl的电位窗口内进行CV测试，扫描速率为50 mV/s，使用0.1 M PBS作为支持电解质（图1A）。所得到的伏安图显示出定义不明确且不稳定的法拉第峰，峰对峰分离（?Ep）约为440 mV。这些观察结果表明SF-药物在裸电极上的电化学响应缓慢且效率低下
结论
在这项研究中，我们建立了一种新的电化学策略，将抗癌药物SF转化为在CB修饰电极上的稳定、表面限定的氧化还原活性二聚体（SF-NH-NH-SF）。这种转化使电化学从传统的扩散控制转变为表面限定的氧化还原系统，从而更好地控制了界面电子转移过程。电化学和光谱分析证实了氧化还原活性物质的形成和稳定性
CRediT作者贡献声明
Kondusamy Vignesh：撰写——原始草稿、可视化、验证、软件、资源、方法论、研究、正式分析、数据管理。Ayyakannu Arumugam Napoleon：可视化、监督、资源、数据管理。Subhajit Sarkar：资源、方法论、正式分析、数据管理。Kavitha Thirumurugan：验证、监督、研究、数据管理、概念化。Annamalai Senthil Kumar：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、可视化，
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Annamalai Senthil Kumar报告称获得了维洛尔理工学院的财务支持。Annamalai Senthil Kumar与维洛尔理工学院存在关系，包括就业。Annamalai Senthil Kumar有一项待批准的专利。鉴于其角色，他没有参与本文的同行评审，也没有访问权限
致谢
作者感谢科学与技术部-科学与工程研究委员会计划（DST/SERB/CRG/2021/001048），印度，对这项研究工作的支持。
