《Agronomy》：Genome-Wide Identification, Characterization, and Expression Profiling of the HvLEA Family Genes Under Salt Stress, and Prediction of Their Protein–Protein Interaction Networks in Barley (Hordeum vulgare L.)
Yiru Mao,
Nan Li,
Duo Zhao,
Lufei Li,
Ye Yang,
Ao Qian,
Jiaying Wang,
Xuqi Zheng,
Yi Hong and
Juan Zhu
+ 4 authors
编辑推荐：
盐胁迫是显著限制全球作物产量的主要非生物胁迫因子。胚胎发育晚期丰富蛋白（Late embryogenesis abundant, LEA）广泛存在于多种生物体中，在植物响应非生物胁迫中起着关键且多方面的作用。然而，在大麦中仅有少量与耐盐相关的 HvLEA 基因
盐胁迫是显著限制全球作物产量的主要非生物胁迫因子。胚胎发育晚期丰富蛋白（Late embryogenesis abundant, LEA）广泛存在于多种生物体中，在植物响应非生物胁迫中起着关键且多方面的作用。然而，在大麦中仅有少量与耐盐相关的 HvLEA 基因被鉴定。在本研究中，研究人员在大麦中鉴定了 107 个 HvLEA 蛋白，并将其分为 8 个亚组，它们分布于全部 7 条染色体上。对盐胁迫处理 12 小时、48 小时和 120 小时后的大麦品种“Golden Promise”的根和叶组织进行的 RNA-Seq 分析，鉴定出 69 个在两个组织中均差异表达的 HvLEA 基因。其中，41 个 HvLEA 基因在叶和根中均呈差异表达。六个基因（HvDHN2、HvDHN5、HvDHN10、HvLEA1.1、HvLEA1.6 和 HvSMP2）在根和叶中经盐胁迫后均被极显著上调，其 log2FC 值超过 10，表明它们在盐胁迫响应中可能起着关键作用。对选定基因的 qPCR 验证证实了与 RNA-Seq 数据一致的表达趋势。数据库预测和共表达网络分析表明，除了同一家族内潜在的蛋白质相互作用外，这些基因还可能与其他蛋白如富含半胱氨酸的受体激酶、锌指蛋白、钙结合 EF-手家族蛋白、NAC 结构域蛋白和糖基转移酶等相互作用。这项研究鉴定了参与盐胁迫响应的关键 HvLEA 基因，并通过分子育种为提高大麦耐盐性提供了宝贵的遗传资源。
研究背景与目的
盐胁迫是影响全球作物产量的主要非生物胁迫之一。大麦（Hordeum vulgare L.）是第四大禾谷类作物，也是禾本科作物研究的模式植物，具有相对较强的耐盐性。然而，目前已明确功能的耐盐相关基因数量有限，制约了通过分子育种提升大麦耐盐性的进程。胚胎发育晚期丰富蛋白在植物抵抗干旱、高盐、低温等多种非生物胁迫中扮演着重要角色，例如通过稳定生物大分子和细胞膜结构、清除活性氧、作为分子伴侣等方式发挥作用。尽管在多种植物中已对 LEA 基因家族进行了全基因组鉴定，但大麦中 HvLEA 基因家族的全面鉴定、表达分析及功能网络研究仍不充分。为了挖掘大麦中响应盐胁迫的关键 HvLEA 基因，并为耐盐性育种提供遗传资源，研究人员开展了此项研究。
主要关键技术方法
研究人员运用了生物信息学、转录组学和分子生物学等多学科技术。首先，利用隐马尔可夫模型和同源性搜索，在大麦基因组中系统鉴定了 HvLEA 基因家族成员，并分析了其系统发育关系、基因结构和保守基序。其次，通过 RNA-Seq 技术，分析了耐盐大麦品种“Golden Promise”的根和叶组织在盐胁迫处理不同时间点（12、48、120 小时）后的基因表达谱，以鉴定差异表达的 HvLEA 基因。同时，利用 qRT-PCR 对筛选出的关键基因进行了动态表达验证。此外，还通过 STRING 数据库预测了 HvLEA 蛋白的潜在相互作用网络，并分析了这些互作蛋白在盐胁迫下的表达模式。
研究结果
3.1. HvLEA 基因家族的鉴定、亚细胞定位及蛋白质理化性质预测
基于大麦基因组，共鉴定出 107 个包含完整结构域的 HvLEA 成员，并根据系统发育树和结构域划分为 SMP、DHN、LEA-1 至 LEA-6 八个亚家族。HvLEA 蛋白的氨基酸数目、分子量和等电点等理化性质存在差异，亚细胞定位预测显示其广泛分布于叶绿体、细胞核、细胞质等多个细胞器中。染色体定位分析表明 HvLEA 基因分布于大麦所有 7 条染色体上。
3.2. HvLEA 家族基因的基因结构
基因结构分析显示，HvLEA 基因结构相对简单，其中 63 个基因不含内含子，39 个基因含 1 个内含子。同一亚家族内的基因通常具有相似的内含子/外显子结构，例如 HvDHN 亚家族除 HvDHN9 外均含 1 个内含子，而 HvLEA1 亚家族大部分成员不含内含子。
3.3. 大麦不同组织中 HvLEA 家族成员的表达模式分析
表达谱分析显示，HvLEA 基因在不同组织中表达具有特异性。部分基因在所有测试组织中表达量均很低（FPKM < 1），而部分基因则普遍表达（FPKM > 1）。一些基因，如 HvLEA5.6、HvSMP2 等，仅在发育籽粒中特异性高表达；HvLEA2.22 等基因仅在花序中表达；HvLEA2.61 等基因则仅在根中表达。
3.4. 盐胁迫下 HvLEA 家族基因的表达分析
RNA-Seq 分析表明，在盐胁迫下，根和叶组织中分别鉴定出大量差异表达基因。其中，共有 69 个 HvLEA 基因差异表达，41 个基因在根和叶中均差异表达。在根组织中，HvDHN2、HvLEA1.6 等 6 个基因被显著诱导上调（log2FC > 10）。在叶组织中，有 17 个基因显著上调，包括 HvDHN2、HvDHN5 等。同时，多个 HvLEA2 亚家族基因的表达在盐胁迫下受到抑制。
3.5. 对盐胁迫有强烈响应的六个 HvLEA 基因的动态转录响应
qPCR 验证了六个关键基因在盐胁迫下的动态表达模式。在根中，这些基因在胁迫 6 小时后即被显著诱导，表达量在 48 小时达到峰值后下降。在叶中，上调表达在 12 小时被检测到，部分基因的表达在 120 小时内持续上升。该结果与 RNA-Seq 数据趋势一致，证实了这些基因在盐胁迫早期和持续响应中的重要性。
3.6. HvLEA 潜在相互作用蛋白分析及其在盐胁迫下的表达
通过计算分析，研究人员预测了 46 个差异表达的 HvLEA 基因可能存在的 423 个相互作用。预测的互作蛋白包括富含半胱氨酸的受体激酶、锌指蛋白、钙结合 EF-手家族蛋白、NAC 结构域蛋白和糖基转移酶等，其中许多在盐胁迫下也表现出强烈的表达响应。分析还预测了 HvLEA 家族内部成员之间存在相互作用，例如 HvLEA1.3/HvLEA1.4 与 HvDHN4/5/6/12 等，这些共表达的基因对可能通过协同作用共同应对盐胁迫。
讨论与结论总结
在讨论部分，研究人员指出 LEA 蛋白在植物抵抗非生物胁迫中具有多种保护功能。本研究在全基因组水平鉴定了大麦 HvLEA 基因家族，并系统分析了其在盐胁迫下的表达谱。多个 HvLEA 基因被盐胁迫强烈诱导，尤其是 HvDHN2、HvDHN5、HvDHN10、HvLEA1.1、HvLEA1.6 和 HvSMP2 这六个基因，它们是在根和叶中均被极显著上调的关键候选基因。尽管极高的表达倍数变化可能源于低表达噪声，但本研究通过 DESeq2 的倍数收缩、低表达基因的预过滤和 FDR 校正有效控制了假阳性率，且这些基因均表现出中等到较高的表达水平，支持了其可靠性。对潜在互作蛋白的预测分析为解析 HvLEA 蛋白在盐胁迫响应中的分子机制提供了线索。例如，预测显示 HvLEA3.3 可能与钙结合 EF-手家族蛋白互作，两者在盐胁迫根中均显著上调。钙离子作为盐胁迫响应的关键信号分子，其结合蛋白在耐盐调控中起核心作用。此外，预测还发现富含半胱氨酸的受体样激酶、糖基转移酶、锌指蛋白、NAC 转录因子等可能与特定 HvLEA 成员存在互作，这些蛋白在已知的植物盐胁迫响应通路中均扮演重要角色。值得注意的是，之前在水稻和大豆中的研究已报道 LEA 蛋白可与激酶互作调节耐盐性，这暗示 HvLEA 蛋白可能在盐胁迫响应中处于复杂的调控网络中。然而，本研究中预测的所有互作关系均基于计算分析，有待后续实验验证。
研究结论
研究人员在大麦中鉴定出 107 个 HvLEA 蛋白，并将其分为 8 个组。其中，69 个 HvLEA 基因在盐胁迫下差异表达，有 6 个基因在根和叶中均表现出极高的上调水平。这些关键基因及其预测的相互作用伙伴，代表了通过分子育种提高大麦耐盐性的宝贵遗传资源。
