关于导致七叶树（Aesculus hippocastanum L.）树皮坏死和枝条枯死的Kalmusia variispora的首次报告 作者：Mi?osz Tkaczyk 和 Katarzyna Sikora

《Pathogens》：First Report of Kalmusia variispora Causing Bark Necrosis and Branch Dieback of Horse Chestnut (Aesculus hippocastanum L.) Mi?osz Tkaczyk and Katarzyna Sikora

　　摘要
七叶树（Aesculus hippocastanum L.）是一种广泛种植的观赏性和城市用树木，因其美观和生态功能而受到重视。近年来，城市环境中七叶树的健康状况日益恶化，这通常与生物和非生物压力因素的综合作用有关。在波兰华沙一条城市道路走廊上生长的七叶树进行健康调查时，观察到了广泛的树皮坏死和枝条枯死现象。本研究旨在通过形态学、培养技术、分子生物学（ITS rDNA）和致病性测试，在受控条件下确定这些症状的致病因子。从坏死组织中分离出真菌株，并通过ITS序列分析（与GenBank参考序列的相似度为99.0–99.6%）和特征性的形态学特征，确认其为Kalmusia variispora。致病性测试符合科赫法则（Koch’s postulates），再现了与田间观察到的相似的坏死病变和形成层损伤。据我们所知，这是全球首次记录到K. variispora感染七叶树的情况。这些发现扩展了这种机会主义真菌的已知宿主范围，并突显了其在城市树木树皮和木材疾病中的潜在作用。需要进一步的研究来评估其在城市森林生态系统中的分布、遗传多样性和流行病学意义。

1. 引言
七叶树（Aesculus hippocastanum L.）是中欧和西欧最知名且最受重视的观赏性树木之一。由于其壮观的开花效果、宽阔的树冠结构以及对城市栖息条件的良好适应性，几个世纪以来它一直是公园、林荫道和代表性公共空间的重要组成部分。七叶树通过调节微气候、减少城市表面过热、提高雨水滞留能力和改善空气质量，在生态上发挥着重要作用[1,2]。在许多欧洲城市中，这些树木形成了具有显著景观和文化价值的古老林荫道，它们的缺失不仅会导致经济损失，还会导致公共空间的退化。自21世纪初以来，城市环境中七叶树的健康状况系统性下降。这一现象是多因素引起的，是由非生物压力（干旱、土壤盐分、交通污染和有限的根系空间）以及病原体和害虫的压力共同作用的结果[3,4]。树木生理功能的减弱促进了机会主义生物的寄生，增加了其对树皮和木材疾病的易感性，导致坏死、溃疡形成和枝条枯死。这种损害对街道树木的结构稳定性和城市地区的公共安全构成了严重威胁[5]。
对七叶树最具破坏性的威胁之一是出血性溃疡病，这是一种以树皮大面积坏死和从树皮裂隙中渗出黑色粘性液体为特征的病症[6,7]。该病会导致形成层的死亡和维管组织受损，最终导致树冠逐渐衰弱直至树木死亡。最初，这些坏死现象被认为是由Phytophthora属的卵菌引起的；然而，后来的分子研究表明，在许多欧洲国家，主要致病因子是Pseudomonas syringae pv. aesculi细菌，自21世纪初以来它一直是一种主要的致病菌[7,8]。除了细菌病原体外，属于Dothideomycetes纲的真菌，包括Botryosphaeriaceae科的成员，在七叶树的木材退化和枝条枯死中也起着重要作用。Diplodia属的物种及其相关分类单元以其在宿主受到压力时从内生菌转变为病原菌的能力而闻名[9,10]。最近的报告证实了Diplodia spp.存在于城市环境中生长的七叶树的枝条坏死中[5]。
影响七叶树的生物因素还包括叶部病原体，如引起白粉病的Erysiphe flexuosa，该病会导致提前落叶[11]。由于叶部感染导致的长期虚弱可能会进一步增加树木对次级树皮和木材病原体的易感性。近年来，人们也开始关注Doymosphaeriaceae科中研究较少的一些成员[12]。这些真菌的机会主义特性及其在衰弱组织中定植的能力表明，它们可能在城市树木疾病复合体中发挥重要作用。随着气候变化加剧，水分和温度压力增加，从而提高了树木的感染风险[13]，因此从植物病理学和城市绿化管理的角度出发，详细鉴定导致城市七叶树树皮和木材坏死的致病因子变得至关重要。
本研究的目的是利用ITS rDNA序列分析、对分离菌株的详细形态学特征描述以及在受控条件下根据科赫法则验证其致病性，来确定华沙路边生长的七叶树（Aesculus hippocastanum）树皮坏死和枝条枯死的致病因子。

2. 材料与方法
2.1. 取样与真菌分离
2025年10月15日，在波兰华沙Wo?oska街道上生长的七叶树（A. hippocastanum）上采集了植物材料。所检树木表现出明显的病害症状，表现为树枝树皮上的黑色不规则病变（图1）。具有坏死变化的树枝逐渐衰退，表现为叶片提前脱落和受影响枝条上缺乏当年的新梢生长。在调查路段的几乎所有树木（53株）上都观察到了类似症状。在病变部位机械去除外层树皮后，可以看到下方组织的广泛坏死。选择了四株相距约15米的代表性树木进行进一步分析，以尽可能全面地评估整排树木的情况，同时尽量减少局部感染的影响。从健康组织和坏死组织之间的边界切下组织碎片。由于本研究的探索性质，选择了有限数量的树木和分离株进行详细分析。样品先用2%次氯酸钠表面消毒1分钟，然后浸入70%乙醇30秒，再用无菌蒸馏水冲洗三次。干燥后，将组织碎片放置在Potato Dextrose Agar (PDA; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)培养基上，并在22–24°C的黑暗环境中培养。通过将生长中的菌丝片段单次或多次转移到新鲜培养基上来纯化真菌菌落，直至获得纯培养物。

2.2. 基因组DNA提取、PCR和测序
使用Plant DNA Mini Kit（Syngen, Wroc?aw, Poland）根据制造商说明从生长在麦芽提取物琼脂（MEA）平板上的新鲜菌丝中提取基因组DNA。使用通用引物ITS1F和ITS4扩增核糖体DNA的内转录间隔区（ITS）区域，靶向ITS1–5.8S–ITS2区域[14,15]。每个25 μL的PCR反应液包含1× PCR缓冲液（Taq PCR Core Kit, Qiagen, Hilden, Germany）、1.5 mM MgCl2、每种dNTP 0.4 mM、每种引物0.2 μM、1 U Taq DNA聚合酶和10–20 ng基因组DNA。扩增程序包括初始变性步骤（95°C 5分钟）；35个循环（95°C 30秒、56°C 30秒、72°C 50秒）；最后在72°C下延伸10分钟。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上使用GelRed?（Biotium, Fremont, CA, USA）显色，并使用CleanUp Kit（A&A Biotechnology, Gdańsk, Poland）进行纯化。测序使用Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）进行双向测序。将获得的序列与NCBI GenBank数据库中的参考序列使用BLASTn算法（NCBI, 2019）进行比较，以确定最接近的分类学匹配。
系统发育分析使用MEGA7软件中的最大似然（Maximum Likelihood）方法进行[16]。采用Kimura 2参数模型[17]作为核苷酸替换模型。使用1000次自助法（bootstrap replicates）评估推断树拓扑结构的稳健性[18]。初始树谱是通过基于最大复合似然方法（Maximum Composite Likelihood）估计的成对距离，使用Neighbor-Joining[19]和BioNJ[20]算法自动生成的[19]。位点间的变异率用带有五个类别（+G）的离散Gamma分布模型进行建模。所有包含空缺和缺失数据的位点都被移除（完全删除），最终得到包含441个位点的数据集。分析共包括九个核苷酸序列。

2.3. 形态学特征
对来自单一形态学组的三个代表性分离株进行了形态学特征分析。菌落在PDA和MEA（Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany）培养基上于22–24°C条件下培养。记录了径向生长速率、菌落颜色、表面质地、气生菌丝的存在以及反向色素沉着情况。为了诱导生殖结构的形成，在培养7天的菌落表面放置了无菌的白桦木碎片。培养板在24°C和日光条件下孵育。每天监测木碎片上子实体的形成情况，持续7天。使用ZEISS Axioskop 2（Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany）和装有数码摄像头的ZEISS Axiolab显微镜，在20×至400×的放大倍数下观察微细结构，包括菌丝结构、分生结构形态以及分生孢子的形状和大小。使用Nikon NIS-Elements D软件（版本4.50）测量分生孢子的颜色、形状、长度和宽度，并计算最小值、最大值和平均值及标准偏差。根据Rayner[22]的颜色标准评估不同培养基上的菌落形态和色素沉着情况。

2.4. 致病性
在温室实验中评估了三个选定分离株的致病性，使用了三年生的七叶树幼苗。在无菌条件下，使用无菌软木钻孔工具在茎上制造直径为5毫米的机械伤口。伤口接种了之前被该真菌定植并带有子实体的无菌白桦木块。接种部位用Parafilm（Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany）密封以防止污染和过度失水。对照组使用未经定植的无菌木块作为阴性对照。实验采用完全随机设计，每个分离株在五个独立的树上进行重复实验一次。总共每个分离株在每个实验运行中测试了五棵树。植物在温室条件下生长，并根据需水量每周滴灌一次或两次。接种两个月后，接种的植物出现了与田间条件下相似的树皮症状，这标志着实验的结束。切除包含接种部位的茎段并进行实验室分析。去除树皮并表面消毒后，从有症状的组织中重新分离真菌以确认其身份并验证是否符合科赫法则。

3. 结果
从所有分析的分离株中都获得了高质量的基因组DNA，使得ITS rDNA区域的扩增效率很高。真菌始终从田间收集的症状组织中分离出来。PCR扩增产生了一个大约550–600 bp的单一扩增子，电泳结果显示这一点。双向测序为每个分离株生成了高质量的共识序列。获得的序列长度为522 nt。与NCBI GenBank数据库的BLASTn分析显示，这些序列与Kalmusia variispora（Verkley, G?ker & Stielow）Ariy. & K.D. Hyde的参考序列具有最高的相似性（99.0–99.6%）。最佳匹配序列PV600891（来自土耳其Vitis vinifera的分离株）显示出99.81%的身份一致性和100%的查询覆盖率（522/523 nt；一个核苷酸差异）。所有分析的分离株在与该物种的代表性序列之间具有序列一致性，没有显著的种内变异。本研究生成的代表性ITS序列被存入GenBank，登录号为PX593156。这些分子结果确认了分离出的病原体属于K. variispora物种。系统发育分析进一步支持了这些分离株的鉴定（图2）。最大似然树显示，获得的序列在Kalmusia variispora分支内聚类，具有较高的自助支持度，证实了它们的分类学位置。

3.2.**形态特征**
所有被归类为该形态组的菌株都表现出高度一致的大型和微观形态特征。在PDA培养基上，菌落在22–24°C下培养7天后直径达到52–58毫米，表明其生长速度适中较快。最初，菌落表面呈浅灰色至橄榄灰色，随着时间推移逐渐变为棕灰色。菌落质地从绒毛状到轻微絮状不等，中央区域有发达的气生菌丝。菌落的背面为深棕色至近黑色，常伴有颜色更深的斑块。在MEA培养基上，径向生长略受抑制（7天后直径为48–54毫米），菌落结构更为紧密，气生菌丝较少。色素分布更为均匀，颜色从灰棕色到深橄榄色不等。在无菌桦木碎片上培养14天后，形成了大量分生孢子器。这些结构呈球形或近球形，部分浸没在木材组织中，直径为180–260微米（平均约220微米）。分生孢子器壁厚实，颜色为深棕色至黑色（见图3）。分生孢子梗较短，简单或略微弯曲，透明至浅棕色。分生孢子呈椭圆形至宽椭圆形，最初透明，成熟后变为浅棕色，壁光滑，主要为单细胞。所得的生物测量参数与Kalmusia variispora的已知描述一致，轻微偏差仍在种内变异范围内。宏观和微观特征的结合以及分子数据共同证实了这些菌株属于K. variispora。

**致病性**
接种两个月后，三年生七叶树幼苗的接种部位出现了明显的病症。坏死病灶围绕伤口形成，影响树皮和下方组织（见图3）。病灶呈深棕色至黑色，形状不规则，随时间逐渐扩大。去除接种部位的树皮后，观察到形成层和相应木材组织的坏死，这与野外条件下成熟树木的症状非常相似。而在施加了无菌木材片段的对照组中，未观察到任何症状或组织变色。该真菌始终可以从有症状的组织中重新分离出来，且分离得到的菌株具有与原始菌株相同的形态特征。根据菌落形态和生殖结构，确认了该病原体的身份，从而满足了Koch假设。结果清楚地表明，在受控条件下，K. variispora能够引起七叶树树皮和皮层下的坏死病变。

**讨论**
本研究明确证明，A. hippocastanum的树皮坏死和枝干枯萎与K. variispora的存在有关。需要注意的是，分析的菌株数量有限，且未系统探究其他可能引起类似症状的潜在病原体。因此，所观察到的病症可能是生物和非生物因素共同作用的结果。鉴定结果基于ITS rDNA序列与参考数据的高相似性（99.0–99.6%），以及形态特征和致病性测试（这些测试重现了病症并成功分离出了病原体）。这些结果证实了该物种在受控条件下的致病潜力；然而，它们并未完全解释其在自然条件下的作用，因为自然环境中可能存在多种生物和非生物因素的交互作用。目前尚未有文献报道该物种感染A. hippocastanum的情况，因此本研究是首次记录到其与七叶树症状性病变的关联。

Kalmusia属属于Dothideomycetes纲中的Didymosphaeriaceae科，该分类群的界定近年有所完善[12,25]。该科成员传统上主要从枯木或木质植物的内生菌中分离获得，暗示其主要以腐生方式生存。然而，越来越多的证据表明，内生性与致病性之间的界限是动态的，许多分类单元在宿主生理压力下可能表现出致病潜能[9,26]。在这方面，K. variispora（前称Dendrothyrium variisporum）尤为引人注目。它最初是从叙利亚的衰退葡萄藤和瑞士的Erica carnea中分离得到的[23]。其致病性首次在伊朗得到实验验证[24]，后续报道在加州、华盛顿州（美国）和希腊的葡萄园中也发现了其存在[27,28]。值得注意的是，参考文献[29]显示，在表现出葡萄藤干病症状的葡萄藤中，K. variispora的相对丰度显著高于无症状植株，这表明其在希腊条件下的潜在指示作用。现有数据还表明，该物种的寄主范围更广泛，不仅限于葡萄藤。在希腊和智利，K. variispora已被报道为主要导致苹果芯腐病的病原体[30,31]。它还被从Rosa hybrida和Pinus eldarica中分离出来作为内生菌[24]。在伊朗，该物种与橡树和甜栗树的衰退有关，伴随落叶、维管组织变色和木材坏死等症状[32,33]。此外，它还在石榴木材的坏死部分被检测到，尽管其在该寄主上的致病性尚未通过实验验证[34]。

本研究观察到的症状——黑色、不规则的树皮坏死和形成层损伤——部分类似于由Pseudomonas syringae pv. aesculi引起的溃疡病[7,8]。早期报道也将类似症状与Phytophthora属的感染联系起来[6]。然而，症状进展的差异以及缺乏特征性的细菌分泌物表明K. variispora的致病机制有所不同。类似的枝干坏死也与Diplodia属的感染有关，包括中欧七叶树的病例[5]。

在城市环境中，七叶树常常表现出活力下降，这为机会性病原体的寄生提供了条件[2,4]。参考文献[2,4]指出，生长在高度封闭城市区域的树木经历了慢性干旱和根区过热。这些条件可能促使K. variispora从内生菌转变为致病菌[25,26]。使用ITS区域作为诊断标记符符合真菌分类学的标准做法[14,35]。虽然ITS被广泛认为是真菌的通用DNA条形码，但加入其他基因位点（如LSU、tef1-α）的进一步系统发育分析可以提供关于菌株群体多样性和潜在地理来源的更多详细信息。本研究的关键组成部分是在受控条件下验证了其致病性。植物细胞壁是对微生物入侵的主要结构屏障，成功致病菌必须通过酶解作用克服这一屏障[36]。这一过程涉及分泌能够降解纤维素、半纤维素、果胶和木质素等主要细胞壁成分的水解酶和氧化酶，尤其是在木质组织中[37]。这些酶的活性被认为是致病性和真菌侵袭性的关键决定因素[38]。在K. variispora中，木质素降解相关的漆酶的产生可能与木材变色的程度和坏死病灶的范围有关[39]。Makris等人[39]报告称不同菌株之间木质素降解酶活性存在差异，其中一种菌株缺乏降解木质素的能力。所有检测到的菌株都能产生降解纤维素和果胶的酶，强调了这些活性在宿主组织定殖中的重要性。此外，K. variispora还被发现能合成多种植物毒性代谢物，可能促进症状的发展[40]。值得注意的是，许多关于新寄主关联的报道仅基于从坏死组织中分离出该菌株，未验证其致病性。在本研究中，Koch假设的满足明确证实了K. variispora引发观察到的病症的能力，从而确认了其在受控条件下的致病潜力，但这并不排除自然条件下其他因素的参与。

应承认本研究的局限性。分析的菌株数量和实验重复次数有限，致病性评估是定性的。此外，未系统排除其他可能引起类似症状的潜在病原体。因此，观察到的病症可能反映了多种相互作用因素的复杂病因。总之，这项研究扩展了目前对与七叶树衰退相关的病原体的认识。全球范围内首次证明K. variispora能够在受控条件下引起树皮和形成层坏死。这一发现对植物病理学和城市树木管理具有重要意义。在气候变化和环境压力加剧的背景下，Didymosphaeriaceae科的机会性成员在城市树木疾病中的作用可能会加剧。未来的研究应包括监测该病原体在其他欧洲地区的分布、评估其遗传变异以及评估其与其他定殖在七叶树组织中的微生物的相互作用。