巴西东南部圈养共栖鸟类中禽毛滴虫（Trichomonas gallinae）的出现与遗传多样性分析

《Pathogens》：Occurrence and Genetic Diversity of Trichomonas gallinae in Captive Synanthropic Birds in Southeastern Brazil Amanda Garcia Pereira, Sarah Raquel Jesus Santos Sim?es, Maitê Cardoso Coelho da Silva, Ana Cláudia Calchi, Ricardo Bassini-Silva, Ana Carolina Castro-Santiago, Rosangela Zacarias Machado, Marcos Rogério André and Karin Werther

　　

摘要 禽毛滴虫病（Avian trichomonosis）是由毛滴虫属（Trichomonas）原虫引起的疾病，主要为禽毛滴虫（Trichomonas gallinae，T. gallinae），其感染鸟类的上消化道，通常与鸽形目（Columbiformes）相关，后者是该寄生虫的主要宿主。本研究旨在调查巴西东南部圈养共栖鸟类中毛滴虫属的出现率与遗传多样性。研究人员采集了来自13个鸟目、共281只鸟的口咽拭子，并采用Diamond培养基培养、吉姆萨染色涂片和分子检测进行分析。在262份培养样本中，有72份（27.48%）在光镜下显示出滋养体样结构。基于ITS1–5.8S–ITS2区域的分子筛选在267份成功提取DNA的样本中检测到76份（28.46%）含有毛滴虫DNA，其中包括来自弗兰卡（Franca）的72只家鸽（Columba livia domestica）、来自里贝朗普雷图（Ribeir?o Preto）的1只黑头美洲鹫（Coragyps atratus）以及来自雅博蒂卡巴尔（Jaboticabal）的3只原鸽。在ITS阳性样本中，67份（88.15%）扩增出铁氢化酶（Fe-hydrogenase）基因，65份（85.5%）对18S rRNA基因也呈阳性。仅有6份样本（2.29%）在吉姆萨染色涂片中显示出与毛滴虫属相容的结构。基于ITS序列的系统发育分析将分离株归入禽毛滴虫复合体（T. gallinae complex）内的两个分支。使用铁氢化酶和18S rRNA标记物观察到更高的遗传多样性，揭示了多个单倍型和分支。与培养和细胞学相比，直接对口咽拭子进行的PCR等分子检测在检测和表征禽毛滴虫方面表现出更高的灵敏度。这些发现突显了在圈养共栖鸽类中禽毛滴虫的高发生率和遗传多样性，并强调了分子工具在野生动物设施流行病学监测中的重要性。

研究背景与问题

禽毛滴虫病是由毛滴虫属原虫引起的鸟类寄生虫病，其中禽毛滴虫（T. gallinae）是主要病原体，常感染鸟类上消化道，鸽形目为其主要宿主。该病可通过亲鸟喂食、交配行为、直接接触及污染的水源或食物传播，严重感染可导致幼鸟高达80–90%的死亡率。尽管可通过染色涂片进行直接诊断，但该方法受限于寄生虫的脆弱性。分子技术（如PCR）因其高灵敏度与利于系统发育分析的特点，成为更有效的检测手段。在巴西，早期研究多基于培养法，对禽毛滴虫的遗传多样性了解有限，尤其在圈养共栖鸟类中的流行情况和遗传特征尚未充分阐明。因此，本研究旨在确定巴西圣保罗州圈养共栖鸟类中毛滴虫属的出现率、利用ITS（内转录间隔区）、铁氢化酶和18S rRNA标记评估禽毛滴虫的遗传多样性，并比较培养、细胞学与PCR等不同诊断方法的性能。

研究设计与方法概述

本研究于2022年7月至2023年1月在巴西圣保罗州的弗兰卡、里贝朗普雷图、容迪亚伊、博图卡图及雅博蒂卡巴尔五个城市的野生动物康复中心、动物园及救助机构中，采集了281只圈养鸟类的口咽拭子样本。每只鸟类采集三份拭子，分别用于Diamond培养基培养、吉姆萨染色涂片制备以及DNA提取与分子分析。对于因已冷冻而无法培养的19份样本（来自雅博蒂卡巴尔的SEPAS常规样本），仅进行分子检测。分子检测包括：先通过内源性β-肌动蛋白（β-actin）基因PCR排除抑制剂干扰，再针对毛滴虫的ITS1/5.8S/ITS2区域进行PCR筛查；阳性样本进一步扩增铁氢化酶基因和18S rRNA基因。对获得的序列进行BLASTn比对和系统发育分析（采用贝叶斯法），并使用DnaSP软件计算核苷酸多样性、单倍型多样性等遗传多样性参数，通过TCS网络可视化单倍型关系。

研究结果

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  毛滴虫属培养：262份培养样本中，72份（27.48%）在光镜下观察到具有特征运动性的、形态与毛滴虫滋养体相容的结构。但后续分子检测仅在家鸽培养物中呈阳性。
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  吉姆萨染色口咽拭子涂片：在262份染色涂片中，仅6份（2.29%）来自弗兰卡鸽形目的样本显示出毛滴虫属的假包囊。所有涂片阳性样本均可通过其他方法检出，表明此法灵敏度最低。
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  DNA提取与内源基因PCR：281份拭子中，267份（95.01%）成功扩增出内源性鸟类β-肌动蛋白基因，表明DNA质量满足后续分析。
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  毛滴虫属ITS1/5.8S/ITS2区域的PCR与序列分析：在267份β-肌动蛋白阳性样本中，76份（28.46%）ITS区域PCR呈阳性，包括弗兰卡的72只原鸽、里贝朗普雷图的1只黑头美洲鹫和雅博蒂卡巴尔的3只原鸽。对其中34个高强度条带产物测序，BLASTn显示与西班牙和中国的禽毛滴虫序列一致性为93.73%至100%。系统发育分析将34个序列分为两支：一支包含所有弗兰卡及一只雅博蒂卡巴尔原鸽序列，与多国鸽形目、鹰形目及雀形目序列聚在一起；另一支包含一只雅博蒂卡巴尔原鸽序列，与美国哀鸽（Zenaida macroura）的毛滴虫序列亲缘关系近。单倍型网络分析显示，研究获得的序列仅分布于18个单倍型中的两个（#4和#14）。
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  毛滴虫属铁氢化酶基因序列的PCR与分析：76份样本中，67份（88.15%）铁氢化酶基因PCR阳性（均来自弗兰卡原鸽）。序列与西班牙斑鸠（Streptopelia decaocto）的禽毛滴虫序列一致性为98%至100%。系统发育分析显示，这些序列分布于多个分支，支持率在60%至100%之间。单倍型网络分析揭示，研究序列分布在27个单倍型中的6个（#1, #4, #5, #6, #7, #8），其中三个单倍型（#4, #5, #6）完全由弗兰卡样本构成，显示出更高的遗传多样性。
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  毛滴虫属18S rRNA基因的PCR与序列分析：76份样本中，65份（85.5%）18S rRNA基因PCR阳性（均来自弗兰卡原鸽），其中7份适合测序。序列与美国哀鸽和葡萄牙原鸽的禽毛滴虫序列一致性为99%至100%。系统发育分析将序列分为四个分支。单倍型网络分析中，研究序列分布于13个单倍型中的三个（#1, #3, #10），其中单倍型#3和#10完全由弗兰卡原鸽序列构成。

讨论总结

本研究在圈养原鸽中发现了禽毛滴虫的高发生率，证实了鸽形目作为该病原主要宿主的作用。所有样本鸟类均未观察到临床症状，这可能与无毒力菌株或成年鸟类的免疫能力有关。系统发育分析表明，大部分序列与之前在鸽形目、隼形目和雀形目中报道的单倍型聚类，强化了鸽形目作为主要储存宿主和感染源的角色。雅博蒂卡巴尔的一个独特分支提示了局部遗传变异的存在。基于铁氢化酶和18S rRNA基因的分析比基于ITS的分析揭示了更高的遗传分化水平，表明显著更高的单倍型变异性，强调了使用多个分子标记对于全面评估禽毛滴虫复合体内遗传多样性的重要性。在诊断方法比较中，PCR（尤其是直接对口咽拭子进行）显示出比培养和细胞学染色更高的灵敏度，是检测禽毛滴虫的首选方法。培养法（Diamond培养基）虽比染色涂片更敏感，但需要样本采集后立即在37°C培养，限制了其在偏远地区流行病学研究的应用。涂片法灵敏度最低，不应作为诊断毛滴虫病的唯一实验室方法。未在DNA提取前进行清洗步骤可能因培养基或生物材料中的抑制剂而影响PCR性能。本研究未使用但未来可探索的实时PCR（qPCR）可能进一步提高灵敏度并量化寄生虫负荷。除了禽毛滴虫，其他物种如阴道毛滴虫样生物（T. vaginalis-like）和T. tenax等也在其他研究中有所报道，表明鸟类毛滴虫存在更大多样性。鉴于鸽形目被确认为主要宿主，动物园、康复中心和野生动物机构应评估感染康复后鸟类释放的风险，因为无症状携带者可能成为长期储存宿主，促进寄生虫传播。

结论

本研究在鸽类中发现了禽毛滴虫（T. gallinae）的高发生率，证实了这些动物作为该病原主要宿主的作用。PCR检测在本研究中显示出更高的灵敏度，特别是直接应用于口咽拭子时，被证明对禽毛滴虫的检测和分子表征都有用。鸟类口咽拭子涂片分析虽然快速易行，但对诊断禽毛滴虫感染的灵敏度低，不应作为诊断毛滴虫病的唯一实验室方法。尽管在Diamond培养基中培养寄生虫显示出良好的检测灵敏度，但样本必须在采集后立即置于该培养基中并在37°C孵育，这阻碍了该技术在偏远地区流行病学研究中的应用。在巴西东南部地区的原鸽中存在着不同的禽毛滴虫单倍型。与ITS1-5.8S-ITS2和18S rRNA区域相比，铁氢化酶基因被证明是区分禽毛滴虫单倍型能力最强的分子标记。