《Micro》：A Custom-Built SPIM Platform for Three-Dimensional Time-Lapse Imaging and Quantification of Anisotropic Tumor Spheroid Growth
Yudai Oda,
Masaki Miyamoto and
Shogo Miyata
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本研究针对机械约束下肿瘤球体生长与侵袭难以定量、三维、实时评估的技术瓶颈，开发了一套基于选择性平面照明显微镜（SPIM）的定制化监测平台。该系统整合了可维持生理培养条件的透明比色皿培养法，成功实现了对结直肠腺癌来源肿瘤球体在可控硬度基质中长达4天的三维动态观测。研究结果表明，基质刚度增强可同时促进肿瘤球体的体积增长率与各向异性侵袭，揭示了机械约束下肿瘤进展的力学调控机制，为探索受限微环境中肿瘤的力学生物学行为提供了新工具与新见解。
想象一下，一个微小的肿瘤细胞团被包裹在人体组织中，就像一颗被坚硬果肉包裹的种子。它不仅要分裂增殖，还要“感受”周围组织的软硬，并在压力的“指引”下，选择方向向外扩张。这种机械约束如何影响肿瘤的生长和侵袭行为，是癌症研究中的一个关键谜题。传统的研究方法，比如二维显微观察，往往只能看到一个侧面，难以捕捉肿瘤在三维空间中的真实扩张形态。而深度三维成像技术，如共聚焦显微镜，又因成像深度有限、光毒性强等问题，不便于对活体样本进行长期、动态的观测。因此，开发一种能够对机械约束下的肿瘤进行长时间、三维、动态观察的新方法，对于揭示肿瘤进展的力学生物学机制至关重要。
近期，发表在期刊《Micro》上的一项研究，为我们带来了一把观察这个微观世界的新“钥匙”。由Yudai Oda, Masaki Miyamoto 和 Shogo Miyata组成的研究团队，成功开发了一套名为“定制化选择性平面照明显微镜（SPIM）监测平台”的系统。这项研究巧妙地将光学成像技术与细胞培养工程相结合，专门用于在模拟体内机械约束的环境下，对肿瘤球体（一种三维肿瘤模型）的生长和侵袭进行定量、三维、延时成像分析。研究人员将人结直肠腺癌细胞（DLD-1）形成的肿瘤球体，包裹在不同硬度的琼脂糖凝胶中，以模拟从柔软到坚硬的不同组织微环境。借助其开发的SPIM系统，他们能够连续四天对活体肿瘤球体进行三维“CT扫描”，并精确计算出其体积变化和形状的不对称性（各向异性）。研究得出了一个重要结论：周围的基质越硬（机械约束越强），肿瘤球体不仅长得越快，而且其生长方式会从不均匀的球形（各向同性）转变为方向性更强的、不规则的形状（各向异性）。这直接证明了机械约束能“刺激”肿瘤的扩张，并引导其侵袭方向。这项研究为深入理解肿瘤如何在受限空间中“野蛮生长”提供了全新的视角和强大的工具。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：一是基于开源平台OpenSPIM，搭建了定制化的选择性平面照明显微镜（SPIM）系统，其核心是利用薄片光照明以减少光毒性，实现活细胞的长时程三维成像。二是设计并集成了带有温控和气体控制的培养适配模块，确保样本在成像过程中的生理活性。三是建立了琼脂糖凝胶包裹的肿瘤球体培养模型，通过改变琼脂糖浓度（0.5%至2.0%）来精确调控包裹基质的硬度，以模拟不同的机械约束条件。四是利用PKH67荧光染料对细胞膜进行长效标记，以进行荧光成像。五是通过图像处理软件对采集的三维图像堆栈进行重建、分割和定量分析，包括计算体积比和各向异性指数。
3.1. 细胞活力和肿瘤球体在透明比色皿中的二维观察
通过二维明场成像观察，研究人员发现，在4天的培养期内，肿瘤球体在透明比色皿中持续生长，且其生长行为受周围基质刚度影响。在低硬度（0.5%琼脂糖）条件下，球体尺寸变化有限；而在高硬度（2.0%琼脂糖）条件下，球体尺寸增加更显著，并呈现方向性生长趋势。通过钙黄绿素-AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI）染色评估细胞活力，结果显示在培养第4天，球体内部广泛存在活细胞，死细胞稀少且无特定分布，证明该SPIM监测平台维持了适合肿瘤球体长期三维观察的生理培养条件。这表明，该系统不仅能实现成像，还能保证样本的活性，是进行可靠生物学观察的基础。
3.2. 肿瘤球体生长和异向性侵袭的三维特征
通过SPIM系统获取连续图像堆栈并三维重建，研究人员得以从立体空间定量评估肿瘤球体的生长。结果显示，在所有约束条件下，球体均发生体积扩张，但增加基质刚度会降低球体的对称性，表明存在基质刚度依赖的各向异性生长。具体而言，在低硬度基质中，球体体积仅发生微小变化，生长方式接近各向同性；而在高硬度基质中，球体体积增长率更高，且各向异性指数（a）随时间显著增加，尽管该指数可能低估了局部突起等复杂的生长模式。这些发现共同表明，基质硬度增加能同时增强肿瘤球体的体积增长和各向异性侵袭。研究人员分析，在机械约束条件下，细胞增殖产生的内压可能促使细胞表型从增殖性向侵袭性转变，从而导致非均匀的扩张。
综上所述，本研究成功开发并验证了一种基于SPIM的三维成像监测平台。该平台通过集成可控制培养环境的透明比色皿方法，能够在长达4天的时间内，对机械约束条件下的肿瘤球体进行稳定、生理相容的三维动态观察。研究结论明确指出，肿瘤球体在低硬度基质中倾向于各向同性扩张，而增加的基质刚度则会促进其各向异性生长。这直接揭示了机械微环境的物理属性（刚度）是调控肿瘤三维生长模式和侵袭方向的关键因素。这项工作的主要意义在于，它为研究受限三维微环境中肿瘤生长的力学生物学（mechanobiology）机制，提供了一个实用、可定量的分析工具。该平台未来有望应用于药物筛选、肿瘤侵袭机制等更广泛的研究中，帮助我们更深入地理解肿瘤在复杂体内环境中的行为，并为开发针对肿瘤微环境力学特性的新型治疗策略提供思路。
