《Cell Stress and Chaperones》：Nucleotide-Dependent Domain Interactions of Aha1-Type Co-chaperones with Hsp90 Reveal Evolutionarily Conserved Binding Determinants
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本文系统研究了Aha1型共伴侣蛋白与分子伴侣Hsp90在不同核苷酸状态下的结合机制。通过等温滴定量热(ITC)和ATP酶活性测定，发现Aha1的C端结构域是稳定结合Hsp90核苷酸结合闭合状态的关键模块，连接区也参与其中，而该功能在物种间具有保守性。这为理解Hsp90-共伴侣蛋白-客户蛋白复合物的动态调控提供了新见解。
Hsp90：关键的分子伴侣及其共伴侣调控
分子伴侣Hsp90在细胞中扮演着至关重要的角色。它是一个同源二聚体，负责众多“客户蛋白”的成熟、激活、稳定和折叠。这些客户蛋白包括离子通道、激酶、转录因子、类固醇激素受体等多种类型，是维持细胞功能所必需的。Hsp90通过一个动态的ATP驱动构象循环来工作，这个循环受到一类被称为共伴侣蛋白的辅助蛋白的精确调控。
Hsp90的结构与Aha1型共伴侣蛋白
Hsp90包含一个N端ATP结合结构域，通过一个带电荷的连接区与中间结构域相连，最后是作为二聚化界面的C端结构域。当结合核苷酸时，Hsp90会采取一种“闭合”构象，其特征是其N端结构域发生暂时的二聚化。
在众多共伴侣蛋白中，Aha1（Hsp90 ATP酶激活蛋白1）及其较短的酵母同源物Hch1（Hsp90蛋白1的高拷贝抑制子）尤为引人关注。Aha1在整个真核生物中保守存在，而较短的Hch1仅存在于酵母中。酵母Aha1包含一个通过非结构化连接区与C端结构域相连的N端结构域，而Hch1则仅包含一个在结构上同源于Aha1 N端结构域的单一结构域。尽管存在差异，两者都参与刺激Hsp90的ATP水解并调节其功能。Aha1的N端结构域包含两个高度保守的序列基序：由NxNNWHW基序定义的ATP酶刺激环(ASL)和由RKxK基序定义的结合与定位基序(BPM)，它们在调节Hsp90的ATP酶活性中发挥重要作用。
Aha1和Hch1能结合Hsp90的两种核苷酸状态
最近解析的冷冻电镜结构揭示，在Apo状态（无核苷酸结合），Aha1的两个结构域与Hsp90二聚体的两个中间结构域相互作用。当Hsp90结合ATP后，Aha1的N端结构域会发生剧烈的构象变化，脱离中间结构域并向上倾斜，与二聚化的N端结构域接触。在这个过程中，Aha1的C端结构域也会重新定位，与Hsp90的中间结构域建立新的接触。
尽管这些结构研究取得了进展，但Aha1中识别不同核苷酸状态的决定因素，以及其结构域架构如何实现在Hsp90伴侣循环的连续构象转变中稳定结合，仍不清楚。为了直接解决这些问题，研究者利用等温滴定量热(ITC)技术，测量了Aha1及其酵母同源物Hch1在Apo条件以及存在非水解ATP类似物AMPPNP的条件下与Hsp90的结合。
结果发现，全长Aha1既能结合Apo状态的Hsp90，也能结合AMPPNP结合（闭合）状态的Hsp90，且与后者的结合更紧密。有趣的是，仅由N端结构域组成的Hch1同样能够结合Hsp90的这两种核苷酸状态。这表明Aha1和Hch1可以不依赖于Hsp90的核苷酸状态与之相互作用。
Aha1的N端结构域（1-156）选择性结合Hsp90的Apo状态
既然全长Aha1能结合两种核苷酸状态，那么与闭合的ATP结合构象的结合是否需要Aha1的N端和C端结构域共同提供的多价相互作用？还是像Hch1那样，仅Aha1的N端结构域就足够了？实验给出了意想不到的答案：分离的Aha1 N端结构域（Aha1N156）只能检测到与Hsp90的Apo状态结合，而与AMPPNP结合的构象没有可测量的结合。这与全长Aha1和Hch1形成了鲜明对比。这表明Aha1的C端结构域对于维持与Hsp90核苷酸结合状态的相互作用很重要。
连接区延伸恢复闭合状态结合
在Hsp90的ATP结合状态，重新定位的Aha1 N端结构域在接触Hsp90二聚化N端结构域时，其超出第156位残基的连接区还有额外的14个残基延伸，这些残基似乎参与了由BPM和ASL定义的结合界面。那么，这些额外的连接区残基是否能在没有C端结构域的情况下，为闭合状态的结合提供额外的接触或帮助稳定N端结构域所需的构象重定向呢？
为了验证这一点，研究者构建了一个包含这14个连接区残基的扩展Aha1 N端截短体（Aha1N170），并测量了它与Hsp90在Apo和AMPPNP条件下的结合亲和力。结果令人惊讶：增加这14个连接区残基后，Aha1N170恢复了对AMPPNP结合Hsp90的结合能力。这表明，即使没有Aha1的C端结构域，连接区的这一小段延伸也足以实现与闭合状态的结合。然而，这个短的连接区片段并未赋予与全长Aha1相同的高结合亲和力，说明C端结构域在结合中扮演着重要的额外角色。
Aha型共伴侣蛋白C端结构域的功能具有进化保守性
实验数据表明Aha1的C端结构域是结合并稳定Hsp90的AMPPNP结合（闭合）状态所必需的。那么，适应不同核苷酸状态的能力是否是Aha型共伴侣蛋白C端结构域的一个进化保守功能？换句话说，与开放和闭合两种核苷酸状态相互作用的能力，是否依赖于C端结构域的共同结构特征，而非精确的序列同一性？
为了验证这一点，研究者构建了嵌合蛋白，将酵母Aha1N156或Aha1N170与人源Ahsa1的C端结构域融合，并测量了它们与Hsp90在Apo和AMPPNP结合状态下的亲和力。两种嵌合体都能与Hsp90的两种状态结合。这表明，由C端结构域介导的闭合状态稳定和结合功能，是Aha型共伴侣蛋白的一个进化保守的功能特征，而非酵母Aha1独有的特性。然而，嵌合体的亲和力仍显著弱于全长酵母Aha1。这种差异表明，虽然人源Ahsa1的C端结构域可以支持闭合状态结合，但最佳的稳定作用可能还需要来自天然酵母Aha1连接区和结构域间架构的额外协同贡献。
ATP酶活性分析
先前研究表明，Aha1可以通过降低能量势垒来结合并加速Hsp90的ATP水解，促进Hsp90更快地获得N端二聚化状态。为了确定ITC实验中观察到的核苷酸依赖性结合差异是否转化为功能效应，研究者在ATP酶刺激实验中测试了Hch1和各种Aha1截短体及嵌合体对Hsp90 ATP酶活性的影响。
与之前的工作一致，Aha1能在很大程度上刺激Hsp90的ATP酶活性，而Hch1的刺激程度则低得多。所有其他测试的Aha1构建体（Aha1N156, Aha1N170, 以及两种嵌合体）也都能刺激Hsp90的ATP酶速率。这表明Aha1的N端结构域可以通过促进早期构象重排来动态刺激ATP水解，而与Hsp90 N端二聚化状态的稳定结合则需要C端结构域或连接区延伸提供的额外接触。
讨论与模型
Aha1是迄今为止发现的唯一能有效刺激Hsp90固有低ATP酶活性的共伴侣蛋白，已成为Hsp90构象循环的核心调节因子。本研究支持一个分层模型：Aha1的N端结构域介导对Apo状态Hsp90的初始识别；连接区实现了核苷酸依赖性重定位，以进行闭合状态结合；而C端结构域则稳定了这一构象。在这个稳定的复合物中，保守的BPM在结构上定位了ASL，使其与Hsp90二聚化的N端结构域产生高效相互作用，从而让ASL能够最大程度地刺激Hsp90的ATP水解。这个框架将核苷酸状态结合、构象稳定和催化加速分解为不同但协同的步骤。
总之，这项工作揭示了Aha1型共伴侣蛋白与Hsp90相互作用的精细机制，强调了C端结构域和连接区在适应Hsp90构象循环中的关键作用，并证明了这些功能在进化上是保守的。这些发现为了解Hsp90如何在其共伴侣蛋白的调控下实现客户蛋白的特异性折叠结果提供了新的见解。
