《PLOS One》：Antitumoral immunity induced by gel ethanol ablation to treat unresectable colorectal cancer metastases in the liver
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本研究针对不可切除性结直肠癌（CRC）肝转移的治疗难题，探索了凝胶乙醇（EC-ethanol）消融疗法的抗肿瘤免疫效应。研究人员通过单侧和双侧小鼠CRC肿瘤模型，发现EC-ethanol治疗可显著上调促炎细胞因子IL-6和KC/GRO，诱导肿瘤坏死，并招募细胞毒性T细胞（CTLs）至消融区及对侧肿瘤，与射频消融（RFA）联合使用时效果更佳。结果表明，EC-ethanol是一种可诱导局部和全身性抗肿瘤免疫反应的新型疗法，为CRC治疗提供了潜在新策略。
在全球范围内，结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是癌症相关死亡的第二大原因，其沉重的疾病负担预计到2040年将翻倍。近四分之一的CRC患者会发展为肝转移，而肝转移的治疗方案有限。虽然手术切除和肝移植能够显著提高患者生存率，但仍有15%至30%的患者因存在广泛的肝外疾病、缺乏合适的器官供体或术后肝功能不足等原因而不符合这些治疗条件。对于这部分不可切除的患者，局部消融疗法，特别是射频消融（Radiofrequency Ablation, RFA），成为一种重要的替代选择。RFA通过热能破坏肿瘤，但存在“热沉效应”等局限，不适用于靠近大血管或关键结构的肿瘤。乙醇消融作为一种化学消融方法，通过直接向肿瘤内注射纯乙醇诱导坏死，不受RFA缺点的限制。然而，乙醇消融本身也存在乙醇渗漏的问题，这会影响疗效并可能导致靶外组织损伤。为了克服这一难题，研究人员在乙醇中添加了聚合物乙基纤维素（Ethyl Cellulose, EC），形成凝胶乙醇（EC-ethanol），提高了乙醇在注射部位的保留率。先前的研究表明，EC-ethanol不仅能更有效地消融肿瘤，还可能像RFA等其他消融疗法一样，刺激抗肿瘤免疫反应。但其在CRC肿瘤中诱导的免疫效应尚不清楚。因此，本研究的核心目标正是探究EC-ethanol消融在CRC肿瘤中引发的免疫学变化，评估其作为治疗CRC肝转移新方法的潜力。这项研究成果最终发表在《PLOS One》期刊上。
为了探究上述问题，研究人员主要应用了以下几项关键技术方法：首先，他们构建了CT26小鼠结直肠癌模型，包括单侧和双侧腹股沟肿瘤模型。其次，对肿瘤实施局部消融处理，包括EC-ethanol消融、RFA、EC-ethanol与RFA联合治疗以及假手术对照。再者，在治疗后的不同时间点（如6小时、3天、7天）采集小鼠血清，并利用电化学发光法对包括IL-6、KC/GRO在内的多种促炎细胞因子进行分析。最后，对治疗后的肿瘤组织进行组织病理学分析，通过苏木精-伊红染色观察肿瘤坏死情况，并利用免疫组织化学染色检测和定量分析肿瘤内及肿瘤消融区边缘CD8a阳性细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T-lymphocytes, CTLs）的浸润情况。所有图像分析和细胞计数均在HALO软件中完成。
以下是该研究的主要结果及发现：
EC-ethanol treatment increased expression of pro-inflammatory cytokines（EC-ethanol治疗上调了促炎细胞因子的表达）
研究人员检测了EC-ethanol治疗后小鼠血清中细胞因子的变化。结果显示，在消融后6小时，促炎细胞因子白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）和角质形成细胞趋化因子/人类生长调节趋化因子（Keratinocyte chemoattractant / human growth-regulated chemokine, KC/GRO）的表达量分别比假手术组显著增加了27倍和7倍。这表明EC-ethanol治疗迅速引发了强烈的炎症反应。随后在治疗后3天和7天，这两种细胞因子的表达水平逐渐下降，趋于基线水平。而其他检测的细胞因子在治疗组间未显示出显著差异。
EC-ethanol treatment induced large regions of tumor necrosis（EC-ethanol治疗诱导了广泛的肿瘤坏死区域）
通过对肿瘤组织进行H&E染色分析，研究人员发现，EC-ethanol治疗在肿瘤内部形成了明显的消融区。与仅见零星液化性坏死灶的假手术组相比，EC-ethanol处理后的肿瘤在第3天和第7天均出现了大范围的坏死区域，包含凝固性坏死和液化性坏死两种模式。定量分析显示，EC-ethanol治疗诱导的坏死面积（占肿瘤总面积百分比）在治疗后第3天和第7天均显著高于假手术组，分别达到约41%和34%，证实了其强大的局部肿瘤杀伤能力。
Cytotoxic T-cells accumulated within ablation zone vicinity（细胞毒性T细胞在消融区周围聚集）
通过免疫组化检测CD8a阳性CTLs，研究发现EC-ethanol治疗后，肿瘤内特别是消融区周围（定义为消融区外400微米宽的边缘地带）的CTLs密度显著增加。在治疗后第3天，消融区边缘的CTL密度比假手术组高1.4倍；到第7天，这一差异扩大至4.3倍。这说明EC-ethanol治疗不仅直接杀伤肿瘤，还吸引了大量的效应性T细胞聚集在治疗区域的边界，形成了针对残存肿瘤细胞的免疫监视和攻击前线。
Increased cytotoxic T-cells within the contralateral tumor after 7 days post-ablation（消融后7天，对侧肿瘤内的细胞毒性T细胞增加）
为评估EC-ethanol是否能够引发远端（abscopal）抗肿瘤效应，研究人员在双侧肿瘤模型中，仅对原发性肿瘤进行消融，然后观察对侧（未处理）肿瘤的免疫变化。结果显示，在治疗后第7天，无论是EC-ethanol单独治疗还是RFA单独治疗，都导致了对侧肿瘤内CTLs数量的增加，与假手术组相比分别有1.6倍和1.2倍的提升。更为重要的是，当EC-ethanol与RFA联合使用时，对侧肿瘤内（特别是肿瘤外周边缘）的CTLs密度比假手术组显著增加了2.2倍。这表明EC-ethanol与RFA联合治疗在诱导全身性抗肿瘤免疫反应方面可能存在协同增效作用。
结论与讨论
本研究系统地评估了EC-ethanol消融治疗在小鼠CRC模型中的局部和全身性抗肿瘤免疫效应。研究发现，EC-ethanol治疗能在早期（治疗后6小时内）快速、显著地诱导促炎细胞因子IL-6和KC/GRO的表达上调，表明其触发了强烈的炎症反应。随后，这种早期的炎症反应似乎转向适应性免疫阶段，表现为大量CD8a阳性的CTLs被招募至原发肿瘤的消融区及其边缘，形成了密集的免疫细胞浸润带。这一过程与肿瘤内大范围的凝固性和液化性坏死区域的出现相伴随。更重要的是，在双侧肿瘤模型中，对原发性肿瘤进行EC-ethanol消融后，未处理的对侧肿瘤内部也观察到了CTLs数量的增加，这证明了EC-ethanol能够诱导远端抗肿瘤效应。当EC-ethanol与传统的RFA联合使用时，这种对侧肿瘤的CTLs浸润进一步增强，提示两种疗法在激发系统性抗肿瘤免疫方面具有潜在的协同作用。
本研究的结果具有重要的理论和临床意义。首先，它首次在CRC模型中详细阐明了EC-ethanol消融所引发的免疫学变化，填补了该领域的研究空白。其次，研究证实EC-ethanol不仅能有效破坏局部肿瘤，还能激活全身性的抗肿瘤免疫，这为治疗多发或转移性肿瘤提供了新思路。最后，EC-ethanol与RFA联合治疗显示出更强的免疫激活潜力，这为开发更有效的组合消融疗法提供了实验依据。不过，研究也存在一些局限，例如使用的是皮下移植瘤模型而非原位模型，观察时间点有限，且由于CT26肿瘤模型本身具有高度免疫原性，可能部分掩盖了治疗与对照组的差异。未来的研究需要在更贴近临床的模型中进行，并延长观察周期，评估其对生存率的影响，同时探索与免疫检查点抑制剂等免疫疗法的联合应用潜力。
总而言之，这项研究证明，作为一种新型的局部消融技术，凝胶乙醇（EC-ethanol）消融能够通过诱导肿瘤坏死、触发炎症反应和招募细胞毒性T细胞，在结直肠癌中产生局部和系统性的抗肿瘤免疫效应，是治疗不可切除性CRC肝转移的一个强有力的潜在治疗候选方案。
