墨西哥尤卡坦半岛特有的热带藻类Eucheumatopsis isiformis（属于Solieriaceae科、红藻门）的培育潜力

《PLOS One》：Cultivation potential of the tropical carrageenophyte Eucheumatopsis isiformis (Solieriaceae, Rhodophyta) from Yucatán, Mexico

　　摘要
在过去十年中，热带红藻（统称为eucheumatoids）的产量停滞或下降。这一趋势主要归因于高质量种植材料的供应不足、疾病发生的增加以及栽培种群与野生种群之间的遗传交流不足。因此，通过控制繁殖策略来提高商业海藻养殖的物种多样性仍然是一个重要的全球性挑战。Eucheumatopsis isiformis是一种原产于热带大西洋的红藻，含有大量的iota-卡拉胶，具有kappa-iota-nu卡拉胶的混合结构，是有潜力用于商业作物多样化的候选物种。本研究首次成功诱导了该物种的孢子形成，从而扩展了对其繁殖物候的认识，并支持了从孢子进行栽培的可能性。分子分析确认了所检查的三种形态类型都属于E. isiformis，且它们的卡拉胶产量相当。这些发现为开发基于孢子的生产系统奠定了坚实的基础。在适应期5天和10天后，成功诱导出了孢子形成，其中在10^-3 M浓度的腐胺处理下获得了最高的孢子密度。最佳孢子发育发生在光照强度为40 μmol·m-2·s-1时。这些发现突显了通过改进选育和驯化协议来促进E. isiformis栽培的潜力，这种方法也可能适用于其他eucheumatoid物种。

引言
全球海藻产量从2000年的1200万吨增加到了2022年的3800万吨[1]。然而，对于eucheumatoids来说，自2013年以来生物量产量下降与种子库存的遗传多样性低、环境条件波动、极端气候事件以及生物安全法规和政策框架的不完善或不一致有关[2]。为了满足对卡拉胶的需求，人们开始关注利用野生繁殖材料进行遗传多样化以提升产量[3-5]。此外，其他具有栽培潜力的物种也被考虑，包括原生eucheumatoid Eucheumatopsis isiformis[6-14]。在海藻育种和苗圃系统中，遗传交流在塑造基因型和表型方面起着关键作用[15-17]。因此，了解野生海藻种群对长期局部环境变化的繁殖物候、系统地理学和基因组适应性对于发展可持续的海藻养殖实践至关重要[18-22]。关于季节性和年际生化及生理变化的研究为优化变化气候条件下的栽培策略提供了重要见解。此外，在菌株的选择、改良和保护中使用分子标记对于提高海藻产业的韧性和生产力至关重要[23,24]。遗传信息具有重要的系统学[25-28]和生态学意义，这与海藻的生命周期密切相关[20,29,30]。在eucheumatoids中，其生命周期遵循红藻典型的三相生命周期模式，尽管某些物种会表现出次级衍生特征[31-33]。关于E. isiformis繁殖的研究很少[34,35]，大多数繁殖研究集中在商业化的Eucheuma/Kappaphycus物种上[36]。其他研究描述了E. isiformis的形态和解剖结构，主要是为了分类学和生态学目的[34,35,37-40]。相比之下，使用外源性诱导剂诱导孢子释放的实验主要在其他红藻类群中进行[41-47]。本研究旨在通过分析墨西哥湾南部尤卡坦海岸原生形态类型的形态和解剖特征来评估E. isiformis的繁殖能力。此外，该研究还为使用外源性诱导剂进行E. isiformis的孢子栽培提供了重要信息，支持物种多样化、选育和可持续海藻养殖的努力。

材料与方法
**标本采集**
Eucheumatopsis isiformis标本采集自墨西哥尤卡坦的Dzilam de Bravo（21° 23.861'N, 88° 54.11'W），深度为2-4米。出于科学研究目的，手工采集海藻不需要许可证或许可。2022年3月至11月和2023年3月，每月收集携带囊果的雌性配子体，用于形态和解剖特征分析，地点为国立理工学院高级研究中心的应用藻类学实验室（Unitad Mérida）。2024年3月至6月及2025年2月至3月，每月收集代表不同生命周期阶段的额外标本，以评估繁殖阶段并进行孢子形成实验。样本使用冷却剂和密封塑料袋在低温条件下运输至实验室。用于分子分析的2023年9月至12月（13个标本）和2024年3月（16个标本）收集的E. isiformis标本，以及LabMEX实验室的Kappaphycus alvarezii菌株，先用硅胶干燥，随后保存在真空密封袋中。分子分析在墨西哥下加利福尼亚自治大学的流行病学与分子生态学实验室进行。

**分子分析**
使用CTAB/PVP（十六烷基三甲基溴化铵/聚维酮）方案[48]及改进方法[49]从约0.02至0.04克干燥组织中提取基因组DNA。DNA浓度使用Nanodrop分光光度计定量，稀释至50 ng/μL，并在-20°C下保存以备进一步分析。在相同的PCR条件下扩增了三个遗传标记cox1[50]、rbcL[51]和RuBisCo spacer[52]。PCR反应（25 mL）包含0.1–0.2 mg DNA模板、PCR缓冲液（1 mM Tris-HCl；pH 8.3；1.5 mM MgCl2；50 mM KCl；0.02 mM dNTP）、每种引物10.0 pmol、0.3单位Taq聚合酶（Kappa）和2 mg/mL牛血清白蛋白。PCR产物在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，用GelStar染色，在100 V电压下运行40分钟，然后在紫外光下观察。扩增产物在Applied Biosystems 377测序仪（美国福斯特城）上进行正向和反向测序。为质量控制，每个形态类型重新提取一个个体并重新分析。使用Codon Code Aligner[53]检查序列电泳图的质量并进行编辑。所有序列使用CLUSTAL[54]对齐，并在MEGA5[55]中分析。从GenBank获取的Eucheumatopsis isiformis及其同物异名Eucheuma isiforme[44]的序列作为三个位点的外群。所有特征均予以同等权重处理，缺失数据视为空白。使用MEGA X[56]评估物种内部和之间的遗传分化差异。根据赤池信息量准则[57]，使用jModelTest v2.1.17[58]选择最佳拟合进化模型。使用BEAST 2.5[59]和放松的分子钟模型、Yule物种形成模型以及012343+I+G+F突变模型，从联合同型数据集中推断出贝叶斯系统发育树。

**卡拉胶提取**
分析了2022年收集的E. isiformis形态类型的卡拉胶含量。采用微波辅助提取（MAE）方法，使用 Microwave Accelerated Reaction System（MARS6，CEM公司，美国），按照[61]描述的方案提取了原生卡拉胶和碱处理卡拉胶（n=3）。具体步骤如下：将干燥的海藻在室温下用1% KOH溶液（1:50 w/v）重新水化12小时。然后在封闭容器系统（OMNI XP 1500）中加热。微波热程序包括5分钟预热和10分钟提取（105°C）。提取后，将溶液与硅藻土（Celite）混合，过滤，并用10N HCl将滤液调至pH 8.5–8.6。通过缓慢加入2% Cetavlon（十六烷基三甲基溴化铵）在9:1（v/v）蒸馏水/丙酮溶液中沉淀卡拉胶，并在滤纸上回收。纤维状卡拉胶用95%乙醇饱和的乙醇洗涤三次以去除残留的Cetavlon，再用95%乙醇洗涤三次以去除钠醋酸盐。样品在60°C下干燥24小时后称重计算产量。对于原生卡拉胶提取，省略了最初的KOH处理步骤。

**形态和解剖特征分析**
2022年和2023年收集的E. isiformis标本经过清洁和特征分析。记录每个标本的形态和解剖特征，包括藻体高度、分枝模式、分枝形状、长度和直径、顶端形状、刺或小枝的存在和形态、刺的长度、分枝级数、繁殖结构的存在以及囊果密度。制备轴的横截面和纵截面以测量分枝直径。作为对比，还分析了来自美国佛罗里达州Bahia Honda的E. isiformis标本。在成熟的雌性配子体中，对囊果进行解剖描述并按成熟阶段分类。使用立体显微镜（Leica Zoom 2000）和光学显微镜（Leica DM 1000 LED和Zeiss Primostar）拍照。为了确定囊果的成熟度，测量囊果直径（mm）、果皮厚度（μm）、孢子囊长度和宽度（μm）。在2022年3月至11月期间，至少测量每个标本中部区域的30个囊果的果皮厚度。使用Methylene blue和Alcian blue染色制备样品。从2022年3月到11月，统计每个藻体每10厘米分枝上的囊果数量。2023年3月，对每个标本的三个一级分枝的囊果密度、分布和孔口特征进行了分析。孔口被分类为突出、可区分的开放或开口、发育但着色、闭合或变形/破裂。对于四孢子体阶段的标本，测量分枝长度和直径。使用Zeiss Primostar光学显微镜和Zeiss Axiocam 208彩色相机拍摄横截面和纵截面照片，然后用Zeiss ZEN 3.9软件处理图像。

**孢子形成实验**
2024年和2025年收集的具有繁殖能力的Eucheumatopsis isiformis用于使用外源性诱导剂进行孢子形成实验。标本在低温下运输至实验室，并用软毛刷、5%酒精和无菌海水清洗。随后在Thermo Scientific Precision制冷培养箱中于23°C和25°C、30 PSU盐度、10^-15 μmol·m-2·s-1辐照度、8:16 h光照周期和恒定通风条件下适应5-10天。这些条件基于先前的研究[41-47]和初步适应测试确定。每两天更换一次无菌海水，并在整个适应期间保持这些条件。下面描述的所有处理过程中，用于处理繁殖标本和囊果的所有材料都进行了消毒。海水通过5 μm水过滤器（Pentair P5）过滤，经过紫外线灭菌（Tropical Marine Center P6-330W）和15 PSI高压灭菌15分钟。无法高压灭菌的材料暴露在紫外线下15分钟。刷子和镊子在使用前用5%酒精和火焰进行消毒。使用立体显微镜（Leica Zoom 2000）检查每个标本的囊果。从每个标本中随机选取五个囊果的横截面，以验证特征性的成熟结构，包括中央融合细胞周围的双倍体candelabra状生殖细胞和延伸到果皮中的丝状物。在光学显微镜（Zeiss Primostar）下选择具有可辨认孔口的开放或正在形成的囊果，或只含有少量孢子的囊果。选择2.5 cm长的含有成熟囊果的片段进行孢子诱导实验。首先将片段浸入10 mL碘溶液（每100 mL无菌蒸馏水含10 mL）中5分钟，然后浸入0.5 mL氯溶液（每100 mL无菌蒸馏水含1 mL）中5秒。最后，将片段放入含有100 mg Benzyl Penicillin G和250 mg Ampicillin的100 mL无菌蒸馏水溶液中12小时。抗生素处理后，将含有囊果的片段放入含有5 mL Provasoli培养基（PES 4%）的15 mL试管中，每个处理重复三次。应用的外源性多胺诱导剂为腐胺（PUT）和精胺（SPM），浓度分别为10^-3和10^-6 M，PES 4%作为对照组。试管在Thermo Scientific Precision Incubator中于23°C下培养，光照周期为8:16 h（光:暗），盐度为30 PSU，三种辐照度水平（0、20和40 μmol·m-2·s-1）。条件根据其他红藻的研究[62-65]针对E. isiformis进行了优化。每个片段每24小时转移一次到新鲜培养基中，连续五天，并每天记录释放的_carpospores数量。为了确定最终的孢子密度，从每个试管中取出1毫升样本进行匀浆处理，然后用Sedgewick-Rafter计数室进行计数。使用配备Zeiss Axiocam 208彩色相机的Zeiss Primostar光学显微镜和Zeiss ZEN 3.9软件进行摄影记录。对角蛋白含量、囊果直径和释放的_carpospores数量的数据应用了Shapiro-Wilk正态性检验和Levene方差齐性检验。当数据不满足单因素方差分析（ANOVA）的要求时，使用了非参数Kruskal-Wallis检验。组间显著差异通过ANOVA后跟Tukey Unequal N多重比较检验或非参数Dwass-Steel-Critchlow-Fligner检验来确定。统计显著性阈值定义为：p<0.01（*）和p<0.001（**），并在表格和图表中直接标注。角蛋白含量的结果以至少三个独立重复样品的平均值±标准误差表示，数据未经过转换，使用SPSS V24.0软件进行统计分析。对于囊果直径和释放的_carpospores数量的变化，数据以至少四个独立重复样品的平均值±标准误差表示，数据未经过转换，使用Jamovi 2.6.44软件进行统计分析。图表是使用Jamovi 2.6.44和R 4.5.2软件制作的。

每个片段连续五天每24小时转移一次到新鲜培养基中，并每天记录释放的carpospores数量。为了确定最终的孢子密度，从每个试管中取出1毫升样本进行匀浆处理，然后用Sedgewick-Rafter计数室进行计数。使用Zeiss ZEN 3.9软件和配备Zeiss Axiocam 208彩色相机的Zeiss Primostar光学显微镜以及Zeiss ZEN 3.9软件进行摄影记录。对角蛋白含量、囊果直径和释放的carpospores数量的数据应用了Shapiro-Wilk正态性检验和Levene方差齐性检验。当数据不满足单因素方差分析（ANOVA）的要求时，使用了非参数Kruskal-Wallis检验。组间显著差异通过ANOVA后跟Tukey Unequal N多重比较检验或非参数Dwass-Steel-Critchlow-Fligner检验来确定。统计显著性阈值定义为：p<0.01（*）和p<0.001（**），并在表格和图表中直接标注。角蛋白含量的结果以至少三个独立重复样品的平均值±标准误差表示，数据未经过转换，使用SPSS V24.0软件进行统计分析。对于囊果直径和释放的carpospores数量的变化，数据以至少四个独立重复样品的平均值±标准误差表示，数据未经过转换，使用Jamovi 2.6.44软件进行统计分析。图表是使用Jamovi 2.6.44和R 4.5.2软件制作的。

分子分析：从在尤卡坦收集的29个样本中获得了cox1（540 bp）、rbcL（470 bp）和RuBisCo间隔区（300 bp）的部分序列（见S1文件中的S1表）。确定了三种形态类型，分别称为M1、M2和M3。根据这些序列数据，分子分析表明，无论形态类型如何，这些样本与E. isiformis没有显著差异（见图1）。

我们的E. isiformis样本与先前发表的来自墨西哥尤卡坦[32]和美国佛罗里达[66]的rbcL序列（GenBank登录号为MG948344和AF099691）具有100%的序列相似性。同样，来自墨西哥坎佩切[32]和美国佛罗里达[67]的cox1序列（MG948345和MN941986）也与我们的样本有99%的相同性。E. isiformis（来自尤卡坦[32]）与本研究中分析的形态类型之间的遗传分化为：rbcL区域0.80%，cox1和RuBisCo区域0.99%。相比之下，我们的形态类型与Eucheuma denticulatum之间的遗传分化为rbcL基因7%。在尤卡坦收集的29个样本中，检测到了三种单倍型，它们仅在一个核苷酸上存在差异（见S1文件中的S1表）。E. isiformis的参考序列（GenBank MG948361）与Dzilam收集的E. isiformis单倍型在四个核苷酸上有所不同。系统发育树显示两个主要分支：一个包括Eucheuma–Eucheumatopsis物种，另一个对应于Kappaphycus alvarezii。在Eucheuma–Eucheumatopsis分支内，进一步分辨出两个亚支：一个包含所有先前记录为Eucheumatopsis spp.的序列，另一个包含与E. isiformis分组的Dzilam样本。

角蛋白含量：2022年3月至11月收集的E. isiformis形态类型的角蛋白产量（%干重）和角蛋白硫酸盐含量见S1文件中的S2表。天然角蛋白产量范围为39.3±1.3%至58.0±1.2%干重，不同形态类型之间没有显著差异（F=0.056，p=0.946）。经碱处理后，平均产量减少了12.6%，同时硫酸盐含量减少了5.8%。碱处理后的角蛋白产量范围为35.3±1.1%至46.3±0.8%干重。M1和M2之间存在显著差异（F=9.57，p<0.01）。角蛋白产量数据满足正态性（W=0.96，p=0.82）和方差齐性（F=0.49，p=0.64）的假设。2022年3月至11月角蛋白产量的变化分析显示，M1在7月产量最高（57.4±0.9%干重），并且在整个监测期间都存在。M3在7月的平均最高产量为58.0±1.2%干重，而M2在5月的最高产量为53.6±1.8%干重，但在年内其他时间非常稀少。

形态学和解剖学特征：在Dzilam de Bravo收集的E. isiformis形态类型的形态学和解剖学特征见S1文件中的S3表。结果显示出不同的形态、厚度和分枝模式，尽管也有一些相似之处。例如，M2与M1共享某些形态特征，但在侧枝数量上有所不同。相比之下，M3在轴和枝的厚度以及覆盖整个藻体的刺的存在上与M1和M2不同；而M1和M2的轴和枝在基部区域是光滑的，没有刺，并且侧枝较细（见图2 A–C）。当将这些形态类型与来自佛罗里达的样本进行比较时，观察到额外的形态学和解剖学差异（见S1文件中的S3表和S4图）。

生殖阶段：2022年5月至2024年6月收集的E. isiformis样品在carposporophyte和tetrasporophyte阶段的生殖特征定量数据见表1。

携带囊果的样本全年都存在，囊果直径范围为0.27至4.33毫米，果皮厚度在34.87至208.17微米之间。囊果主要分布在远端和顶端区域，通常单独出现，偶尔会在一个共同柄上同时发育三个。它们出现在基部、顶端、短侧枝的近端或光滑轴的边缘（见图2）。在生长初期，囊果呈卵形，基部收缩。随着发育的进行，它们变得更椭圆形，一个明显的开口逐渐显现出来。成熟的囊果直径从1.07毫米到不超过2.5毫米不等，由一个中央融合细胞组成，周围环绕着类似烛台的二倍体gonimoblast簇，这些gonimoblast在边缘具有carposporangia。纤维从这些结构延伸到周围的果皮中，与内部髓细胞相连（见图3）。

carposporangia的长度在2.76至50.06微米之间，宽度在2.08至17.18微米之间。然而，成熟的carposporangia长度为24.26至50.06微米，宽度为6.71至17.18微米。卵形至球形的carpospores直径在14.14–21.33微米之间（见图3）。囊果直径在月份（表1）和形态类型（X2=144，p<0.001，图4）之间存在显著差异。囊果直径数据不满足正态性（W=0.98，p<0.001）和方差齐性（F=62.5，p<0.001）的假设。

携带囊果的雌性carposporophytes全年都存在（见图4），从2022年3月到2023年3月（见图4），质地呈软骨状，表现出多种红色，以及黄色和橙色，有时同一样本中同时出现两种颜色。远端和近端轴呈圆柱形，通常逐渐向基部收缩并逐渐变细，基部区域轴光滑。一些样本完全光滑，而其他样本在远端区域有丰富的刺和弯曲的小枝，或者远端区域有少量枝和刺（见图2 A–C）。藻体长度范围为1至51.2厘米，轴宽度范围为0.46至5.37毫米。主轴和枝显示共轴、放射状交替、亚对立或不规则分枝，通常为第三至第五级。顶端尖锐或圆形，有些分叉或截断，常在基部形成增厚的环。藻体是多轴的，髓由平行于主轴的粗纤维组成，具有假薄壁组织（见图3 A–B）。每10厘米藻体的囊果密度范围为5至19个，3月的值最高，9月和11月的值最低（见表1）。2023年3月，开口分化显示61.71%的囊果是开放的或正在形成的，22.95%是着色的且封闭的，8.19%是突出的。只有7.15%的囊果变形或断裂。在24个收集的样本中，有16个处于tetrasporophyte阶段，其中14个样本分别收集于2023年6月和2024年8月。tetrasporophyte藻体质地呈软骨状，颜色从橙色到深红色不等，常显示单一的、更着色的或变色的斑点和类似初始生长的小突起（见图5）。轴与carposporophyte阶段的样本相似。藻体长度范围为1.79至75厘米，轴宽度范围为1.1至12.14毫米。

tetrasporophyte阶段的样本表现出第二至第四级分枝，其轴、顶端和整体藻体形态与carposporophyte阶段的样本相似。然而，所有tetrasporophyte样本在整个藻体和枝的表面都有突起，以及小的白色或更着色的斑点或总体上粗糙的质地（见图5）。tetrasporangia的长度在2024年6月为40.83至117.66微米，宽度在9.85至29.97微米；在2024年8月为35.11至75.61微米至9.76至23微米。tetrasporangia通常呈长椭圆形至长管状，有三个可见的分区形成了带状结构。尽管分区的顺序保持不变，但tetrasporangia的大小不等。总体上，tetrasporangia的末端呈延长形，在椭圆形尖端处厚度减小（见图6）。

在23°C下，使用外源性多胺（PUT和SPM）诱导孢子形成比对照组取得了更好的结果。在25°C下未获得阳性结果，因为囊果开始降解，样本在适应期结束前失去了囊果或死亡。尽管在2024年3月和2025年2月及3月收集的样本中，经过5天和10天适应后记录到的carpospores数量最多，但使用10^-3 M putrescine（PUT）在10天适应后，carpospores的发育显著改善（见图7）。

经过10天的适应和5天的实验处理后，5毫升样本中10^-3 M PUT处理下的总carpospores数量最多（见图7）。使用10^-3 M PUT时，释放的总carpospores数量在实验的第一天到第二天之间最高（见图7）。使用10^-3 M PUT时，释放的总carpospores数量在72%至94%之间；使用10^-6 M PUT时为64%至85%；而对照组释放的总carpospores数量在56%至79%之间（见图8）。处理组之间没有显著差异（X2 = 6.36，p = 0.61，图8）。然而，不同天数之间存在显著差异（X2 = 34，p < 0.001，图9）。释放的Carpospore数量数据不符合正态性（W = 0.56，p < 0.001）和均匀性（F = 11.4，p < 0.001）的假设。下载：PNG（大图）TIFF（原始图像）图8. 2024年3月经过10天适应后获得的Carpospore数量。辐照度水平分别表示为0、20和40 μmol·m?2·s?1。处理包括两种Putrescine浓度10?3和10?? M，以及对照组（C）。误差条代表三次独立重复实验的平均标准误差（SEM）。链接：https://doi.org/10.1371/journal.pone.0346826.g008 下载：PNG（大图）TIFF（原始图像）图9. 2024年3月经过10天适应后每天释放的Carpospore数量（1-5天）。箱形图从下到上分别表示第一个四分位数、中位数、第三个四分位数和最大值，包括异常值。**表示统计学上的显著差异（p < 0.001）。链接：https://doi.org/10.1371/journal.pone.0346826.g009

关于E. isiformis的先前研究[34,37–40]强调了其高度的表型可塑性，这表明需要进一步的研究来明确这一分类单元的分类地位。在本研究中，识别出了三种E. isiformis的形态类型（M1、M2和M3），尽管观察到M1和M2之间存在重叠。在尤卡坦发现的形态类型与加勒比海和墨西哥湾南部的Eucheuma isiforme一致，与先前的描述[34]相符。因此，M1似乎对应于Eucheuma isiforme var. denudatum的先前描述（Eucheuma nudum是一个不确定的记录），M2对应于Eucheuma Bahia Honda form的描述，M3对应于Eucheuma isiforme var. isiformis的描述。然而，分子分析表明，无论形态类型如何，本研究中收集的所有标本都属于E. isiformis（S1文件中的S2表）。E. isiformis不同形态类型之间的遗传一致性表明，它们的物理变化源于表型可塑性[68]，而不是隐秘物种形成[69]。这表明该物种的形态特征是对环境异质性的适应性反应，与其他eucheumatoids的观察结果一致[70]。在尤卡坦半岛的沿海地区发现的E. isiformis由于含有高量的iota-carrageenan、生长速度快[8–11]以及该地区有利的海洋学特征，具有很大的水产养殖潜力。对carrageenan产量的分析显示，三种形态类型的性能相似，数值处于先前报道的范围内[8,9,71,66]。此外，本地carrageenan的高硫酸盐含量与产生iota-carrageenan的Eucheuma物种的报道值一致[67]，表明可以生产出高粘度的carrageenan，能够形成透明且具有弹性的凝胶[72]。经过碱性处理后，三种形态类型的大多数样本中carrageenan产量和硫酸盐基团含量都有所下降。这种减少可能是由于碱性处理的强烈性质和加工过程中施加的热量导致的多糖降解[73]。在本研究中，形态类型1的平均产量和硫酸盐含量的减少幅度（分别为8.3%和3.8%）小于形态类型2和3，这表明形态类型1可能产生具有更优功能特性的carrageenan。对carrageenan产量时间变化的分析显示，形态类型1和3在7月达到最大产量，而形态类型2在5月达到峰值，这与雨季的开始时间一致[8,74]。carrageenan产量的这种季节性增加可能与入射光减少以及来自淡水来源的营养物质输入增加有关[8,9]。季节性的环境条件可以通过影响代谢分配和细胞壁生物合成，强烈影响E. isiformis中carrageenan的生物化学组成。雨季期间光线的减少可能会使碳的分配从生长转向储存和结构多糖，包括carrageenan。同时，来自淡水径流的营养物质增加，特别是氮和磷，可以提高光合作用效率并促进多糖合成。温度波动可能会进一步调节参与硫酸酯化的酶活性，从而影响carrageenan的硫酸化程度。这些因素共同可能导致不同形态类型之间carrageenan产量和硫酸盐含量的季节性变化，高峰产量出现在辐照度较低和营养物质较充足的时期。基于对Carposporophyte阶段E. isiformis标本的形态和解剖特征的分析（表1和图4），能够识别出完全成熟的Cystocarps的诊断特征（图3），并确定诱导孢子形成的最佳月份以及获得成功结果所需的适应期（图7和8）。此外，2024年只有在6月和8月观察到了Tetrasporophyte阶段。值得注意的是，本研究中记录的Tetrasporangia的长度和宽度大于2024年6月之前的观察结果（表1）。对于Carposporangia，本研究中记录的最大长度和宽度与Eucheuma serra的记录相似，后者成熟的Carposporangia长度为25–45 μm，宽度为10–15 μm[75]。相比之下，E. isiforme的Carposporangia较小，长度在15至26 μm之间，宽度在9至14 μm之间。关于E. isiformis的Cystocarp密度，我们记录到每10 cm菌体有5–19个Cystocarps，这一数值与Eucheuma perplexum的报道相似，后者每0.1–2 cm有1–3个Cystocarps[76]。这种模式可能与E. isiformis的季节性生长动态有关，它在寒冷季节末期（10月至1月）开始活跃生长，然后是干旱季节（2月至4月），此时海水温度保持最佳（<30°C）。海水温度在5月开始上升，在7月至9月达到最高值[8,74]，这可能会影响繁殖输出和Cystocarp的发育。根据历史海水温度记录[74]、Cystocarp成熟的观察结果以及2023年6月和2024年4月至8月进行的诱导测试，我们确认样本已经开始孢子形成。我们的结果表明，E. isiformis的Carposporophyte阶段诱导孢子形成的最佳时期是在海水温度开始略微上升并稳定时，即2月底至3月中旬，此时温度不超过24.5°C。值得注意的是，2023年7月至11月期间，在研究区域没有观察到样本，而2024年4月至8月期间，只有2–4个具有完全成熟Cystocarps的Carposporophyte阶段样本。这些与2022年收集结果的偏差可能与最近两年海洋温度升高有关[74]，这可能影响了繁殖时间和种群数量。正如其他红色热带海藻所显示的那样，适度的温度[77–79]、减少的光照压力[80]和增加的营养物质可用性[81]的综合作用可能同步了E. isiformis的繁殖事件，解释了Cystocarp密度、孢子形成时间和Tetrasporophyte出现的季节性模式。先前的研究[38,39,62–65]对于设计诱导E. isiformis孢子形成的实验条件至关重要，特别是关于采集地点的环境因素和关键驱动因素，如温度、光照强度和光周期。对于来自佛罗里达的相关物种，最佳光照要求相对较低，光照饱和度发生在60至180 μmol·m?2·s?1之间。同样，最佳温度范围为21–24°C，相对于这些物种通常经历的季节性温度来说较低。对于E. isiformis的Bahia Honda form（M1），报告的最佳温度为23和24°C[63,82]。先前的研究使用外源性诱导剂[41,42]成功诱导了不同红色海藻物种的孢子形成，但在E. isiformis中并未成功。例如，在Gracilaria cornea中，低温条件下有利于Carpospore释放，最佳结果发生在26°C、40 μmol·m?2·s?1和8:16 h的光周期[65]，通过比较不同的外源性诱导剂浓度和组合（包括putrescine (PUT)、spermine (SPM) 和 spermidine (SPD)），本研究发现10?3 M PUT显著增强了所有处理组的Carpospore释放。我们在E. isiformis中的结果表明，使用10?3 M PUT后，经过大约5天的适应，所有处理的Carpospore释放显著增强，10天是最适合Carpospore发育的理想时间。通过7–8天的适应，诱导效率也可以得到提高，尤其是在海水温度开始上升并稳定的时候，如该热带地区2月底至3月中旬。此外，在不同的光照水平下观察到了形态差异，包括Carpospore发育更快。这是首次成功诱导E. isiformis的孢子形成，为从孢子进行培养提供了方法论基础，并强调了优化条件以建立幼苗的必要性。未来的研究应探索西大西洋种群之间的系统发育关系，并进一步评估Tetrasporophyte阶段。来自加勒比海和墨西哥湾南部的野生形态类型可以作为可扩展培养和驯化的种子库。

结论

本研究确认了E. isiformis的三个描述形态类型的身份，这些形态类型表现出相似的carrageenan产量。对于未来Eucheuma和Eucheumatopsis物种的孢子诱导，我们建议记录成熟Carposporangia和Tetrasporangia的定量数据，监测Cystocarp成熟期间的ostiole特征，并在可能的情况下，跟踪每个繁殖阶段的生理变化，以改善Carpospore的发育。总体而言，这些发现为E. isiformis的选择性育种和驯化方案提供了方法论基础，并为其他eucheumatoid物种提供了可以应用于水产养殖发展的框架。

支持信息

Monserrat López Yllescas（CVU 508791）的博士研究得到了墨西哥国家人文、科学和技术委员会（奖学金2022-000002-01NACF-05280）的支持。我们感谢Román Vásquez Elizondo和Víctor ávila Velázquez在野外工作期间的支持。Crescencia Chávez Quintal（Cinvestav）、Mayra Sánchez-García（MBL）、Ana Isabel González Luna、Javier Robles Flores和Paola Saritzia Ruiz Tamayo（UABC）在实验室和分子分析方面提供了宝贵的技术支持和专业知识。我们还要感谢匿名同行评审者和公共同行评审者Rajasekar Thirunavukkarasu对我们手稿的实质性贡献。