《PLOS Biology》：Structure of the human P2X3 receptor reveals the basis for subtype-selective inhibition by sivopixant
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P2X3受体是治疗慢性疼痛和慢性咳嗽的关键靶点，但现有药物存在亚型选择性差、副作用大等问题。为此，研究人员解析了人类P2X3受体与ATP及新一代选择性负性变构调节剂（NAM）西沃匹坦（sivopixant）的冷冻电镜（cryo-EM）结构，结合电生理和分子动力学模拟，阐明了西沃匹坦的亚型选择性机制及其非竞争性抑制通道开放的原理，为设计高选择性的下一代P2X3受体靶向药物提供了结构框架。
在我们的身体里，除了担任“能量货币”的细胞内角色，三磷酸腺苷（ATP）还是一种重要的细胞外信号分子。当细胞受到刺激或损伤时，会向胞外释放ATP，激活一类名为P2X受体的离子通道，引发一系列生理反应。P2X受体家族共有7个亚型，其中P2X3亚型在慢性疼痛和慢性咳嗽的发生中扮演着关键角色，使其成为极具潜力的药物靶点。
第一代P2X3受体负性变构调节剂（NAM）吉法匹坦（gefapixant）已在部分国家获批用于治疗慢性咳嗽，但它对P2X3同聚体的选择性有限，也能抑制P2X2/P2X3异聚体，导致味觉障碍成为其显著副作用。这推动了新一代高选择性P2X3受体NAM的开发，例如西沃匹坦（sivopixant）和坎利匹坦（camlipixant）。然而，这些药物实现亚型选择性的结构基础尚不明确，其抑制通道激活的分子机制也未被完全理解。为了填补这些空白，并为设计更优药物铺平道路，一项题为“Structure of the human P2X3 receptor reveals the basis for subtype-selective inhibition by sivopixant”（人类P2X3受体结构揭示西沃匹坦亚型选择性抑制的基础）的研究在《PLOS Biology》期刊上发表。
研究人员综合运用了多项关键技术来解答上述问题。核心方法是利用冷冻电镜（cryo-EM）技术，解析了人类P2X3（hP2X3）受体蛋白与ATP及西沃匹坦复合物的高分辨率结构。在功能验证方面，研究团队采用了全细胞膜片钳（whole-cell patch-clamp）电生理记录技术，系统地评估了野生型和一系列定点突变hP2X3受体对ATP和西沃匹坦的响应，以确定关键的药物结合和功能相关残基。此外，还运用了分子动力学（MD）模拟，在原子水平上动态分析了西沃匹坦结合对受体构象的影响。为了探究亚型选择性的普遍原理，研究者还利用AlphaFold3等计算工具预测了P2X2/P2X3异聚体的结构模型，并设计了功能获得性（GOF）突变体，在P2X1和P2X2受体中引入关键残基，测试其对西沃匹坦和坎利匹坦敏感性的改变。
研究结果
结构解析与整体结构
研究获得了两种状态的hP2X3受体冷冻电镜结构：一种是分辨率3.34 ?的西沃匹坦与ATP共结合结构，另一种是分辨率2.95 ?的仅结合ATP的结构。整体结构呈现典型的三聚体“圣杯”状，每个亚基具有海豚形状。在共结合结构中，跨膜（TM）域呈类似apo状态的闭合构象，而在仅ATP结合的结构中，TM域则类似于脱敏态构象，表明西沃匹坦并非稳定脱敏态，而是在ATP存在下稳定了受体的关闭状态。
西沃匹坦结合位点
西沃匹定结合在胞外域三聚体亚基界面的一个变构位点，该位点位于中央口袋的入口（PCP），远离ATP的正构结合位点。西沃匹坦的结合主要依赖于与来自一个亚基的Met75、Ile93、Met96、Met165、Phe282、Leu298以及来自相邻亚基的Tyr285之间的疏水相互作用。此外，其三嗪环上的氮原子与Asp79的主链羰基和Tyr285的侧链形成氢键，羰基氧原子与Lys284的侧链形成氢键。
基于结构的突变分析
基于冷冻电镜结构，研究人员对结合口袋周围的多个残基进行了丙氨酸（Ala）或色氨酸（Trp）/苯丙氨酸（Phe）突变，并通过膜片钳记录检测它们对西沃匹坦抑制敏感性的影响。结果显示，M96W、M165W、Y285W和T82I等突变显著降低了受体对西沃匹坦的敏感性，证实了这些残基在药物结合和功能抑制中的关键作用。
亚型特异性
通过将西沃匹坦结合的hP2X3结构与其他P2X亚型（P2X1, P2X2, P2X4, P2X7）的结构进行比较，并结合序列比对，研究发现Asp79、Thr82、Met96、Met165和Tyr285这五个残基是决定亚型选择性的热点。这些残基在其他P2X亚型中被不同的氨基酸所取代，导致结合口袋的化学和空间性质发生改变。对预测的P2X2/P2X3异聚体模型的分析也显示，在P2X3-P2X2界面，这些关键残基被P2X2亚基中不同的残基所替换，这解释了西沃匹坦对P2X3同聚体的高选择性。
功能获得性突变体
为了验证上述五个残基的重要性，研究者在hP2X1和hP2X2受体中设计了功能获得性（GOF）突变，将这些位点突变为hP2X3中的对应残基。结果显示，改造后的hP2X2-GOF突变体对西沃匹坦变得敏感，而hP2X1-GOF突变体的敏感性也显著增强。此外，hP2X1-GOF突变体对另一种P2X3选择性药物坎利匹坦的敏感性也有部分提高，表明这五个关键残基为P2X3受体NAM的亚型选择性提供了一个广泛适用的结构框架。
结构比较
将西沃匹坦-ATP-hP2X3复合物结构与apo关闭态、ATP结合开放态的P2X3结构进行比较，发现尽管在共结合结构中ATP的结合模式与开放态相同，并引发了“背鳍”上移和“左鳍”下移等部分激活相关的构象变化，但受体下体域（特别是靠近跨膜域的区域）的扩张被抑制，离子通道孔仍保持关闭。分子动力学模拟进一步证实，西沃匹坦的结合诱导了上体域的扩张，这种扩张阻碍了通常作为下体域运动支点的上体域功能，从而“解耦”了上、下体域之间的运动传递，最终抑制了ATP结合引发的通道开放。
研究结论与讨论
本研究首次报道了人类P2X3受体与ATP及新一代选择性NAM西沃匹坦的复合物冷冻电镜结构，为理解P2X3受体的亚型选择性抑制和非竞争性抑制机制提供了关键的结构见解。研究揭示的西沃匹坦结合模式与此前的计算机模拟预测存在显著差异，凸显了实验结构在药物设计中的不可替代性。通过结构比较、突变分析和功能获得性突变体验证，研究鉴定出Asp79、Thr82、Met96、Met165和Tyr285五个关键残基，它们构成了决定P2X3受体选择性NAM结合的特异性热点。这一发现为设计高选择性、且不受人鼠种间差异影响的下一代P2X3受体靶向药物奠定了坚实的理论基础。
更重要的是，该研究阐明了西沃匹坦的非竞争性抑制机制：西沃匹坦结合于胞外域的变构位点，诱导上体域扩张，从而阻碍了ATP结合信号向下体域和跨膜孔道的传递，使通道在ATP存在下仍维持关闭状态。这种“上体域扩张-下体域运动抑制”的变构抑制模型，深化了对P2X受体家族门控机制的理解。
综上所述，这项工作不仅揭示了西沃匹坦亚型选择性和作用机制的分子细节，也为针对慢性咳嗽及其他P2X3相关感觉障碍的下一代靶向药物的理性设计提供了宝贵的结构蓝图。
