在大西洋鲑鱼皮肤和头部肾脏中，基于家族的转录组分析研究了其在生理温度和升高温度条件下受到Lepeophtheirus salmonis感染时的响应

《Comparative Immunology Reports》：Family-based transcriptomic profiling of Atlantic salmon skin and head kidney in response to Lepeophtheirus salmonis infestation under physiological and elevated temperatures

　　Reza Ghanei-Motlagh | Wenlong Cai | Jordan D. Poley | Yuxuan Zhang | Shona K. Whyte | Amber F. Garber | Mark D. Fast
霍普利特研究实验室，病理学与微生物学系，大西洋兽医学院，爱德华王子岛大学，夏洛特敦，PEI，加拿大

**摘要**
本研究探讨了大西洋鲑鱼（Salmo salar）在幼虫期（chalimus）和成虫期感染鲑虱（Lepeophtheirus salmonis）后，其皮肤和头部肾脏的转录组变化，比较了高温（20°C）和常温（10°C）条件下的差异。家族间的转录组比较发现了一些可能与不同家族对海虱反应差异相关的候选基因，这些差异体现在不同虱密度的家族之间的表达模式差异上。这些生物标志物主要参与免疫功能（如cd209、cd22、btn2a1、h2-q9、c1qb、muc2、muc5ac、sntx-b、kbas）、组织修复（如krt13、tgm2、mmp9、mmp13）、炎症（如nlrp1、il1b、nlrc3、nlrp12）、铁稳态（如hbb1、ftm）和应激反应（如hspa8、herc3）。在高温（20°C）条件下，分别在大西洋鲑鱼的皮肤和头部肾脏中识别出124个和324个差异表达基因（DEGs）。RNA-seq分析显示，在高温条件下，几种热应激生物标志物（如serpinh1、hsp90aa1、hspa8、cirbp、fkbp10）在感染幼虫期和成虫期的鲑鱼中均表现出一致的调节变化，且与常温条件下感染的鱼类相比，转录组变化和生物学途径的多样性存在显著差异。我们的研究结果提供了有助于区分不同抗性鲑鱼家族的分子特征，为开发选择性育种策略以改善海虱控制提供了支持。温度相关的转录组变化揭示了鲑鱼适应气候变化的策略，以及它们对长期水温变化的潜在脆弱性。

**引言**
目前，鲑鱼养殖业面临着诸多挑战，其中包括由鲑虱（Lepeophtheirus salmonis）引起的寄生虫感染问题，这严重影响了养殖鲑鱼的健康和生产力[1]。海虱的生命周期包含八个发育阶段：前三个幼虫阶段（nauplius I、II和copepodid）为自由生活的浮游生物，随后是两个固着阶段（chalimus I、II），通过前部触须附着在宿主上；最后三个阶段（pre-adult I、II和成虫）可以在鱼体内自由移动并造成渐进性的组织损伤[2]。目前尚无商业疫苗可以预防海虱感染，而依赖化学治疗剂的传统控制方法由于治疗成本增加以及抗性海虱种群的出现而变得不切实际，尤其是在集约化生产区域[3]。这些限制促使鲑鱼养殖从业者探索替代的控制策略。基于家族的选择性育种计划是最先进的努力之一，重点关注促进生长性能、增强疾病抵抗力、延缓性成熟和改善产品质量等特性[4]。先前的研究表明，海虱抗性是一种中等遗传力的多基因特征，表明不同鲑鱼家族对感染的耐受程度可能存在差异[5]。然而，选择增强抗性可能会与其他理想特性（如生长性能、耐受性或传染性）产生权衡，因为抗性有时可能与生长缓慢或疾病传播动态改变有关；因此，应结合整体生产力和可持续性目标来优化与宿主-寄生虫相互作用相关的特性[6,7]。最近的研究通过转录组和基因组方法确定了几个参与鲑鱼防御海虱机制的候选基因和途径，包括与免疫和炎症反应相关的基因[[8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]]。高通量转录组学技术（如RNA-seq）已成为识别鱼类这些反应分子特征的强大工具[12,14]。除了在选育计划中的应用外，转录组相关生物标志物还为疫苗设计和CRISPR-Cas9等基因编辑技术的应用提供了有希望的目标[6,17]。由于全球气候变化导致的水生生态系统变暖对养殖和野生鱼类种群均构成了重大挑战[18,19]。作为变温动物，辐鳍鱼类对温度波动特别敏感，这会影响其代谢率、免疫功能、生长、血液生化反应和生殖性能等多个方面[20,21]。据报道，高温会通过损害免疫功能、改变宿主-病原体相互作用以及增加病原体毒力和宿主对其他压力因素的敏感性来加剧大西洋鲑鱼的寄生虫感染[21], [22], [23]。由于气候变化导致的全球温度上升，了解鲑鱼对温度升高和海虱感染双重挑战的分子反应仍是一个重要的研究焦点。

通常根据每条鱼身上寄生虫的总数量来分类抗性较强或较弱的鲑鱼家族或个体[8,13]。无论是在家族层面还是个体层面进行比较，对感染的反应存在差异是不可避免的，因为从特定部位收集的皮肤组织可能受感染程度不同[1,10]。因此，这两种方法都有其局限性。然而，在家族层面分析数据可以保留来自不同家族的遗传多样性，这对于发现可能影响宿主对海虱反应的表达模式至关重要。在之前的研究中，我们进行了基于家族的分析，以研究在不同温度条件下感染成虫期和幼虫期海虱的大西洋鲑鱼的转录组反应，强调了与寄生虫发育阶段相关的差异[24]。在本研究中，我们旨在探讨同一家族的大西洋鲑鱼在感染幼虫期和成虫期海虱后的皮肤和头部肾脏的转录组反应，重点关注与家族和温度条件相关的差异。通过采用RNA-seq方法，本研究旨在深入理解反映不同鲑鱼家族对海虱感染反应差异的候选转录组生物标志物，以及与热应激相关的标志物，这些标志物可能在选择性育种、基因编辑和气候适应策略中发挥应用潜力。

**材料与方法**
本研究使用来自加拿大大不伦瑞克省圣安德鲁斯市Huntsman海洋科学中心（Huntsman）的20个家族（每个家族100条鱼）的大西洋鲑鱼苗。这些家族由16条雄鱼和16条雌鱼组成，来自三个年级的繁殖计划，预计它们在海虱抗性方面表现出不同的表现。有些家族遗传关系较近，而有些则无关（补充数据文件1）。所有鱼（平均体重16.5克）均用三氯甲烷磺酸酯（MS-222，150 mg/l）麻醉，每个鱼都装有被动集成应答器（PIT）标签，并在部分循环淡水系统中共同饲养，环境光照条件下水温比环境温度高1-3°C。当鱼苗达到一定体重（> 50克）时，对其进行疫苗接种，随后将其转移到7.5立方米的养殖池中[24]。在此期间，鱼苗喂食商业饲料（Skretting，加拿大）。在鱼苗阶段记录体重，以便将其分配到八个玻璃纤维养殖池（每个池1.3立方米）中，每个池中的生物量保持一致（每个家族6条鱼，共120条鱼）。由于新冠疫情导致难以获取海虱用于实验，鱼被暂养在2-6°C的温度下约6个月，期间持续投喂饲料，之后逐渐适应环境温度。鱼在10±1°C的温度下进行10天的适应期，随后四个养殖池的温度每天逐步升高1°C，直至达到20±1°C[24]。

**实验挑战、虱计数和组织采样**
海虱感染实验、寄生虫计数和组织采样按照先前描述的方法进行[24]。简要来说，鱼苗在10°C或20°C条件下暴露于每条鱼100个copepodid虱1小时。采样在L. salmonis的两个发育阶段进行：虱达到幼虫期II阶段的110度日数时，以及成虫虱出现的360度日数时。在每个时间点，每个温度组的两条鱼分别用过量的MS-222（250 mg/l）麻醉后处死并进行检查。记录每条鱼的体重（BW）和叉长（FL），并计算条件因子（CF）：CF = [100 × BW (g)] / FL3 (cm)。对每条鱼的所有身体表面（包括鳃）进行虱计数，在幼虫期阶段鳃被取出并在解剖显微镜下检查。在这些评估之后，立即从每条鱼身上采集两个组织样本：一个来自背鳍后方的皮肤样本（约10毫米×10毫米，这是寄生虫常见的附着部位），另一个是头部肾脏样本。这样处理鱼可以确保在处死后20分钟内组织得到保存。所有样本均单独保存在RNAlater稳定溶液中，以便后续的分子分析。使用Gjerde等人提供的公式[25]，根据虱计数和体重计算每条鱼幼虫期和成虫期感染鱼的虱密度，并随后确定家族平均水平。所有动物实验均按照UPEI动物护理委员会（协议编号#16-051）和加拿大渔业与海洋局–Huntsman海洋科学中心区域动物护理委员会（AUP #20-31）批准的协议进行。

**RNA制备和测序**
使用Trizol-氯仿法分离总RNA，然后用商业试剂盒（Zymo Research，美国加州）中的DNase I处理[24]。使用NanoDrop分光光度计（ND 2000，Thermo Scientific）对RNA样本进行定量，并通过1.5%琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性[26]。共完成482次提取（每个组织241次），所有样本的RNA纯度（A260/A280 ≥ 1.9和A260/A230 ≥ 1.7）均符合要求。使用TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit（Illumina，美国加州）制备RNA-seq文库，并按先前描述的方法进行测序[24]。原始测序数据已存入NCBI的Sequence Read Archive（SRA）数据库，BioProject访问号为PRJNA1256531。所有20个家族都在10°C或20°C条件下进行了寄生虫计数。从12个家族中收集组织样本，其中包括在10°C条件下饲养的4个家族（F153、F154、F185、F265），在20°C条件下饲养的4个家族（F215、F292、F397、F415），以及在两种温度条件下饲养的4个家族（F175、F229、F361、F419）。其中F175、F361和F419家族被纳入RNA-seq分析，以便在不同温度条件下进行家族内比较。选择其余家族进行RNA-seq分析是基于在10°C条件下感染成虫L. salmonis的鱼中观察到的不同虱密度分布，因为虱密度因寄生虫发育阶段和温度而异。这种方法还旨在更好地反映自然感染条件下的情况。因此，由于F229的虱密度与F175和F419重叠，因此将其排除在外；同时纳入了在10°C条件下F265和在20°C条件下F292的代表样本，以保持温度条件下的平衡代表性（详见补充表1）。每个家族共纳入3-5个样本用于RNA-seq分析。选择用于RNA-seq分析的家族在遗传上是无关的（补充数据文件1）。

**RNA-seq和基因本体（GO）富集分析**
使用FastQC v0.15.3对原始序列（fastq）数据进行质量控制。使用Trimmomatic v0.36过滤掉剩余的接头序列和低质量碱基[27]。使用STAR v2.7.9a将修剪后的读段比对到大西洋鲑鱼基因组组装（Ssal_v3.1，GenBank访问号GCF_905237065.1），同时生成并排序了BAM文件[14]。使用Subread包v1.6.5中的featureCounts生成计数矩阵，以量化映射到各个基因的读段。使用edgeR包对虱密度（每个家族3-5个样本）和温度条件不同的组（家族）进行差异表达分析。由于在RNA-seq分析中包含的5个家族中的2个家族（即F265和F292）的样本仅在10°C或20°C条件下进行采样，因此在每个家族内部（对于两个温度都有代表的3个家族，即F419、F361和F175；每个家族3-5个样本）和所有家族合并（每个温度15-20个样本）进行了基于温度的成对比较，分别在感染成虫期或幼虫期后进行。本研究确定的差异表达基因（DEGs）的选择标准如下：|log2倍数变化| > 1.25，调整后的p值 < 0.05以及|每百万读数的计数对数| > 1.00 [24]。为了识别每对比较中RNA-seq样本的变异性，使用了主成分分析（PCA），并采用了全部表达基因的原始计数数据。使用R语言中的“pheatmap”函数对不同成对比较中共同的DEGs进行了层次聚类。在所有RNA-seq样本中，头部肾脏的平均读取分配率约为65%，皮肤约为62%。检测到的基因数量（≥1次读取）平均每个文库有36,000-38,000个，大约有25,000-27,000个基因的表达水平超过1 CPM（每百万计数）。每个样本（头部肾脏或皮肤）包含约3,000万到5,000万次读取，表明其深度和覆盖率足够进行转录组分析。基因注释使用AnnotationHub和Salmo salar数据库（编号AH114250）进行。完全注释的DEGs使用ClueGO插件（v2.5.10）在Cytoscape v3.10.2中进行了GO和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析[29,30]。ClueGO富集分析采用了以下选项和调整：通路p值截止值 < 0.05，kappa分数：0.4，以及采用Benjamini-Hochberg p值校正的右侧超几何检验[24]。根据相关基因的kappa分数相似性对富集的GO术语进行了分组。在每个功能组中，最具有统计意义的术语被识别为领先术语，并在网络中突出显示。同一组中其他显著富集的术语被视为次要领先术语。从与温度相关的比较中识别出的富集（过度表达）的领先GO术语根据它们的父GO术语以及每个GO组中涉及的次要GO术语被分类为不同的功能主题。用于分组领先GO术语的GO和KEGG数据库与之前描述的数据库一致[24,31]。

为了最大限度地减少与虱子密度无关的表达差异的纳入，应用了以下选择标准：基于（i）在10°C和/或20°C下被Chalimus虱子或成虫阶段侵染的多个成对比较中反复检测到的基因；（ii）主要与免疫反应、炎症或组织修复相关的功能；（iii）在皮肤或头部肾脏中表现出低虱子密度和高虱子密度的成对比较之间一致的表达差异。候选基因通常显示倍数变化大于±3，在每个组织的二十四对比较中至少有三个被检测到（通常在五个或更多），并且在一个或两个组织中表达。功能注释进一步强调了可能被侵染调节的免疫相关转录本。只有那些在低虱子密度和高虱子密度的家族之间显示可重复表达趋势的基因被保留下来，并作为与鱼宿主对虱子反应相关的潜在生物标志物进行讨论。

定量实时PCR（qPCR）分析包括来自12个家族的所有头部肾脏和皮肤组织样本，这些样本都进行了组织收集。这些家族在温度条件（10°C和20°C）下的分布如下：F153、F154、F185、F265在10°C；F215、F292、F397、F415在20°C；F175、F229、F361、F419在两种温度下都有[24]。qPCR分析用于评估以下基因的表达：分化簇83（cd83）、c型凝集素结构域家族4（clec4）、胶原α-1（col1a1）链（col1a1）、基质金属蛋白酶9（mmp9）、中性粒细胞细胞质因子2（ncf2）、血清淀粉样蛋白A5（saa5）、金属蛋白酶抑制剂2（timp2）和硫氧还蛋白b（txnb）作为感兴趣的基因（GOIs），以及真核翻译起始因子3亚基6（eif3）、延长因子1α（ef1a）和RNA聚合酶I（rpl1）作为内参基因[[32]，[33]，[34]，[35]，[36]，[37]，[38]，[39]，[40]]。这些基因的选择基于先前的研究，这些研究表明它们在对虱子侵染（所有GOIs）和/或热应激（mmp9和txnb）的反应中被调节[24,35,36,38]。选定的基因以及用于qPCR的引物序列提供在补充数据文件1中。针对每个目标单独优化了引物浓度，以确保最佳的扩增效率和特异性。

互补DNA（cDNA）的合成使用每个样本1微克的总RNA在20微升反应体积中进行，使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems，美国加利福尼亚州），按照制造商的说明操作。在运行qPCR之前，将库存cDNA样本分别稀释成1:20或1:200的比例，其中1:20稀释的cDNA用于saa5、clec4、cd83和ncf2（仅用于皮肤），其他基因表达测定则使用1:200的稀释比例。基于SYBR的qPCR测定针对测试的GOIs和参考基因。qPCR反应在CFX96 Touch实时PCR系统（BioRad）上进行，反应混合物由5微升Sso Advanced? Universal SYBR? Green Supermix（Bio-Rad）、0.5微升10 mM正向和反向引物、4微升无核酸酶水以及2微升cDNA模板组成，循环条件为：95°C 30秒，95°C 15秒，60°C 15秒，共39个循环，然后进行从65°C到95°C的熔解曲线分析，以0.5°C的速率每0.5秒检测一次荧光。所有基因的标准曲线分别为头部肾脏和皮肤样本生成，使用至少5点系列稀释，线性（R2）大于0.970，扩增效率在90%到105%之间（补充数据文件1）。qPCR反应重复三次，同时包含一个校准池（所有样本的等摩尔池）和两个对照反应（无模板对照和无逆转录酶对照）。没有使用48个样本的池进行逆转录酶对照。偶尔会出现阴性对照反应的扩增；然而，观察到的扩增比相关样本滞后超过7个循环，并且超出了测定的线性范围。循环阈值（CT）值使用geNorm进行分析以计算M值。所有GOIs均归一化到内参基因（eif3、ef1a、rpl1）的几何平均值，并结合扩增效率进行校准，以产生相对定量（RQ）值。RQ值经过对数2转换，并在温度和家族之间进行统计比较。

为了确保qPCR质量控制，分别对头部肾脏和皮肤样本完成了2651次和2541次三重复实验。与头部肾脏相关的98.4%的反应和与皮肤相关的96.5%的反应的技术重复的标准化差（SD）低于0.50。参考基因在头部肾脏（GeNorm M值分别为eif3|rpl1为0.432 [eif3|rpl1]和eif3|ef1a为0.504，ΔCt标准化差分别为0.44、0.53和0.54）和皮肤（GeNorm M值分别为eif3|ef1a为0.311 [eif3|ef1a]和eif3|rpl1为0.426 [eif3|rpl1]，ΔCt标准化差分别为0.38、0.42和0.48）样本中稳定表达。三个参考基因的表达相关性显著（p < 0.0001），Pearson的r值分别为头部肾脏的0.90（eif3|ef1a）、0.87（eif3|rpl1）和0.80（rpl1|ef1a），以及皮肤的0.98（eif3|ef1a）、0.96（eif3|rpl1）和0.94（rpl1|ef1a）。

生长和基因表达数据的正态性使用Shapiro-Wilk检验进行检查。单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey的事后检验（用于基于家族的差异）和独立的学生t检验（或Mann-Whitney U检验，用于基于温度的差异），以确定平均值之间的显著差异。生长和q-PCR数据分析使用GraphPad Prism v10（GraphPad Software Inc，美国）进行。

虱子数量[24]与体重（BW）之间的关系通过家族水平和家族内部的方法进行了评估。虱子数量来自我们之前的研究[24]，作为寄生虫负担的主要衡量标准，因为虱子密度是一个包含体重的衍生指标，在评估与生长特征的关系时可能会引入循环性。在家族水平上，使用家族平均值进行了PCA和Pearson相关性分析。PCA在R中使用prcomp函数对中心化和缩放后的变量进行，并使用biplot可视化结果以说明样本分布和变量贡献。此外，还进行了家族内部相关性分析，以评估每个家族内个体水平的虱子数量与BW之间的关联。分别对每个温度（10°C和20°C）和寄生虫发育阶段（成虫和Chalimus）进行了相关性分析，以考虑特定条件下的变化。使用R中的cor.test函数计算了Pearson相关系数（r）及其相应的p值。

在所有20个家族中，Chalimus侵染家族的虱子平均密度（MLD）在两种温度条件下的变化都大于成虫侵染家族（图1）。根据结果，在10°C或20°C下侵染的家族的MLD值（Chalimus或成虫）分别为：MLD-T10C，F175（0.347）> F292（0.327）> F419（0.250）> F265（0.248）> F361（0.239）；MLD-T20C，F175（0.680）> F292（0.384）> F265（0.380）> F419（0.352）> F361（0.295）；MLD-T10A，F175（0.331）> F419（0.326）> F292（0.281）> F265（0.228）> F361（0.225）；MLD-T20A，F175（0.447）> F292（0.440）> F265（0.419）> F419（0.371）> F361（0.370）。单因素ANOVA显示在10°C下被Chalimus阶段侵染的家族之间的MLD有显著差异（p = 0.0002），Tukey事后检验显示190对比较中有14对存在显著差异（p < 0.05）。在20°C下，单因素ANOVA没有显示出被Chalimus阶段侵染的家族之间的总体显著差异；然而，Tukey检验确定了一对显著差异（p < 0.05）。在10°C下被成虫阶段侵染的家族中，ANOVA显示MLD有显著差异（p = 0.0474），尽管Tukey检验未检测到显著差异（p > 0.05）。在20°C下，ANOVA（p = 0.9309）和Tukey检验（p > 0.05）均未显示出被成虫阶段侵染的家族之间的显著差异。相比之下，家族层面的分析显示相关性主要是正相关的，但总体上较弱，且通常不具有统计学意义，这表明寄生虫负担与生长之间没有一致的家族内关联，同时也有限的证据表明存在权衡（见补充图5）。转录组响应和GO/KEGG通路富集分析了对家族差异相关的DEGs。在不同虱子密度家族之间，针对特定感染阶段和特定温度进行了成对比较（T10A、T10C、T20A和T20C；在10°C或20°C下，对感染了成年或若虫阶段的4个家族进行了6次成对比较；每种组织进行了24次成对比较，详见补充数据文件2-10）。基于每次成对比较鉴定出的DEGs数量在皮肤和头肾组织中差异很大（T10A，头肾为61-490个，皮肤为226-2687个；T10C，头肾为196-433个，皮肤为223-395个；T20A，头肾为141-386个，皮肤为98-1539个；T20C，头肾为2-399个，皮肤为183-450个），并且与T10A、T10C、T20A或T20C相关的多次比较之间没有共享的DEGs（表1，补充数据文件2-9）。如补充图6和补充图7所示，使用与T10A、T10C、T20A或T20C内家族比较相关的基因表达数据生成的PCA图在大多数情况下显示，感染了10°C下成年虱子的鱼类的皮肤样本与感染了若虫阶段的鱼类的头肾样本有明显或中等程度的聚类（PC1或PC2的p < 0.05）。然而，在20°C下感染的鱼类（若虫或成年）的皮肤和头肾样本在大多数比较中并没有明显分离（PC1或PC2的p > 0.05，见补充图6和补充图7）。此外，在某些情况下，属于特定家族的个体样本更为分散，这表明在不同温度下，每个家族的成员对若虫/成年虱子感染的反应存在差异。表1列出了根据每种组织在特定温度下不同虱子密度家族（感染了若虫或成年虱子）之间的成对比较鉴定出的差异表达基因（DEGs）。

通过成对比较，在每种组织的不同虱子密度家族之间进行了比较。

**表1. 根据每种组织在特定温度下不同虱子密度家族（感染了若虫或成年虱子）之间的成对比较鉴定出的差异表达基因（DEGs）**
| 对比组 | 皮肤中的DEGs数量 | 头肾中的DEGs数量 | 共享DEGs数量 |
|------------|-----------|------------|-----------|
| T10A vs. F1 | 61-490 | 226-2687 | 0 |
| T10A vs. F3 | 196-433 | 223-395 | 0 |
| T10A vs. F4 | 141-386 | 98-1539 | 0 |
| T10C vs. F1 | 2-399 | 183-450 | 0 |
| T10C vs. F3 | 191-386 | 121 | 0 |
| T10A vs. F4 | 184 | 134 | 0 |
| T10C vs. F4 | 181 | 143 | 0 |
| T10A vs. F3 | 165 | 98 | 0 |
| T20A vs. F1 | 121 | 114 | 0 |
| T20A vs. F3 | 165 | 185 | 0 |
| T20A vs. F4 | 191 | 121 | 0 |
| T20A vs. F4 | 181 | 134 | 0 |
| T20A vs. F3 | 165 | 195 | 0 |
| T20A vs. F4 | 181 | 126 | 0 |
| T20C vs. F1 | 2-399 | 183 | 0 |

**补充数据文件2-9** 中提供了基于成对比较的DEGs的GO分析结果。在头肾中（补充数据文件4-7），几个富集的GO术语与一般应激反应和免疫相关过程有关（“杀死其他生物的细胞”，T10A和T10C；“ATP依赖的蛋白质折叠伴侣”，T10C；“对转化生长因子β的反应”以及“体液免疫反应”，T20A）。在头肾和皮肤的大多数成对比较中，包含铁蛋白（中间亚基）和/或血红蛋白亚基（hba, hba1, hba2, hba4, hbb或hbb1）的多个GO术语/KEGG通路（例如，“铁死亡”、“细胞解毒”）得到了明显富集。在不同虱子密度家族的皮肤中富集的GO术语/KEGG通路（补充数据文件6-9，表2）与“免疫炎症反应”、“细胞信号传导”、“组织修复/伤口愈合”、“对刺激的反应、损伤反应和细胞过程”、“代谢过程/通路”、“抗氧化活性和氧化还原反应”以及“运输和结合”相关。

**表2. 在不同虱子密度感染的家庭中皮肤中富集的选定GO术语/KEGG通路**
| GO/KEGG ID | 相应的成对比较 |
|-----------------|------------------------|
| IMMUNE-INFLAMMATORY RESPONSE | KEGG:04145; GO:0006935; GO:0032587 |
| | “吞噬体”、“趋化性”和“膜皱褶” | T10A (F361 vs. F175), T10A (F265 vs. F361), T10A (F361 vs. F419) 和/或 T20A (F361 vs. F292) |
| | “趋化因子活性” | T10A (F361 vs. F175), T10A (F265 vs. F361), T10A (F361 vs. F419), T10A (F265 vs. F419), T20A (F292 vs. F175), T20A (F361 vs. F292) |
| | “细胞因子产生” | T10A (F361 vs. F419), T20A (F361 vs. F292) |
| | “调理素结合”和“补体成分C1q复合体” | T10A (F361 vs. F175) |
| | “炎症反应” | T10A (F175 vs. F419), T10A (F361 vs. F419) |
| | “肠道免疫网络用于IgA产生” | T10A (F265 vs. F419) |
| | T细胞激活和B细胞激活 | T10A (F361 vs. F419) 和/或 T20A (F361 vs. F419) |
| | “对细菌的防御反应”、“清除剂受体活性”和“体液免疫反应” | T10A (F265 vs. F361), T10A (F361 vs. F419), T10C (F361 vs. F419) 和/或 T20A (F361 vs. F175) |
| | “对病毒的防御反应” | T20A (F292 vs. F175) |
| | 过氧化物阴离子生成 | T20A (F292 vs. F175), T20A (F361 vs. F292) |
| | 细胞信号传导 | KEGG:04115; KEGG:04068; GO:0097720; GO:0007178; GO:0007165; | T10A (F361 vs. F419), T10A (F265 vs. F361) 和/或 T20A (F361 vs. F419) |
| | ErbB信号通路 | T10A (F361 vs. F419), T10A (F265 vs. F419) |
| | Toll样受体信号通路 | T10A (F265 vs. F419) |
| | MAPK级联的负调控 | T10A (F361 vs. F419) |
| | MAPK信号通路 | KEGG:04010; KEGG:04150; KEGG:04625; GO:0007219; GO:0007259 | T10A (F361 vs. F419) |
| | NOD样受体信号通路 | T20A (F292 vs. F175) |
| | 酶调节剂活性 | T10A (F361 vs. F175), T10A (F265 vs. F361) |
| | 磷脂酰肌醇3-激酶复合体 | T10A (F361 vs. F419), T10A (F265 vs. F361), T10A (F361 vs. F419), T10C (F265 vs. F419), T20A (F361 vs. F419) |
| | 结合表皮发育和角质形成细胞分化 | T10A (F361 vs. F419), T10A (F265 vs. F419), T10C (F361 vs. F419), T20A (F361 vs. F419) |
| | 柔韧性组分和血管发育 | T10A (F361 vs. F419), T10A (F265 vs. F361), T20A (F361 vs. F419) |
| | 组織修复/伤口愈合 | GO:0003810; GO:000854 |
| | 蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酸转移酶活性 | T10A (F361 vs. F419), T10A (F265 vs. F419), T10C (F361 vs. F419), T20A (F361 vs. F419), T20A (F361 vs. F419) |
| | 结合整合素和肝素 | T10A (F361 vs. F419), T10A (F265 vs. F361), T0A (F361 vs. F419), T20A (F361 vs. F419) |
| | 微管蛋白II复合体和收缩肌纤维 | T10C (F265 vs. F175), T10C (F361 vs. F419), T20C (F361 vs. F419) |
| | 伤口愈合调节 | T10C (F265 vs. F419), T20A (F361 vs. F419) |
| | 肌钙蛋白复合体 | T10C (F265 vs. F175), T0A (F361 vs. F419), T20C (F361 vs. F419) |
| | 对刺激的反应、损伤反应和细胞过程 | GO:0140662; GO:0009266; GO:0005832 |
| | ATP依赖的蛋白质折叠伴侣和含伴侣蛋白的T复合体 | T10A (F361 vs. F419), T10A (F361 vs. F419), T0A (F361 vs. F419), T0C (F361 vs. F419), T20A (F361 vs. F292) |
| | DNA损伤反应、DNA修复和细胞周期检查点信号 | T10A (F361 vs. F419), T0A (F361 vs. F419) |
| | 细胞凋亡 | T10A (F361 vs. F419) |
| | 细胞衰老 | T10A (F361 vs. F419) |
| | 甘油脂代谢和氨基酸代谢过程 | T10A (F361 vs. F419), T0A (F361 vs. F419), T20A (F361 vs. F419) |
| | 羟基酸代谢过程 | T10A (F361 vs. F419), T0A (F361 vs. F419), T20A (F361 vs. F419) |
| | 活性氧代谢过程 | T10A (F361 vs. F419), T0A (F265 vs. F361) |
| | 糖酵解/糖异生过程 | T10C (F361 vs. F419), T0A (F361 vs. F419), T20C (F361 vs. F419) |
| | 抗氧化活性和氧化还原反应 | T10A (F361 vs. F419) |
| | 铜离子结合 | T10A (F361 vs. F419) |
| | 铰核苷酸结合 | T10A (F361 vs. F419), T0A (F361 vs. F419) |
| | 核苷酸结合 | T10A (F361 vs. F419), T0A (F361 vs. F419) |
| | 离子结合 | T10A (F361 vs. F419), T0A (F265 vs. F361) |
| | 更频繁和/或显著的DEGs主要属于DNA损伤/凋亡、细胞粘附、信号传导/炎症、铁/血小板稳态、应激/热休克反应、组织修复/细胞骨架组织和先天/适应性免疫反应（见表3）。 | 表3中列出了在不同组织和温度下基于家族比较显示最明显转录变化的代表性基因，包括头肾中的hba4, hbb1, psap, prgr1, adgre2, dmbt1, tnfrsf19和iglc1；皮肤中的rab6b, btn2a1, cd209d, aloxe3, trpc3, gimap8, krt13, rock2, zg16和cxcl2；以及两种组织中的nlrc3, nlrp1, nlrp3, nlrp5, nlrp12, icn, c1qb, trim47, anxa5和kbas。根据具有不同虱密度的家族之间的成对比较（每种组织24个）识别出的更丰富和/或显著的生物标志物列表。类别、基因符号、头部肾脏、皮肤、DNA损伤/凋亡：ppp2r2a、banf1、trim39、casp8、ddx17、herc3、pla2r1、plekhn1、usp7、banf1、trim39；细胞粘附—ceacam20、ephb6、lama3、lamb3、lgals4、spon2b；信号转导/炎症：ptgr1、serpinb1、nlrc3、nlrp1、nlrp12、nlrp3、card14、cmklr1、ltb4r、nlrc5、peli1、pla2g2a、pla2g4c、pled4、ptgs2、ptgs2b、rock2、serpinb1、nlrc3、nlrp1、nlrp12、nlrp3；铁/血小板稳态：snaclec1、hba1、hba4、hbb、hbb1、tfa、ftmtf2、hebp1、hebp2、snaclec1、hba1、hba4、hbb、hbb1、tfa和ftm；应激/热休克反应：dnajb5、hsp90aa1、hspa8、hspa14、hspd1、dnajb5、hsp90aa1、hspa8；组织修复/细胞骨架组织：ccn2、adamts12、aloxe3、ccn2、hbegf、igfbp5、krt13、krt18、krt18a、krt19、krt20、krt8.2.l、krt9、col1a1、col1a2、col6a1、col6a2、col6a6、col14a1、col18a1、col21a1、col28a1、col10a1、col11a2、mmp9、mmp13、tgfb3、tgm1、tgm2、tgm3、timp2、timp3、tnik；先天/适应性免疫反应：adgre2、cd152、cd163、cd209、cd244、cd79a、dmbt1、fcgr3、gimap6、igkv1-39、igkv4-1、iglc1、iglc2、k29-213、nkl、pglyrp2、pigr、prf1.3、timd4、anxa5、c1qb、cd209c、cd209d、cd209e、cd22、cd55、clec4m [cd209l]、clec4e [mincle]、ctsc、fos、h2-q9、kbas、litaf、mr1、palm3、psap、psmb9a、rap1b、samd9、sntx-b、tap2b、siglec5、trim16、trim25、trim47；adgrf3、aerolysin-like protein [无符号]、arg1、btn1a1、btn2a1、btn3a2、c3、camp、ccl20、ccl21、ccl25a、ccl4、cd2、cd200、cd300ld、cd9、clec10a [mgl]、cxcl11、cxcl2、cxcr1、cxcr4、dnase1l3、dusp1、dusp4、dusp5、epx、erbb3、fcgbp、gimap8、ifi44、ighd、igkc、il12rb1、il1b、il21r、表皮黏蛋白C.1-like [无符号]、肠道黏蛋白-like protein [无符号]、irf7、isg15、itln1、jun、lcn、lect2、mal、mopc-321、mrc1、mrc2、muc2、muc5ac、myb、nfatc2、nos2b、pbx1、pigr、prdm1、rab6b、rnd1、saa5、samhd1、sema3b、sema3d、sema3f、sema7a、socs2、socs3、stat1、tnfrsf14、tnfrsf19、traf2、anxa5、c1qb、cd209c、cd209d、cd209e、cd22、cd55、clec4m [cd209l]、clec4e [mincle]、ctsc、fos、h2-q9、kbas、litaf、mr1、palm3、psap、psmb9a、rap1b、samd9、sntx-b、tap2b、siglec5、trim16、trim25、trim47。与温度升高相关的DEGs和GO术语/KEGG通路：在感染成虫或chalimus阶段后，进行了基于温度的成对比较（20°C vs. 10°C），既在各个家族内部（补充图8，补充表3；补充数据文件11-16），也在所有家族之间（表4；补充数据文件17-18）。使用与特定家族内比较相关的表达数据生成的PCA图（补充图9）显示，在大多数情况下，根据温度（T20A vs. T10A或T20C vs. T10C），皮肤和头部肾脏中的样本有明显的分离（PC1或PC2的p < 0.05）。如图2所示，与所有家族之间比较的表达数据相关的PCA在头部肾脏中显示出明显的分离（T20A vs. T10A的p < 0.05，对于PC1和PC2），或在皮肤中显示出中等程度的分离（T20C vs. T10C；T20A vs. T10A和T20C vs. T10C的p < 0.05，对于PC1或PC2）。表4. 基于所有鲑鱼家族在两种不同温度条件下感染chalimus或成虫阶段的虱子的成对比较得到的差异表达基因（DEGs）。成对比较：皮肤中的DEGs数量、头部肾脏中的DEGs数量、两种组织中共享的DEGs数量。T20A vs. T10A：所有家族556、423；头部肾脏797、775；T20C vs. T10C：所有家族165、208、373；T20A vs. T10A | T20C vs. T10C：共享的DEGs 124、324。下载：下载高分辨率图像（823KB）下载：下载全尺寸图像图2. 主成分分析（PCA）图，展示基于所有表达基因的原始计数数据的RNA-seq样本分布，以及Venn图，表示在升高（20°C）与正常（10°C）温度条件下感染成年或chalimus阶段海虱的大西洋鲑鱼的头部肾脏和皮肤的转录组反应。（A-B）PCA图比较了在20°C与10°C下感染成年（A）或chalimus（B）阶段海虱的所有家族的头部肾脏样本。（C-D）PCA图比较了在20°C与10°C下感染成年（C）或chalimus（D）阶段海虱的所有家族的皮肤样本。（E-F）Venn图展示了在感染成年或chalimus阶段海虱的家族中鉴定出的对温度有反应的差异表达基因（DEGs）在头部肾脏（E）和皮肤（F）中的分布。（G-H）Venn图展示了在感染成年（G）或chalimus（H）阶段海虱的家族中在头部肾脏和皮肤中鉴定出的对温度有反应的DEGs的分布。（I）Venn图展示了基于感染成年和chalimus阶段海虱的家族之间共享的DEGs的交互作用，在头部肾脏和皮肤中鉴定出的对温度有反应的DEGs的分布。基于所有家族组合（补充数据文件17-18）得到的DEGs和GO/KEGG通路更为全面且重叠，主要与家族内比较的结果一致（补充数据文件10，补充数据文件11-16），因此在本研究中进行了展示和讨论。如表4所总结的，在两种不同温度下感染成年（T20A vs. T10A）和chalimus（T20C vs. T10C）阶段的家族之间的成对比较分别识别出了979个（皮肤中556个上调和423个下调）和373个（头部肾脏中165个上调和208个下调）DEGs。这两种比较的交互作用（T20A vs. T10A | T20C vs. T10C）在皮肤和头部肾脏中分别揭示了124个和324个共享的DEGs（图2）。基于在皮肤（n=124）和头部肾脏（n=324）中鉴定的共享DEGs构建的热图显示了样本基于温度的聚类（图3）。下载：下载高分辨率图像（972KB）下载：下载全尺寸图像图3. 基于感染成年或chalimus阶段海虱的家族之间共享的对温度有反应的差异表达基因（DEGs）的层次聚类（T20A vs. T10A | T20C vs. T10C）。（A）左侧热图展示了头部肾脏组织中对温度有反应的DEGs（n=324）的层次聚类。（B）右侧热图展示了皮肤组织中对温度有反应的DEGs（n=124）的层次聚类。总体而言，在20°C与10°C条件下感染成年海虱的鱼类中，头部肾脏和皮肤中的主要/次要GO术语比感染chalimus阶段海虱的鱼类更多（T20A vs. T10A > T20C vs. T10C）。同样，基于温度差异鉴定的DEGs的丰度（A）、表达范围（ER）和强度（I；log2FC ≥ ±3的转录本）在感染成年海虱的鱼类的头部肾脏和皮肤中通常更高（A：1267和979；ER：-4.69至6.53和-4.29至7.06；I：73和56），而在感染chalimus的鱼类中则较低（A：488和373；ER：-3.97至4.35和-4.29；I：9和11），这表明感染成年海虱的鱼类在转录多样性上更高。基于基于温度的成对比较在头部肾脏和皮肤中鉴定的DEGs及其交互作用（T20A vs. T10A，T20C vs. T10C，或T20A vs. T10A | T20C vs. T10C）获得的主要GO术语和KEGG通路被分为4个功能主题：1）代谢和酶功能，2）细胞组织和组织发育，3）信号转导和免疫反应，4）分子运输和定位（图4，图5）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图4. 基于不同温度条件富集的GO术语和KEGG通路的功能分组网络可视化。（A-B）基于在20°C与正常（10°C）温度条件下感染成年（A）或chalimus（B）阶段海虱的所有家族的头部肾脏中鉴定的DEGs富集的GO术语和KEGG通路。（C）基于在20°C与10°C条件下感染成年或chalimus阶段海虱的家族的头部肾脏之间共享的DEGs富集的GO术语和KEGG通路。主要GO术语和KEGG通路被分为4个功能主题，包括代谢和酶功能（1）、细胞组织和组织发育（2）、信号转导和免疫反应（3）、分子运输和定位（4）。GO领域和KEGG通路如下表示：GO生物过程（椭圆）、GO细胞组分（六边形）、GO分子功能（平行四边形）、KEGG通路（矩形）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图5. 基于不同温度条件富集的GO术语和KEGG通路的功能分组网络可视化。（A-B）基于在20°C与正常（10°C）温度条件下感染成年（A）或chalimus（B）阶段海虱的所有家族的皮肤中鉴定的DEGs富集的GO术语和KEGG通路。（C）基于在20°C与10°C条件下感染成年或chalimus阶段海虱的家族之间共享的DEGs富集的GO术语和KEGG通路。主要GO术语和KEGG通路被分为4个功能主题，包括代谢和酶功能（1）、细胞组织和组织发育（2）、信号转导和免疫反应（3）、分子运输和定位（4）。GO领域和KEGG通路如下表示：GO生物过程（椭圆）、GO细胞组分（六边形）、GO分子功能（平行四边形）、KEGG通路（矩形）。在“代谢和酶功能”主题中，富集的术语主要反映了增强的代谢过程，包括与有机化合物代谢、能量产生和脂质调节相关的通路（例如，在头部肾脏中的“糖酵解过程”；在皮肤中的“羧酸代谢过程”；在两种组织中的“PPAR信号通路”）。此外，与异生物质代谢和氧化应激反应相关的通路的富集表明在温度升高和虱子感染下激活了解毒机制。这些反应伴随着与酶相关的功能的富集（例如，在头部肾脏中的“氧化还原酶活性”；在皮肤中的“内切酶活性”），这表明在热应激和寄生虫应激下催化活性发生了变化。“细胞组织和组织发育”主题主要由与组织重塑和结构重组相关的过程主导，包括细胞外基质结构、细胞-基质相互作用和蛋白水解调节（例如，在头部肾脏和皮肤中的“细胞外基质组织”和“半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性”）。此外，与程序性细胞死亡相关的通路的富集（例如，在头部肾脏中的“凋亡”和“坏死凋亡”；在皮肤中的“铁死亡”；在两种组织中的“吞噬作用”），以及与细胞增殖相关的过程，表明在应激诱导条件下组织更新和修复。“信号转导和免疫反应”和“分子运输和定位”主题涵盖了更广泛和更复杂的基因网络。“信号转导和免疫反应”和“分子运输和定位”主题中的富集通路表明激活了多种免疫和应激相关的信号级联，包括与细胞因子信号、肿瘤坏死因子（TNF）信号、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号、热休克反应和RNA处理相关的通路。在头部肾脏中，jun/ap1与几个关键信号家族的基因差异表达，包括TNF超家族（traf2b [上调]、traf2 [下调]、cd40 [上调]、fas [下调]、faslg [上调]）、热休克蛋白（HSPs）（hsp90aa1 [上调]、hspa8 [上调]）、蛋白激酶（PKs）（prkcb [上调]、jak1 [上调]）、MAPKs（mapk11 [下调]、mapk12a [下调]、map3k11 [上调]、mapkapk2 [上调]、mapk8ip2 [上调]）、Toll样受体（TLRs）（tlr2 [上调]、tlr7 [上调]、tlr8 [上调–下调]、tlr12 [上调]）、生长因子配体/受体（met [上调]、kdr [上调]、fgf10a [上调]）以及大鼠肉瘤病毒（RAS）超家族的成员（rac3 [上调]、rasgrp3 [上调]、rasgrp3 [上调]）。这些基因与过表达的通路相关，如“MAPK信号通路”、“Toll样受体信号通路”、“NOD样受体信号通路”和“GnRH信号通路”。在皮肤中，“MAPK信号通路”的富集同样得到了包括jun/ap1、dusp1（上调）、dusp4（上调）、vegfa（上调）、kdr（上调）、flt1（上调）、ddit3（上调）、gadd45a（上调）、flt3（下调）、map4k2（下调）和map3k11（下调）的DEGs的支持。这些模式表明在温度升高和成年阶段感染的情况下，涉及细胞应激信号和免疫炎症通路的协调反应。同时，“分子运输和定位”主题中的术语富集反映了底物交换、离子平衡和气体运输的需求增加，涉及与氧气运输、铁代谢、脂质代谢和多种跨膜运输活动相关的通路。与这些模式一致，几个与分子运输和细胞稳态相关的基因在温度升高时表现出差异表达，特别是与溶质载体（SLC）转运蛋白家族成员相关的基因，在头部肾脏和/或皮肤中差异表达。这些包括与氨基酸、离子、代谢物和神经递质相关的转运蛋白（上调：slc6a6、slc38a4、slc6a20、slc6a20、slc5a7；下调：slc6a13、slc16a6、slc6a14、slc29a1、slc39a4、slc25a37、slc5a7、slc4a1、slc16a3b），表明在头部肾脏和/或皮肤中调节了底物运输和代谢调节。这些响应共同强调了在环境压力和病原体压力下维持生理稳态以及支持代谢和免疫功能的重要性。当研究头部肾脏和皮肤中差异表达基因（DEGs）之间的相互作用时，分别发现有169个和49个在感染了成年（T20A对比T10A）或chalimus（T20C对比T10C）阶段虱子的鲑鱼头部肾脏和皮肤中共享的DEGs（图2）。如图2所示，感染导致的组间相互作用Identification出了36个对温度有响应的DEGs（其中34个已进行特征描述，详见表5），这些基因在两种组织中都存在（T20A对比T10A | T20C对比T10C）。在感染了chalimus或成年虱子的鲑鱼头部肾脏和皮肤中富集的主要GO术语包括“β-丙氨酸代谢”、“血红蛋白复合体”和“对热的响应”（图6）。感染chalimus或成年虱子后，两种组织中共享的DEGs中富集的温度相关GO术语和KEGG通路详细信息见补充表4、补充表5和补充数据文件19-21。多个基因在两种组织中的表达水平一致较高，包括那些与应激反应和蛋白质折叠相关的基因（例如hsp90aa1、serpinh1、hspa8、dnaja、serf2），以及与脂质代谢（apoc1、LOC106577511）和免疫信号传导（cxcl10、mbl、cleca）相关的基因。相比之下，与氧气运输（hba、hbb）、膜运输（slc16a6）和细胞结构（cfap44、tmem269）相关的基因在两种组织中的表达水平较低。

表5. 在感染了chalimus或成年虱子的鲑鱼头部肾脏和皮肤组织中鉴定出的对温度有响应的差异表达基因（DEGs）（T20A对比T10A | T20C对比T10C）。

基因ID 基因符号 基因描述 功能 变化倍数（log2）
HK (T20A vs. T10A) HK (T20C vs. T10C) SK (T20A vs. T10A) SK (T20C vs. T10C)
LOC106581 serpinh1 Serpin H1 胶原蛋白生物合成和成熟 4.77
LOC10661 serpinh1 Serpin H1 3.84
hs90a hsp90aa1 热休克蛋白HSP 90-alpha 3.90
LOC10660 hsp90aa1 热休克蛋白HSP 90-alpha 3.21
hsc70 hspa8 热休克相关蛋白70 2.61
dnaja dnaja DnaJ热休克蛋白家族（Hsp40）成员A 2.38
ficd FICD蛋白腺苷酰转移酶 1.34
LOC10019 4731 — 初级胺氧化酶，肝脏同工酶 4.82
apoc1 Apolipoprotein C 4.18
apoc1 Apolipoprotein C-I 2.76
gadl1 Glutamate decarboxylase like 1 2.13
LOC10659 4092 Gadl1酸性氨基酸脱羧酶 2.09
PLC1 Phospholipase A and acyltransferase 4 1.72
plaat4 Phospholipase A和酰基转移酶4 1.72
prmt2 Prmt2蛋白精氨酸甲基转移酶 1.42
cxcl10 C-X-C基序趋化因子10 2.78
cleca C型凝集素受体A 2.37
mbl Mannose-binding蛋白 1.51
tspan7 Tetraspanin-7 2.74
cfap44 Cilia-和flagella相关蛋白44 1.28
tmem269 Transmembrane蛋白269 1.53
SLC16a6 Monocarboxylate转运蛋白7 1.62
SLC5a7 High-affinity choline转运蛋白1 2.56
cyp4f3 Cytochrome P450 4 1.98
hmgb3 High mobility group蛋白B3 4.35
tfatfa Transferrin-a 1.60
hba1 Hemoglobin subunit alpha 2.62
hba1 Hemoglobin subunit alpha 2.91
hba1 Hemoglobin subunit alpha 2.91
hbb Hemoglobin subunit beta 2.71
hbb1 Hemoglobin subunit beta 2.90
```

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图6. 基于不同温度条件富集的GO术语和KEGG通路的功能分类网络可视化。（A）基于在20°C和10°C下感染成年虱子的家族的头部肾脏和皮肤中共享的DEGs富集的GO术语和KEGG通路。（B）基于在20°C和10°C下感染chalimus阶段的虱子的家族的头部肾脏和皮肤中共享的DEGs富集的GO术语和KEGG通路。（C）基于在感染成年或chalimus阶段的虱子的家族的头部肾脏和皮肤中鉴定出的对温度有响应的DEGs富集的GO术语和KEGG通路。主要的GO术语和KEGG通路被分为4个功能主题，包括代谢和酶功能（1）、细胞组织和组织发育（2）、信号传导和免疫响应（3）以及分子运输和定位（4）。GO领域和KEGG通路表示如下：GO生物过程（椭圆）、GO细胞组分（六边形）、GO分子功能（平行四边形）、KEGG通路（矩形）。

qPCR数据分析
在不同感染阶段和温度条件（T10A、T10C、T20A和T20C）下，对两个组织中的差异基因表达进行了qPCR分析（补充图10-17）。家族间的差异表达有限，仅在头部肾脏组织中观察到，其中clec4（T10A、T10C、T20A）、txnb（T10A）和ncf2（T10C）显示显著差异。在皮肤组织中没有检测到显著的表达差异。RNA-seq分析部分支持了这些发现，识别出clec4家族成员的差异表达，尽管在F419和其他家族之间没有观察到差异。这两种方法一致显示cd83、col1a1、mmp9、saa5和timp2在头部肾脏组织中的表达水平较低。相比之下，RNA-seq显示clec4、mmp9、saa5和timp2在皮肤组织中的表达水平变化较大，而qPCR未检测到这种差异。这些差异可能反映了样本大小、归一化方法（TMM对比ΔΔCt）、采样个体的变异（尤其是皮肤组织）以及qPCR测定中针对不同基因旁系同源物的差异。

温度对基因表达的影响
温度对基因表达的影响不受家族影响；因此，所有鱼类按温度进行了合并分析（补充图18）。在20°C和10°C下，分别进行了chalimus（T20C对比T10C）、成年（T20A对比T10A）和共同感染条件（chalimus+成年；T20对比T10）下的qPCR比较（图7）。qPCR和RNA-seq数据集之间观察到显著的正相关（p < 0.01）（补充图19）。qPCR识别出cd83、clec4、col1a1、mmp9、saa5和txnb在两种组织中的差异表达。cd83在两种方法下都在较高温度下一致上调。clec4表现出组织特异性模式，在头部肾脏上调而在皮肤中下调，这一结果得到了RNA-seq的支持，该数据表明clec4m在头部肾脏下调而clec4e主要在头部肾脏上调，而clec4e和clec4f在皮肤中上调。col1a1在头部肾脏表现出阶段依赖性响应，在较高温度下在皮肤中一致下调。RNA-seq分析，基于家族内或家族间比较，支持col1a1（LOC106610502）在两种组织中的整体下调。

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图7. 在20°C和10°C温度条件下感染虱子的鲑鱼家族的头部肾脏和皮肤中cd83、clec4、col1a1、mmp9、saa5和txnb的qPCR结果。数据以箱形图展示，中间值为中位数，Tukey须显示。两种温度条件下家族间基因表达响应的显著差异（p < 0.05）用星号标出。对于每个基因，分析了感染成年虱子（左图）、chalimus虱子（中图）和所有感染阶段的鲑鱼（右图）对温度的表达响应。在20°C下，mmp9在两种组织中的表达均降低，RNA-seq和qPCR结果一致（图7）。相比之下，saa5表现出组织特异性响应，qPCR显示在头部肾脏中上调但在皮肤中下调（p < 0.05），而RNA-seq显示在成年感染期间在两种组织中上调，在chalimus感染期间在皮肤中下调。基于qPCR，txnb在成年感染鲑鱼的两种组织中均下调，RNA-seq在头部肾脏中得到了支持，但在皮肤中没有。在任一数据集中都没有检测到ncf2和timp2的显著表达变化（补充图20）。这些差异可能归因于样本大小、归一化方法（TMM对比ΔΔCt）的差异、采样个体的变异（特别是皮肤组织）以及qPCR测定中针对不同基因旁系同源物的差异。

讨论
基于家族的转录组响应对海虱感染
RNA-seq分析中包含的鲑鱼家族表现出不同的MLDs，这些家族没有预先分类为抗性或易感性；因此，本研究中鉴定出的差异表达基因应被视为与虱子密度变化相关的候选标记物，而不是抗性或易感性的确定性生物标志物。未来的研究需要将转录组学与已知表型或遗传关联分析相结合，以确认它们在海虱感染中的抗性/易感性中的作用。在某些家族中观察到了虱子密度的显著变异（例如，F175在20°C下）。尽管我们的转录组比较是在多个家族之间进行的，但这种变性可能会引入额外的噪声，影响抗性相关基因的鉴定。为了减轻这种影响，根据不同比较的可重复性、功能相关性和具有对比虱子密度的家族之间的一致表达差异，对候选基因进行了优先排序。尽管感染家族之间的虱子密度存在差异，但在皮肤和头部肾脏中鉴定的转录变化和基因表达谱也具有高度变异性。在与家族比较相关的选定的DEGs中（表3），kbas、nlrp1、nlrc3、nlrp12、mmp13、muc2、sntx-b和trim16在皮肤和/或头部肾脏中表现出几乎相同或相反的表达模式。虽然在大多数情况下，感染家族之间的虱子密度没有显著差异，但虱子密度较低的家族（F361和F265）表现出最明显的转录差异。F361和F265中的几个基因的表达谱与其他家族不同。值得注意的是，F361在10°C和20°C下的调节最强烈，这与观察到的虱子密度模式一致。这些响应包括多个与免疫相关的基因的调节，这些基因可能有助于降低对海虱感染的易感性（见下文讨论）。还需要考虑到，虱子负担的统计显著性缺失并不一定排除家族间生物学意义上的差异[24]。在海虱感染中，寄生虫在宿主体内的分布是空间异质的；因此，采样的组织可能不会总是与寄生虫附着部位一致，从而引入了变异性，可能降低了家族间统计比较的敏感性。

在免疫相关基因中，cd209、cd209c、cd209e、clec4m [cd209l]和clec4e [mincle]在F361中的表达水平高于其他家族，无论是在头部肾脏还是皮肤中。另一方面，cd209d在F361中的表达水平低于F175和F419。此外，btn2a1在F361中的表达水平也低于其他家族，而btn2a1是cd209的配体[41]。在F361的皮肤中还检测到cd209（也称为dc-sign）的表达增加，该蛋白主要在树突状细胞表面表达，对于启动针对病原体（如海虱）的免疫反应至关重要[8,12]。同样，诱导的mcle表达与对海虱的抗性相关[12]、粉红鲑[40]和大西洋鲑[9]。此外，flec10a（在皮肤中）和ctsc（在头部肾脏和皮肤中）在F361中的表达水平也高于其他家族。ctsc基因（cathepsin C）是一种溶酶体氨基肽酶，对于激活免疫细胞中的多种丝氨酸蛋白酶至关重要，从而增强它们对抗病原体的能力[42]。mrc1在F361的皮肤和/或头部肾脏中的表达增加，与抵抗海虱感染有关[9,12]。mrc1主要在树突状细胞上表达，负责识别N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）残基并促进il10的产生，从而调节免疫反应[43]。lamp3（dc-lamp或cd208）在F361的皮肤和/或头部肾脏中的表达也增加，与抵抗海虱有关[44]。mrc1负责识别寄生虫上的碳水化合物/几丁质结构[44]，其抵抗海虱感染的关联已在银鲑[9,12]中得到证实。cd209（也称为dc-sign）主要在树突状细胞表面表达，对于识别并结合病原体的特定糖结构至关重要[8,12]。siglec6和colec12在F361的皮肤中的表达水平也较高，尽管这些变化在少数比较中鉴定到（T10A、F361对比F175、F419和F265）。siglec6主要由肥大细胞表达，限制了过度的炎症反应[46]。

psmb9a在F361的皮肤和头部肾脏中的表达量高于其他家族。该基因编码免疫蛋白酶体的一个亚基，对于处理呈递给CD8+ T细胞的MHC I类分子上的抗原至关重要[47]。在10°C和/或20°C的温度下，与感染了成年/Calimus期虱子的其他家族相比，F361和F265的皮肤和头部肾脏中nlrp1的转录水平有所增强。nlrp1是一种关键的炎性体传感器，可被病原体相关分子模式（PAMPs）激活，并有助于招募免疫细胞到感染部位以清除病原体[48]。另一方面，F361和F265的皮肤中rock2和il1b的表达量降低，而其他家族（尤其是F419）则没有这种变化。rock2的表达下调与促炎条件下的免疫平衡恢复有关[49]。与先天免疫系统相关的一些关键成分（如nkl、pglyrp2、prf1.3在头部肾脏中，psap、h2-q9和c1qb在头部肾脏和皮肤中）在F361中的表达水平高于其他家族。NK-Lysin和perforin主要由毒性T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞产生，参与对抗入侵病原体的防御[50,51]。h2-q9（编码Qa2蛋白）是一种与小鼠相关的非经典MHC Ib类分子，已被证明可以向CD8? T细胞呈递肽段[52,53]。有趣的是，Qa2已被证明能抵抗由Taenia crassiceps引起的囊尾蚴病[54]。作为C1q复合物的组成部分，c1qb基因在经典补体级联反应中通过识别/清除外来颗粒发挥着关键作用。C1q还被认为可以调节巨噬细胞向抗炎表型的极化，并抑制炎性体的激活[55]。此外，与F175和F419相比，F261和F361的皮肤和头部肾脏中palm3的表达水平降低。palm3的过表达与炎症反应加剧有关，而其下调可以抑制诱导的炎症[56]。与perforin（prf1.3）不同，编码aerolysin样蛋白（在皮肤中表达下降）和stonustoxin亚基β（sntx-b在头部肾脏中表达下降，在皮肤中表达上升/下降）的基因在F361中的表达主要低于其他家族。aerolysin和stonustoxin可能作为对抗寄生虫（如海虱）的防御系统，但它们的确切作用仍有待阐明[57,58]。kbas和ighd在F361的皮肤中表达水平高于其他家族，表明它们可能参与了对抗L. salmonis的免疫反应。与角蛋白和胶原蛋白家族相关的基因（如krt13、krt8.2.l和col6a2）在F361中的表达量普遍高于其他家族，这可能为抵抗机械应力和寄生虫入侵提供了更强的屏障[59]。F361中mmp9、mmp13和timp2的表达减少，可能表明该家族的组织损伤控制得更好，修复过程也更为有效[60]。此外，tgm1、tgm2和tgm3在F361和F261的皮肤中的转录水平降低，可能表明这些家族的组织损伤较小，所处的应激条件较轻[60]。一些热休克蛋白（HSPs）在F361中的表达低于其他家族（如hspa14和hspd1在皮肤中；hspa8在头部肾脏和皮肤中），这可能是由于F361中的寄生虫负荷较低，表明该家族具有更有效的应激耐受机制。肌球蛋白和原肌球蛋白家族的多个成员（如tpm2、tnnc2、tnni1、myha、mylk3和myl3）在海虱Calimus期感染后发生了调节，其中大多数基因在10°C时的表达较低，在20°C时表达较高[9]。这些生物标志物的表达变化可能与大西洋鲑鱼在感染海虱Calimus期后体力活动增加有关[9]。多种血红蛋白（如hba1、hba4、hbb、hbb1和hbp2；在两种组织中均上调）和铁蛋白（ftm，在两种组织中表达上升/下降）在F361中的表达多样，这表明它们参与了铁的稳態和防御海虱[9,11,13,35]。

与温度升高相关的转录组变化
对高温应激的一般响应分为三个层次：初级（儿茶酚胺和皮质类固醇的释放）、二级（代谢变化和能量动员）和三级（生长、繁殖和免疫的抑制）[18,19]。之前已经研究了健康/受威胁的鲑科鱼类在高温下的转录组变化[[61], [62], [63]]。在本研究中，比较了感染了海虱Calimus期或成年期的的了大西洋鲑鱼在不同饲养温度（标准温度10°C和升高温度20°C）下的转录组响应。这里我们讨论了在家族内部和家族间比较中表现更丰富和/或显著的基因。热应激会破坏蛋白质的稳定性和功能，导致产生HSPs，以防止蛋白质变性/错误折叠并维持细胞功能[64]。在高温下感染了海虱Calimus期或成年期的鲑鱼头部肾脏和皮肤中，多种HSPs（serpinh1 [hsp47]、hsp90aa1、hspa8、dnaja和hsp90b1）的转录水平增强。这些差异表达基因（DEGs）也参与了与热休克反应相关的GO术语（“对热的响应”、“对温度刺激的响应”和“ATP依赖的蛋白质折叠伴侣”）。serpinh1和hsp90aa1之前已被认为是大西洋鲑鱼热应激的可靠标志物[63]。serpinh1是内质网中的胶原特异性伴侣蛋白，参与前胶原的正确折叠和组装[65,66]，而hsp90aa1是一种分子伴侣蛋白，在热应激条件下在应力适应、蛋白质稳态和细胞信号传导中起重要作用[61]。我们的研究结果表明，hspa8和dnaja也可能被视为对高温有响应的潜在标志物，因为它们在暴露于较高温度的Calimus期和成年期感染的鲑鱼中均上调。其他鱼类物种（包括虹鳟[67], [68], [69]、 channel catfish [70]、尼罗罗非鱼[71]和大西洋鲟鱼[72]）也报告了hspa8和/or dnaja的热诱导上调。atf6和atf3在较高温度（20°C）下感染的成年期鲑鱼头部肾脏中的表达量更高。atf6是内质网应激反应的主要调节因子，在热诱导的蛋白质错误折叠时作为转录因子起作用。在Golgi装置中切割后，atf6的活性形式会诱导参与蛋白质折叠（如HSPs等伴侣蛋白）和氧化应激防御的基因[73]。atf3是一种应激诱导的转录因子，对热、炎症和氧化应激有响应[74]。在高温下暴露的鲑鱼中，cirbp和fkbp10的转录水平降低，这与之前的研究结果一致[61,63]。冷诱导的RNA结合蛋白（cirbp）基因编码一种参与炎症、细胞增殖和凋亡的应激响应蛋白[75]，而fkbp10基因编码一种内质网定位的肽基丙氨酸异构酶（PPIase），对胶原蛋白的正确折叠和稳定至关重要[76]。

一些与丝氨酸/精氨酸富集剪接因子家族相关的基因（上调：srsf2和srsf6；下调：srsf2b）在高温下调节，这些基因在调节mRNA剪接和mRNA代谢中起关键作用。在20°C下暴露的鱼类头部肾脏和皮肤中表达两种被注释为elongation factor 2 (eeef2)的旁系同源物，表现出相反的表达模式。eeef2编码一种促进蛋白质合成期间核糖体GTP依赖性转运的蛋白质[77]。srsf2和eeef2之前已被建议作为其他鲑科鱼类慢性热应激的可靠生物标志物[61]。tuba1a（在头部肾脏中下调；在皮肤中上调）、tuba4a（在头部肾脏和皮肤中下调）和tubb4b（在头部肾脏中下调；在皮肤中表达上升/下降）在较高温度下表现出差异表达。这些基因也出现在“间隙连接”和“吞噬体”等GO术语中，特别是在20°C下感染了成年期虱子的鱼类中。作为微管的组成部分，tuba1a、tuba4a和tubb4b对于维持细胞骨架完整性、细胞内运输和细胞分裂至关重要[78]。tuba1a的不同旁系同源物在11号和16号染色体上的表达模式不同[61]。这些结果与先前的研究一致，表明某些微管蛋白可能作为鲑鱼的潜在热应激标志物。hmgb3（上调/下降的旁系同源物）和hmgb3a（下调）在20°C下暴露的鱼类的头部肾脏和皮肤中表现出差异表达[61]。在高温下暴露的大西洋鲑鱼中发现了高迁移率组盒（HMGB）蛋白的调节[79,80]。HMGB蛋白参与与DNA相关的细胞过程，并且在炎症、感染和损伤期间也可以作为细胞因子[81]。rgs5在20°C下暴露的鱼类头部肾脏和皮肤中表达上调。rgs5是一种缺氧响应蛋白，参与血管功能/重塑和内皮细胞凋亡，通过p38信号通路[82,83]。prmt2和hnrnpc在高温下暴露的鲑鱼头部肾脏中表达上调，而dhx32、rps23、nmt1b和h1（组蛋白H1）的表达下调[84]。这些基因在RNA处理、蛋白质合成/稳定性和/或染色质调节中起关键作用，它们的表达变化可能与细胞对热应激的适应有关[70,84]。

与氧化应激/氧化还原稳态相关的多个生物标志物在高温下暴露的鲑鱼中发生了调节。例如，属于谷胱甘肽-S-转移酶（GST）家族的基因在20°C下感染的海鱼中表现出不同的表达（上调：gsta3在头部肾脏和皮肤中；下调：mgst1在头部肾脏和皮肤中）。gsta3是一种GST α类酶，参与通过将还原型谷胱甘肽结合到疏水性亲电试剂上来进行细胞解毒[85]，而lancl1基因编码一种GST酶，通过将谷胱甘肽结合到外源性底物上来保护细胞免受氧化应激[86]。mgst1同时具有谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和GST活性，催化脂质过氧化物的还原和还原型谷胱甘肽与亲电试剂的结合[87]。这些基因还参与了“谷胱甘肽代谢”和“谷胱甘肽转移酶活性”等GO术语，表明它们在应对高温下感染的Calimus期或成年期鲑鱼的抗氧化防御中起作用。在20°C下暴露的鱼类中，cdo1（在头部肾脏和皮肤中）和msrb2（在头部肾脏中）的转录水平下调。msrb2编码一种酶，通过还原蛋白质中的氧化甲基硫氨酸残基来保护细胞免受氧化损伤，从而维持蛋白质完整性和细胞存活[88]。另一方面，cdo1催化半胱氨酸不可逆地转化为半胱氨酸亚硫酸盐，间接影响谷胱甘肽的合成，可能促进氧化应激[89]。高温暴露导致鱼类头部肾脏中的cat（下调）、cbr1（下调）和bco2a（下调）表达下调。此外，在20°C下感染了成年期虱子的鱼类中，txn在头部肾脏中下调但在皮肤中上调。Thioredoxin（txn）和catalase（cat）在维持氧化还原平衡中起关键作用，它们在头部肾脏中的表达下调可能导致蛋白质损伤和凋亡增加[63]。bco2的丢失或表达减少与哺乳动物的线粒体氧化应激相关[90]。cbr1有助于解毒多种反应性羰基化合物，从而保护细胞免受氧化损伤[91]。这些发现共同表明，在热应激下感染的鲑鱼中抗氧化机制受到了影响。

SLC家族包括膜结合转运蛋白，它们主要作为守门员来维持细胞稳态[92]。在高温下暴露的鲑鱼中，与这一家族相关的多个基因发生了调节。此外，一些编码ABC转运蛋白家族成员的基因（上调：abca12、abcb8；下调：abcd3、abcb4、abcb10）在20°C下暴露的鱼类头部肾脏中表现出不同的表达。ABC转运蛋白在正常和应激条件下通过调节多种细胞过程（包括脂质运输、解毒、离子平衡和营养吸收）在维持细胞稳态中起重要作用[93]。与SLC/ABC转运蛋白和/或载脂蛋白（apoob、apoc1、apoeb）相关的基因是“脂质转运”、“羧酸转运”、“无机阴离子跨膜转运”、“同向转运活性”以及“氨基酸跨膜转运活性”这些GO术语的主要组成部分。在20°C环境中饲养的成年受感染鲑鱼的头部肾脏和皮肤中，sgk1基因表达上调，它在应激反应中起重要作用，调控多种细胞过程，包括离子通道活性、膜转运蛋白活性以及细胞生长/存活。先前已有研究表明，热应激可诱导长颌泥吸鱼（Gillichthys mirabilis）和星斑鲆（Platichthys stellatus）中的sgk1基因表达上调[94,95]。在20°C环境下饲养的成年受感染鲑鱼的头部肾脏和皮肤中，atp1b1a基因表达也有所增加，该基因编码Na+/K+ ATP酶蛋白泵的一个亚基，这种蛋白泵在渗透压调节、离子平衡和细胞信号传导中起着关键作用[96]。相比之下，在20°C环境下饲养的鲑鱼的头部肾脏和皮肤中，tmem269基因表达较低，tmem269编码一种功能尚不清楚的膜相关蛋白，据认为可能参与信号转导、蛋白质稳定性以及蛋白质向膜的转运[97]。jun/ap1基因在高温和虱菌感染条件下的调节与其在调节细胞应激反应中的核心作用一致，包括未折叠蛋白反应（UPR）和激活蛋白-1（AP-1）介导的信号通路。作为关键的转录调节因子，jun/ap1整合了多种上游信号，并影响下游涉及细胞凋亡、细胞存活和炎症反应的过程。其温度相关的表达模式在其他鱼类中也有所报道[99,100]，表明它在介导细胞适应热应激方面具有重要作用。这些反应可能反映了在热应激和寄生虫共同作用下，应激信号通路参与维持细胞功能和稳定性的更广泛调控机制[101,102]。急性/慢性热应激已被证实会影响鱼类的免疫炎症反应[63,101]。与此一致，在高温条件下，与炎症和免疫功能相关的基因表达发生了变化，例如头部肾脏和皮肤中的camp、hamp、apoc1、c7b、c1ql2、c1ql4、saa5、ccl4、cxcl10、relt和mmp9基因转录水平升高，而lyz、prf1和il6基因转录水平降低；同时头部肾脏中的litaf和epx基因转录水平也降低。在头部肾脏和/或皮肤中，主要表现为上调的DEGs（“细胞趋化性”、“先天免疫反应”、“适应性免疫反应”、“对刺激的反应正向调节”）相关的GO术语也较为丰富。此外，富集的GO术语“酶抑制剂活性”和“半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性”包括了几种具有酶/蛋白抑制活性的DEGs（例如，salarin、serpinh1、serpinh1a、serpine1、tfpi2、lcn、angptl4在头部肾脏和皮肤中上调；cst在头部肾脏中上调；timp2在皮肤中表达上调或下调）。 protease抑制剂的上调可以通过维持蛋白质稳态并减少应激诱导的细胞凋亡来促进细胞存活[103]。在20°C环境下饲养的鲑鱼的头部肾脏和皮肤中，参与蛋白质代谢（例如cdo1、asrgl1上调；gpt2、gad1下调；gadl1表达上调或下调）、脂质代谢（例如plin2、lpl、angptl4在头部肾脏中上调；apoeb在头部肾脏中上调，在皮肤中下调）以及其他有机/无机化合物代谢（例如cyp4f3、abat、gad1下调）的多种基因表达也发生了变化。这些DEGs参与了多个与代谢过程相关的GO术语，如“PPAR信号通路”、“氨基酸分解代谢过程”、“有机酸生物合成过程”和/或“小分子分解代谢过程”。在鱼类暴露于高温后，参与气体运输、血红素生物合成、铁平衡和/或卟啉代谢的多个基因（例如hba1、hba4、hbb、hbb1和ca1在头部肾脏和皮肤中；cahz、alad、fech、urod、urod、hmbsa、ppox、hmbs和slc4a1在头部肾脏中）表达下调。这些标记物参与了“氧气载体活性”、“碳酸氢盐转运”、“细胞解毒”和“卟啉代谢”等GO术语。这些基因的下调表明，在高温环境下，氧结合效率、酸碱平衡、血红蛋白功能和红细胞稳定性受到了影响。

结论

我们的研究结果表明，不同鲑鱼家族对海虱的反应在分子机制上存在显著差异。这些发现强调了基于家族的转录组分析在识别与海虱抗性和易感性相关的潜在分子生物标志物方面的重要性。值得注意的是，某些家族（例如F361）对海虱感染的反应更为有效；然而，这些模式可能反映了由宿主-寄生虫相互作用塑造的寄生虫附着动态，这可能受到初始感染程度和宿主行为特征的影晌，而不仅仅是内在抗性的影响。基于家族的转录组变化同时出现在皮肤和头部肾脏中，表明海虱寄生具有复杂的局部和全身性影响。值得注意的是，不同虱菌密度的家族之间几种树突状细胞相关受体的表达存在差异，这表明它们在触发和调节对海虱感染的免疫反应中起着关键作用。这项研究揭示了高温引起的深刻转录组改变，包括参与热休克反应、蛋白质代谢、免疫系统和应激反应的多个基因和生物通路的显著调控。这些变化表明，热应激可能会加剧寄生虫对鲑鱼健康的长期影响。尽管RNA-seq提供了比微阵列技术更全面和精确的转录组反应概述，但目前大西洋鲑鱼基因组注释中存在大量未表征的基因（每对比较中有6-21%），这限制了识别该物种其他潜在疾病/应激相关生物标志物的能力。鉴于大西洋鲑鱼基因组注释和功能表征的不完整性，某些基因的归属应谨慎解读。本研究中鉴定的生物标志物为了解不同温度条件下鲑鱼对海虱感染的免疫反应的分子机制提供了更深入的理解。需要注意的是，本研究中观察到的表达差异可能反映了基因组其他区域（如调控位点或转录因子）中的遗传变异。因此，要全面了解抗性/易感性的遗传基础，需要结合SNP基因分型、GWAS、TWAS或eQTL等方法进行补充性基因组分析。总体而言，这些候选基因和假定的生物通路可以为未来开发新的预防策略提供参考。

作者贡献

RG-M：撰写初稿、正式分析、数据整理、可视化、审稿和编辑
WC：正式分析、方法学
JDP：正式分析、方法学
SKW：项目管理和方法学、审稿和编辑
YZ：方法学
AFG：概念化、方法学、资金获取、监督、审稿和编辑
MDF：概念化、方法学、资金获取、监督、审稿和编辑

数据可用性

本研究的支持序列数据可在NCBI的Sequence Read Archive (SRA)数据库中找到，BioProject访问号为PRJNA1256531（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/1256531）。如需更多信息，请联系相应的作者。

未引用的参考文献

[98]

CRediT作者贡献声明

Reza Ghanei-Motlagh：审稿和编辑、撰写初稿、可视化、正式分析、数据整理
Wenlong Cai：方法学、正式分析
Jordan D. Poley：方法学、正式分析
Yuxuan Zhang：方法学
Shona K. Whyte：审稿和编辑、项目管理、方法学
Amber F. Garber：审稿和编辑、监督、方法学、资金获取、概念化
Mark D. Fast：审稿和编辑、监督、方法学、正式分析、概念化