综述：CAR-T细胞功能监测的进展：从临床前评估到临床应用

《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Advances in CAR-T Cell Function Monitoring: From Preclinical Evaluation to Clinical Application

　　余香唐|史宇东|青浦张|亚林齐|子琳陈
武汉纺织大学生物医学工程与健康学院，中国武汉

**摘要**
本文系统回顾了CAR-T监测技术在临床前和临床应用中的关键评估方法。在临床前阶段，采用多种体外检测技术（如51Cr释放法、LDH法、荧光素酶法、流式细胞术和阻抗法）来评估CAR-T细胞的细胞毒性、迁移能力和安全性。其中，非放射性、高通量和实时监测技术备受关注。结合先进成像技术的动物模型为CAR-T的体内分布、疗效和毒性评估提供了重要工具。在临床应用中，动态监测CAR-T细胞的扩增、肿瘤负荷和安全性至关重要。液体活检和人工智能分析等新兴技术进一步提高了监测的准确性和早期干预的能力。通过持续的技术创新，CAR-T监测技术将进一步提升其疗效、安全性和应用范围，为肿瘤治疗带来新的突破。

**引言**
传统上，肿瘤治疗主要依赖于手术切除、化疗和放疗[1]。尽管这些方法在一定程度上可以控制肿瘤的进展，但仍无法实现显著的治疗效果。近年来，免疫疗法作为一种有前景的治疗方式受到了广泛关注，它利用患者的免疫系统来对抗癌症，无论是通过恢复内源性免疫功能还是通过建立人工免疫来触发新的免疫反应[2]。这种免疫疗法包括以下策略：分子靶向治疗[3]、免疫检查点抑制剂治疗[4,5]、细胞因子治疗[6]以及嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗[7]。在这些方法中，CAR-T疗法作为一种突破性技术，在肿瘤管理方面取得了显著疗效，尤其对复发性及难治性血液系统恶性肿瘤（如淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤）具有有效的治疗选择[8,9]。

CAR-T免疫疗法是一种新型的免疫疗法，涉及对患者T细胞进行基因工程改造，在体外大量培养以生成肿瘤特异性CAR-T细胞，然后将其重新引入患者体内以靶向并攻击癌细胞[10]。该疗法在某些血液系统恶性肿瘤的治疗中取得了重大突破。例如，对于多发性骨髓瘤患者，CAR-T治疗的无进展生存期（13.3个月）远高于化疗（4.4个月）；在急性淋巴细胞白血病（ALL）的治疗中，48%的患者实现了持续缓解[11]。目前已有12种CAR-T产品上市。随着CAR-T制备技术的发展，当前CAR-T技术的发展趋势集中在针对实体瘤的CAR-T研发以及通用型CAR-T的开发上。制备实体瘤CAR-T细胞需要考虑增强CAR-T的迁移和浸润能力，同时解决因缺乏肿瘤抗原而可能产生的脱靶效应，并提高CAR-T在实体瘤免疫抑制微环境中的持续杀伤能力。通用型CAR-T通常通过敲除TCR、HLA、B2M和PD-1基因来实现，以减少T细胞的免疫排斥[12]。

CAR-T的开发过程包括以下步骤：靶点发现、CAR设计、载体生产、T细胞制备、临床前试验、临床试验、商业推广和临床监测（图1A）。其中，临床前试验需要测试CAR-T的体外杀伤功能、体内药代动力学及其安全性，以筛选出适合临床试验的有效且安全的CAR-T，增加CAR-T获得FDA批准的可能性[13]。在临床试验中，需要精确评估CAR-T的安全性、增殖和耗竭情况，以探索CAR-T的特定临床疗效。即使在CAR-T疗法上市后，也需要监测其安全性和持久性以及治疗过程中的耗竭等其他功能状态[14]。这是为了及时调整治疗方案，实现更好的治疗效果。在本综述中，我们总结了不同阶段评估CAR-T功能的方法，包括与CAR-T杀伤和迁移功能相关的临床前评估，以及与长期肿瘤抑制和安全性测试相关的临床评估。我们将阐明这些检测方法的重要性，讨论CAR-T检测中存在的技术缺陷及未来发展趋势，并提出我们对于开发更具疗效的CAR-T的看法。

在临床前研究中，CAR-T细胞的功能测试是确保其安全性、疗效和可转化性的关键步骤，直接影响后续临床试验的成功率和患者的安全性。

CAR-T的体外功能验证首先从检测其杀伤能力开始。过去三十年中，CAR-T细胞疗法的杀伤能力得到了显著提升[15]。检测水平从低精度向高精度、从低通量向高通量、从静态向动态转变。

使用铬-51（51Cr）释放测定法检测CAR-T细胞的肿瘤毒性是一种经典的体外细胞毒性测量方法[16]。该方法起源于20世纪60年代[17]，通过使用Na251CrO4标记靶细胞并与CAR-T细胞共培养来实现。CAR-T的杀伤率可通过培养上清液中51Cr的放射性脉冲计数（cpm）与死亡靶细胞数量之间的正相关关系来确定[18]。该方法具有高灵敏度、强准确性和良好的标准化优势。然而，51Cr测定法也存在许多缺点，包括放射性危害、高背景噪声、无法检测早期凋亡或其他形式的死亡；标记51Cr的释放速率较慢，无法准确反映CAR-T细胞的长期杀伤效果[19]。为克服这些缺点，对51Cr技术进行了优化。例如，使用低血清或无血清培养基（1% FBS）进行标记可以减少蛋白质竞争，提高标记效率，并降低5-10%的自发释放率[20]。使用液体处理工作站实现自动化平板制备和上清液收集，从而提高实验通量并减少人为误差。这些改进使传统的51Cr释放方法更加精确和高效，但其放射性危害使其难以大规模应用。总体而言，51Cr释放方法具有放射性危害，需要特殊设备，不适合常规使用。此外，该方法只能检测细胞膜破裂，无法监测细胞凋亡等死亡模式。51Cr的自发释放率相对较高（5-10%），影响其监测的准确性，几乎无法用于实时临床监测，已被大多数实验室弃用。考虑到安全性问题，更多非放射性测量方法（如LDH、流式细胞术或荧光标记等）已成为测量CAR-T杀伤效果的主流方法。

与51Cr释放法相比，LDH法是一种更安全的非放射性测量方法。当CAR-T细胞破坏靶细胞膜时，LDH会释放到培养上清液中，通过测量LDH的吸光度（OD值）来评估靶细胞的裂解情况[21]。

与51Cr释放测定法相比，LDH释放测定法是非放射性的，且自发释放率较低，因此更安全、更准确。然而，传统LDH方法存在灵敏度低和背景干扰等问题。为了提高灵敏度，研究人员利用WST-8的显色反应增强了LDH释放测试的灵敏度。通过电子传递链的信号放大，LDH释放测试的灵敏度可提高30%[22]。第四代LDH检测方法结合了纳米技术[23]，使用上转换纳米粒子标记LDH抗体，这些纳米粒子可在近红外区域（980 nm）被激发并在可见光区域（540 nm）发光，完全避免了生物样本的自发荧光。该方法具有极高的灵敏度，能够检测极低（0.1%）的杀伤率。此外，LDH能够穿透厚度达500 μm的肿瘤类器官，从而在3D模型中检测CAR-T的杀伤率。LDH方法不仅能反映肿瘤细胞的死亡状态，还能反映CAR-T细胞的代谢状态，而51Cr方法仅能反映肿瘤细胞的裂解情况。

尽管LDH释放方法已得到优化，但仍存在背景干扰和缺乏实时监测能力的局限性，因此出现了更多CAR-T细胞毒性检测方法（如Calcein-AM和荧光素酶法）。

钙黄绿（Calcein-AM）是一种用于活细胞的非放射性、高灵敏度荧光染料，广泛用于评估CAR-T细胞的杀伤功能。Neri等人开发了一种使用Calcein-AM的细胞毒性检测方法[24]。该方法与51Cr释放测试具有相同的灵敏度，但标记时间可缩短一半。其最重要的特点是允许回收细胞和上清液进行进一步分析。Gillissen等人开发了一种高通量流式细胞术（FACS）Calcein-AM保留方法，通过添加固定数量的荧光微珠进行定量分析。与传统Calcein-AM方法相比，该方法将背景干扰降低了约3.6倍，具有很强的重现性和高灵敏度[25]。研究发现，在Calcein AM方法中使用低血清或无血清培养基可增强信号稳定性。使用含有抗漂白成分的缓冲液可提高准确性。与荧光显微镜成像系统的结合实现了细胞杀伤过程的可视化[26]。该方法通过量化靶细胞的荧光衰减来反映CAR-T的特异性杀伤活性。CAR-T细胞可用CellTrack Red标记，肿瘤细胞可用Calcein-AM标记，形成双荧光标记系统，实现效应细胞增殖和靶细胞死亡的同步监测[27]。

Calcein-AM测定的主要问题是其荧光信号会随时间衰减，因此必须严格控制染色和检测时间。该方法还存在实时性能不足和背景干扰的问题。因此，基于96孔板开发了更多实时、精确的CAR-T杀伤功能监测方法。

荧光素酶报告基因是一种常用的体外测定方法，用于评估CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果[28]。其核心原理是利用基因工程使靶细胞（如肿瘤细胞）表达荧光素酶。CAR-T的杀伤率可根据荧光素酶活性与存活靶细胞数量之间的线性关系计算得出。与51Cr测定法相比，荧光素酶测定法具有高安全性、操作简单和连续检测的优势。该方法可在96/384孔板中进行，适用于大规模药物筛选或CAR-T优化实验。传统荧光素酶（如Firefly）的半衰期较短，仅为30分钟[29]，而最近发现的海洋荧光素酶半衰期长达24小时，同时具有高亮度和稳定性，显著提高了CAR-T细胞毒性检测的效率[30]。Rossignol等人开发了一种基于Nanoluciferase的细胞毒性检测方法。Nanoluciferin是一种19千道尔顿的蛋白质，来自深海虾Oplophorus gracilirostris的催化亚基，可将化学能转化为光能，使信号稳定且穿透性强，灵敏度高于51Cr方法，半衰期可达7.7天。此外，该方法还能检测化学试剂或紫外线照射引起的细胞凋亡[31]。此外，还可扩展到CAR-T细胞的体内监测。Choi等人开发了一种基于耐热变体Beetle Luciferase（Luc146-1H2）的“Matador-Glo测定法”，利用D-luciferin和Luc146-1H2作为荧光素酶底物对进行发光检测，通过在靶细胞内过表达Luc146-1H2来实现这一目标。一旦目标细胞的细胞膜破裂，Luc146-1H2将从目标细胞中释放出来，其活性可以被检测到，从而识别出死亡或正在死亡的目标细胞（图3A）[32]。这种方法可以与基于海洋萤光素酶的Matador检测方法结合，开发出一种双萤光素酶检测方法。此外，这种方法还可以扩展到CAR-T的体内杀伤检测。Lupold等人开发了人源化的Metridia萤光素酶（MLuc）。与其他萤光素酶（GLuc和CLuc）相比，MLuc具有高分泌效率和不受血清限制的优点。人源化MLuc的线性检测范围是传统终点生存检测方法的四倍，适用于各种大型组织培养容器，并且可以在同一天内重复测量[33]。然而，CAR-T细胞在杀伤过程中会分泌IFN-γ，导致由CMV启动子驱动的萤光素酶表达异常增加，这影响了其准确性。基于这一现象，Hou等人发现使用EF1α启动子在目标细胞中驱动萤光素酶表达比传统的CMV启动子具有优势，包括不受细胞因子影响和保持高表达。这一改进显著提高了检测的准确性和重复性[34]。萤光素酶方法不仅可以监测CAR-T的杀伤效率，还可以监测CAR-T的肿瘤浸润情况。McManus等人开发了一种双报告基因系Raji GFP-Luc2，并进一步将Raji GFP-Luc2细胞组装成3D肿瘤球体。作者利用3D成像和延时视频展示了CAR-T如何实时渗透到非凝胶嵌入和凝胶嵌入的Raji-GFP-Luc2球体中。基于此，作者开发了一种评估CAR-T肿瘤浸润效果的方法。通过将萤光素酶检测的定量结果与各种活细胞成像技术提供的动态和实时信息相结合，形成了一种敏感的多模态检测方法，可以可视化T细胞在3D中的浸润情况。这对于理解CAR-T在生理条件下如何渗透到实体肿瘤中并靶向杀死癌细胞至关重要[35]。萤光素酶检测方法因其极高的灵敏度、低背景、宽线性范围和便捷的操作而近年来受到了研究人员的广泛关注。这项技术的发展也是最快的之一。该方法已成为报告基因研究中的“黄金标准”之一。然而，萤光素酶方法也有其局限性。例如，尽管萤光素酶检测可以连续检测CAR-T细胞的杀伤效果，但它无法区分死亡细胞的类型。流式细胞术的发展可以弥补这一不足。萤光素酶检测的唯一缺点是构建表达萤光素酶的稳定肿瘤细胞系成本高昂且耗时较长。但随着基因转染技术的进步，转染成本和萤光素酶表达时间将进一步降低，这将有助于萤光素酶检测的更广泛应用。

总之，CAR-T杀伤活性的检测方法可以使用不同的标记物（51Cr、LDH、Calcein-AM、萤光素酶）标记目标细胞，并将它们与CAR-T一起在96孔板中孵育。通过测量杀伤过程中的标记物信号变化，可以计算出CAR-T的杀伤率（图2）。流式细胞术是评估CAR-T杀伤功能的重要技术，它可以通过各种标记策略定量分析目标细胞的坏死、凋亡和焦亡情况或CAR-T细胞的活性。Annexin V-FITC结合PI可以检测早期凋亡和晚期凋亡的肿瘤细胞[36]、[37]。Hong等人对不同程度凋亡的免疫细胞进行了Annexin V和PI双染色，并通过流式细胞术进行分析，发现Annexin V+/PI-细胞的百分比与细胞凋亡程度呈正相关[38]。Annexin V/PI组合的问题是无法准确识别细胞类型。Alshehade等人开发了一种结合Annexin V-FITC/PI染色和APC偶联的抗CD44的检测方法，可以精确监测MDA-MB-231乳腺癌细胞的存活和凋亡状态。这种方法对于阐明肿瘤细胞模型中的凋亡和治疗抵抗信号网络具有重要意义[39]。CFSE也可以用于标记目标细胞，从而检测CAR-T细胞杀伤后残留目标细胞的荧光强度，反映增殖抑制的程度。Duarte等人用CFSE标记了由细胞因子诱导的外周血淋巴细胞，并通过流式细胞术测量CFSE荧光强度来反映T细胞的增殖情况[41]。这种方法的缺点包括：CFSE容易被淬灭，可能产生细胞毒性，并且与多色流式细胞术不兼容。为了解决这些问题，研究人员优化了染色方案，将CFSE浓度从>10 μM降低到5-10 μM，控制孵育时间为10-15分钟，并用含血清的培养基终止反应以减少细胞毒性并提高标记稳定性。将CFSE与远红荧光染料（APC或BV785）结合使用可以显著提高信噪比，避免与FITC和PE等荧光通道的重叠，提高多色流式细胞术的准确性[42]。Lu等人利用AI软件（DeepFlow）辅助流式细胞术分析，实现CFSE峰群的自动分选和增殖指数（PI）的计算，从而提高准确性。在AI的帮助下，数据分析可以在5分钟内完成（而技术人员需要10-20分钟），同时还能精确分类和计数T细胞、B细胞、NK细胞和免疫细胞亚群[43]。用于标记目标细胞的荧光酶也可以通过流式细胞术检测目标细胞的数量。Gopalakrishnan等人基于海洋萤光素酶（如Gluc、Nluc、Tluc16和Mluc7）开发了一种Topanga试剂，并与FITC标记的抗体进行双染色，通过流式细胞术检测CAR-T细胞。这种方法可以在30-40分钟内完成，显著缩短了传统流式细胞术所需的2-3小时操作时间[44]。机器学习技术可以自动识别萤光素酶阳性细胞群体，减少人为分选错误并提高准确性[45]。流式细胞术的发展使得不同类型死亡细胞的快速高效识别成为可能，是CAR-T杀伤效率精确检测方法的重要组成部分。流式细胞术具有快速、精确的特点，能够区分不同类型的死亡细胞，适用于临床应用。其缺点是无法提供连续监测，也无法解决细胞融合引起的假阳性问题。

ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种通过检测CAR-T细胞与目标细胞共培养后释放的效应分子（如颗粒酶B、穿孔素）[46]或细胞因子（如IFN-γ、TNF-α）[47]来间接测量CAR-T杀伤活性的方法[48]。这些分子的分泌水平与CAR-T细胞的细胞毒性功能呈正相关。为了提高ELISA方法的灵敏度，研究人员将电化学发光（ECL）技术与ELISA结合，开发了ECL-ELISA[49]。该技术将电化学发光与多重检测功能结合在一起。基本原理是将二级抗体或检测抗体标记钌三苯基吡啶复合物。氧化后，标记的钌复合物与溶液中的三丙胺自由基（TPA）反应，形成Ru(bpy)32+的激发态。钌标记的分子可以发生循环发光，实现信号放大，灵敏度达到fg/mL级别。MSD多孔板的每个孔都包含一个独立电极，可以同时检测多个指标。此外，该技术消除了洗涤步骤的需要，减少了处理时间。与传统ELISA相比，ECL-ELISA具有更高的灵敏度、多重检测能力、更少的样本需求（50-100 μL vs 25 μL）和更短的检测时间（4-6 h vs 1.5-2 h）。2015年，研究人员发明了全自动微流控ELISA技术。这项技术从样本处理到结果生成完全自动化，并与微流控技术集成，减少了操作错误，同时实现了多指标的同时检测，具有时间消耗短（90分钟）和样本体积要求低（2.5-25 μL）的优点[50]。尽管ELISA方法具有高灵敏度和高通量定量分析多个因子的能力，适用于临床样本，但它仍有一些局限性：例如，它受培养基条件的影响较大，且只能通过检测细胞因子和颗粒酶间接测量CAR-T细胞的杀伤率。因此，开发基于生物传感器和阻抗的动态CAR-T杀伤监测方法非常重要。

在过去十年中，开发了大量用于检测细胞因子的生物传感器。这些传感器有可能集成到生物反应器系统中，用于监测细胞因子的水平[51]、[52]。Ma等人开发了一种夹心免疫测定策略，使用镀有血浆抗体的金纳米粒子标记目标细胞因子，并监测产生的光散射的纳米等离子体信号。通过将这一策略集成到白血病芯片模型中，可以实现对CAR-T细胞分泌的细胞因子的数字检测[53]。该方法可以同时监测六种不同的细胞因子（TNF-α、IFN-γ、MCP-1、GM-CSF、IL-1β和IL-6），动态范围为每毫升10到104微克，灵敏度极高（图3B）[54]。Cui等人开发了一种共培养模型，该模型包含一个蠕动泵，可以在3小时培养期间连续监测TNF和IL-12p70的浓度变化。它还允许使用免疫荧光技术定量监测细胞分泌的TNF和IL-12p70，检测灵敏度达到5 pg/mL，满足CAR-T生产中的实际监测需求（图3C）[55]。然而，这仍处于研究阶段，距离临床应用还有很长的路要走。阻抗方法是一种实时的、非标记的技术，用于分析细胞功能。它通过监测CAR-T细胞杀伤过程中目标细胞阻抗的动态变化来反映CAR-T的杀伤率。常用的检测设备包括xCELLigence RTCA[56]和ECIS（电细胞-基底阻抗传感）[57]。与51Cr和萤光素酶检测相比，基于阻抗的检测方法提供实时动态数据、更低的成本和更高的效率，无需标记或终止培养过程，并且具有高通量。它适用于药物筛选或CAR-T功能的优化。然而，它仍有一些局限性，例如依赖于目标细胞的粘附性、设备成本较高，以及在信号解释过程中需要排除非特异性因素的干扰（如细胞聚集、细胞形态变化、培养基变化）。研究人员开发了Maestro Z/ZHT平台，该平台利用多频交流阻抗技术。通过施加不同频率（如1 kHz-10 MHz）的交流电流，可以检测反映细胞数量变化以及细胞形态和通透性微妙变化的细胞阻抗变化。这使得阻抗分析能够用于评估CAR-T对实体肿瘤的杀伤效果[58]。Zhou等人利用方波伏安技术，在12天的造血干细胞生物反应器培养过程中实现了分泌蛋白的在线检测。纳米结构微电极经过巯基化DNA链修饰并标记了亚甲蓝报告剂，实现了直接的电化学检测。该方法达到了pg/mL的检测水平，比ELISA的准确性更高（图3D）[59]。生物传感器的基本工作原理是通过抗体的竞争性结合。当溶液中目标蛋白浓度过高时，会导致蛋白质与抗体结合而不是抗体与DNA链结合；当目标蛋白浓度较低时，会导致抗体与DNA链结合。这种空间屏障阻碍了杂交过程，降低了转化后的电化学电流。随着技术的不断优化和创新，体外CAR-T细胞毒性检测方法已经从简单的杀伤计算发展成为一个能够安全、便捷、快速且全面评估CAR-T细胞整体水平的系统，为CAR-T产品的发展提供了强有力的技术支持。为了进一步探索这些方法在临床治疗中实时监测CAR-T细胞杀伤功能的可行性，我们总结了这些监测方法的灵敏度、通量、重复性和成本等方面。这些特性在表1中进行了总结。总体而言，荧光素酶、ECL-ELISA和生物传感器方法表现出最佳的灵敏度；流式细胞术、ELISA和荧光素酶检测具有高通量检测的特点；51Cr方法和流式细胞术具有高度标准化；ELISA和阻抗方法在自动化后显示出良好的重复性；LDH方法和Calcein-AM方法的成本相对较低，而生物传感器和阻抗方法的设备投资较高。考虑到灵敏度、成本、重复性和通量等因素，流式细胞术、ELISA和荧光素酶检测更有可能在临床环境中得到广泛应用。由于放射性危害，51Cr方法逐渐被替代。

除了细胞毒性之外，CAR-T细胞的迁移和浸润能力——特别是对于实体瘤治疗而言至关重要——需要专门的体外评估模型。CAR-T细胞的体外迁移和浸润功能是评估其靶向肿瘤组织能力的关键实验，在实体瘤治疗中尤为重要[60]。这些实验主要涉及趋化迁移、肿瘤穿透和突破基质屏障等能力的定量分析。CAR-T细胞迁移能力的体外测试主要包括Transwell测定、3D肿瘤球或微流控芯片。一旦体外迁移和杀伤功能得到验证，体内模型对于在生理相关背景下评估CAR-T细胞的实际治疗疗效和安全性就变得必不可少。Transwell测定是一种经典的评估CAR-T细胞趋化迁移能力的方法[61]，适用于筛选和优化CAR的结构、评估对趋化因子的敏感性以及预测体内浸润潜力。Transwell迁移测定代表了研究趋化因子梯度诱导的方向性细胞迁移的模型[62][63]。Tang等人开发了LY/ICG@HES-PCL纳米颗粒，并使用Transwell测定研究了趋化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11对CAR-T细胞的趋化效应。研究表明，LY/ICG@HES-PCL纳米颗粒促进了CAR-T细胞分泌IFN-γ，刺激了CXCL9/10/11的产生，并显著提高了CAR-T细胞的肿瘤迁移能力[64]。为了更准确地评估CAR-T细胞的跨内皮迁移能力，研究人员在Transwell膜上接种了C166小鼠窦状内皮细胞或SVEC4-10淋巴内皮细胞，以模拟体内血管/淋巴屏障[65]。传统的Transwell测定具有高准确性和低成本，但可能导致细胞损伤，并且操作复杂，延长了检测时间。此外，单层内皮无法完全模拟血管屏障，存在通量低和操作繁琐的问题，仅适用于CAR-T迁移功能的初步评估。

3D肿瘤球模型可以更准确地模拟实体瘤的空间结构和基质屏障[66]。3D肿瘤球是通过培养肿瘤细胞形成的，直径为300-500 μm。通过添加M2型巨噬细胞（TAMs）[68]或CAFs[69]，可以进一步修改3D肿瘤球，以测试免疫抑制条件下的CAR-T细胞迁移情况。此外，肿瘤细胞可以与内皮细胞共封装，以模拟血管化的实体瘤模型[70]。Cho等人基于3D肿瘤球构建了一个微孔平台，发现添加BG-Herceptin可以将CAR-T的肿瘤迁移能力提高2倍。与2D模型相比，3D模型可以研究CAR-T的生理相关参数[71]。Chen等人开发了一种基于深度学习的自动化和精确的3D肿瘤球分析系统，利用卷积神经网络和人工智能识别技术，可以自动分析肿瘤球的形状、体积和侵袭性，准确率高达95%（而传统方法的准确率在65%到85%之间），从而实现三维肿瘤球行为的完全自动和高度精确的评估[72]。3D肿瘤球模型与实体瘤的结构非常相似，其对CAR-T细胞迁移功能的评估比Transwell技术更为客观。然而，3D肿瘤球缺乏免疫细胞和血管网络，因此无法完全模拟肿瘤微环境。微流控技术的发展可以更好地解决这些问题。然而，上述传统的迁移实验存在明显的局限性：（1）它是静态的、基于终点的测量方法，只能提供初始和最终的细胞计数，无法观察迁移过程；（2）缺乏复杂的微环境，难以模拟血管结构、组织屏障和复杂的化学因子梯度；（3）分辨率低，无法在单细胞水平上进行实时跟踪动态行为。微流控芯片精确解决了这些问题，使研究人员能够在芯片上“重建”生理或病理微环境，并实时观察CAR-T细胞如何在其中“巡逻”和“寻找”目标。

微流控芯片可以分为以下几类：（1）梯度生成器：设计成树状或蛇形通道，用于生成稳定的化学梯度。通过在芯片通道内建立稳定的可调化学梯度（如趋化因子CXCL9、CXCL10、CCL19等或肿瘤细胞分泌物），可以评估单个CAR-T细胞的平均迁移速度，从而确定最终到达目标区域的细胞比例，进而评估CAR-T细胞的迁移能力；（2）微血管网络：通过图案化或生物打印创建仿生血管，构建“血管-组织”界面模型，通常用于评估CAR-T进入实体瘤的途径，以及参与这一过程的粘附分子（如ICAM-1/VCAM-1）；（3）组织重构：通过将肿瘤细胞嵌入Matrigel基质中构建3D肿瘤微环境，从而能够实时观察CAR-T细胞在受间质压力和屏障影响的三维基质中的迁移过程。这三种模式也可以结合使用，共同评估CAR-T的迁移功能。Grandhi等人开发了一种新型高通量微生理系统（MPS）实验平台，用于研究T细胞在3D肿瘤微环境中的趋化性、迁移和肿瘤杀伤功能。该平台基于商用双通道微流控芯片系统，通过加入细胞外基质（ECM）和化学趋化因子梯度来模拟体内肿瘤微环境的复杂性。该研究展示了该平台在评估T细胞对不同趋化因子（如CXCL12、CXCL10和小分子CXCR3激动剂）的反应以及CAR-T的肿瘤杀伤功能中的应用[73]。Jiang等人建立了一种结合电化学阻抗和Transwell的微流控技术模型，可以实时捕捉细胞的电响应，高效量化癌细胞的侵袭能力，操作更简单，耗时更少，且没有环境干扰，比传统微流控技术更优越[74]。Ma等人开发了一种具有免疫能力的芯片，共培养患者免疫细胞，构建血管网络，并在芯片上建立3D培养系统。该芯片利用IFN-γ和TGF-β1诱导免疫抑制微环境，模拟人体骨髓微环境，可以实时监测CAR-T细胞的迁移、外渗和靶向杀伤过程，CAR-T杀伤功能的预测准确率为89%。这种平台为评估CAR-T的治疗效果提供了高通量、高度仿生的“芯片临床试验”工具[75]。如果微流控芯片能够降低制造成本、提高通量并建立评估标准，它们将具有更大的临床应用价值。

完成CAR-T的体外功能测试后，需要建立小鼠肿瘤模型来研究CAR-T的体内肿瘤杀伤疗效和安全性。这一步有助于进一步完善CAR-T细胞功能的体外评估系统（图1B）。体内实验是进一步评估CAR-T细胞抗肿瘤疗效的一部分[76]。这些模型可以模拟人体微环境，全面评估CAR-T细胞的增殖能力、持久性、肿瘤杀伤疗效和安全性。以下是常用的方法及其各自的优缺点（表2）。建立该模型涉及将人类肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠（如NSG和NOG小鼠）中[77][78]。一旦肿瘤生长到一定大小，再重新注入CAR-T细胞。通过监测肿瘤体积、小鼠的存活期和CAR-T的体内分布来评估CAR-T的治疗疗效[79]。Tang等人在NSG小鼠中建立了Raji皮下肿瘤模型，研究LY/ICG@HES-PCL纳米颗粒增强CAR-T细胞对抗实体瘤疗效的能力（图4B）。利用小型动物体内成像技术，研究人员分析了不同治疗组中CAR-T细胞在肿瘤部位的积累情况和肿瘤体积的变化；这些数据使他们能够确定CAR-T细胞在肿瘤部位的积累程度和肿瘤杀伤效果。为了进一步探索不同CAR-T细胞组对肿瘤复发的抑制作用，研究人员在肿瘤切除后缝合肿瘤床，建立了Raji肿瘤复发模型。通过比较复发肿瘤的体积，可以确定CAR-T对Raji肿瘤复发的抑制作用。这项研究表明，LY/ICG@HES-PCL增强了CAR-T细胞对抗实体瘤的肿瘤杀伤效果并抑制了肿瘤复发[64]。Shang等人将患者来源的AML类器官与异种移植模型结合，模拟白血病干细胞（LSC）微环境，研究CD97靶向CAR-T细胞的治疗和预防效果。他们使用小鼠体内成像技术研究了不同治疗组中CAR-T细胞在肿瘤部位的积累情况和肿瘤体积的变化。研究表明，CD97 CAR-T显著抑制了急性髓系白血病的进展并延长了生存期[80]。然而，该模型仍有一些局限性：它缺乏完整的免疫系统，无法评估宿主的免疫反应（如细胞因子风暴）。此外，模拟某些实体瘤存在挑战：例如，胰腺肿瘤细胞在小鼠中的生长缓慢或侵袭性不足。人源化小鼠模型解决了模拟人体免疫微环境的挑战。人源化小鼠模型的建立方法是将人类免疫系统植入免疫缺陷小鼠中（图4C），然后接种人类肿瘤[81]，从而构建“人类免疫系统+人类肿瘤模型”[82][83]。与异种移植模型相比，人源化小鼠模型更接近人体生理环境，可以研究CAR-T与肿瘤及免疫系统之间的相互作用，也可用于安全性评估。Ye等人将人类PBMC植入NSG小鼠中，建立人源化小鼠模型，并研究了使用人源化小鼠监测CRS的可行性。通过ELISA分析了不同单克隆抗体处理后体内和体外的细胞因子释放情况。结果表明，体内模型可以更敏感地检测特定供体的细胞因子释放过程。这项研究证实，可以使用人源化小鼠模型监测体内CRS[84]。Niu等人建立了人源化双肿瘤（淋巴瘤和骨髓瘤）模型，研究Foxp3工程化CAR-T细胞在实体瘤中的抗肿瘤活性和安全性。研究人员使用体内动物成像系统和ELISA测定评估了不同治疗组中的抗肿瘤疗效和安全性。该研究表明，与传统CAR-T相比，Foxp3-CAR-T不仅表现出显著增强的抗肿瘤活性（肿瘤清除率：92% vs 45%），还降低了细胞因子释放综合征（CRS）的风险（CRS发生率降低了70%）[85]。这种方法的缺点是技术复杂，建模周期长（8-12周）且成本较高。此外，T细胞可能会攻击小鼠组织，使得模型建立变得困难[86]。该方法包括将小鼠肿瘤细胞接种到免疫功能正常的小鼠体内，然后输注经过改造的小鼠CAR-T细胞（需要使用小鼠特异性CAR），以评估肿瘤抑制作用、T细胞浸润和免疫记忆[87][88]。这种建模方法简单，可用于研究CAR-T与宿主免疫系统之间的相互作用。Hatae等人将EGFRvIII胶质瘤细胞植入C57BL/6小鼠体内，建立了一个同基因小鼠模型，并研究了CAR-T细胞对肿瘤的细胞毒性作用。他们使用纵向生物发光成像和Kaplan-Meier生存曲线，分析了有无CAR-T治疗时肿瘤体积和生存率的变化，从而评估了CAR-T细胞的细胞毒性[89]。然而，小鼠来源的CAR-T细胞与人类来源的CAR-T细胞存在显著差异，这种评估仍距离临床应用有一定差距。肿瘤细胞被植入小鼠的主要器官中，以构建原位肿瘤模型，模拟临床肿瘤微环境（图4E）[90]。这种方法的优点是微环境更真实，适合研究CAR-T在实体瘤中的浸润能力，同时还能评估肿瘤转移的抑制效果。Chen等人通过将表达EGFRvIII的U87 MG-Luc细胞颅内注射到NCG小鼠体内，建立了原位小鼠模型，旨在研究表达IL15-CCL19的EGFRvIII CAR-T细胞对实体瘤的增强杀伤效果。利用纵向生物发光成像分析了不同治疗组中肿瘤大小的变化，以评估其抗肿瘤效果。研究表明，表达IL15-CCL19的EGFRvIII CAR-T细胞可以抑制肿瘤生长并抑制T细胞耗竭，从而增强其对实体瘤的杀伤效果[91]。然而，这种方法存在技术难度高、手术或成像监测成本高的问题，且建模过程较长，肿瘤生长率也存在显著差异。因此，CAR-T的体内评估最佳策略如下：首先使用异种移植模型评估CAR-T细胞的初始效果；随后使用人源化模型进一步评估其精确效果和安全性。这种策略可以在较低的模型建立成本下研究CAR-T细胞的有效性。验证后，使用人源化小鼠模型进行更深入的研究，探索CAR-T细胞的有效性、安全性、持久性和免疫重建潜力。最终，这种策略能够在临床试验前获得CAR-T细胞的全面功能评估数据。CAR-T细胞的有效性可以通过监测肿瘤体积、肿瘤分布和小鼠生存时间来确定。为了直观观察肿瘤分布，可以用荧光或生物发光标记物标记CAR-T细胞和肿瘤细胞，并使用体内成像系统（IVIS）实时监测其体内分布[92]。Su等人开发了Antares，这是一种由荧光素酶NanoLuc与橙色荧光蛋白CyOFP融合而成的生物发光报告基因。在底物氟呋喃嗪的作用下，Antares在体内对肿瘤大小的成像能力极高。Antares + 氟呋喃嗪的亮度大约是AkaLuc + AkaLumine的三倍[93]。Frose等人开发了一种基于抗原的成像方法，使用人类CD19蛋白的细胞外功能域作为PET探针。该探针可以靶向多种基于蛋白质的肿瘤抗原，如BCMA、CD22和HER2。值得注意的是，这种方法可以在不修改细胞本身的情况下对CAR-T细胞进行全身成像，并且探针在体内迅速清除，确保安全性[87]。Pfeifer等人建立了一种多模态成像方法，结合了3D微计算机断层扫描-生物发光断层扫描、光片荧光显微镜和循环免疫荧光染色。具体来说，3D μCT/BLT和LSFM可以可视化CAR-T细胞的分布和数量，而循环IF可以显示细胞因子的分布。这项技术能够全面分析CAR-T细胞的体内分布；与生物发光成像相比，它提供了3D解剖分辨率，并允许在器官水平上进行信号量化[94]。此外，肿瘤体积可以通过卡尺测量或通过MRI/CT等成像方法进行分析[95]。CAR-T对肿瘤的治疗效果应通过综合考虑肿瘤细胞分布、肿瘤体积和小鼠生存时间来评估。在小鼠肿瘤模型中，CAR-T疗法的效力和持久性也是重要的监测指标。最常用的方法是流式细胞术和qPCR。流式细胞术方法包括从外周血中提取CAR-T细胞，使用特定的流式细胞术抗体识别CAR的scFv，然后结合T细胞标记物（CD3、CD4、CD8等）进行检测。通过检测中央记忆型（Tcm，如CD62L+ CCR7+）、效应记忆型（Tem）、耗竭标记物（PD-1、LAG-3、TIM-3等），可以预测CAR-T的长期持久能力。qPCR方法涉及设计针对CAR转基因片段的特异性引物进行定量分析，从而检测CAR-T的数量。然而，qPCR有几个局限性，包括：它只能检测CAR基因的拷贝数，无法反映CAR-T细胞的活性状态；它不能反映肿瘤的动态变化；其灵敏度较低（难以检测到拷贝数少于5个的CAR-T细胞）。总体而言，这些体内模型能够多方面评估CAR-T的疗效和毒性，为临床转化铺平了道路。CAR-T细胞疗法在癌症治疗中显示出显著的效果，但也伴随着独特的安全风险，包括急性毒性（CRS、细胞因子释放综合征）、长期并发症（ICANS、神经毒性或继发性肿瘤）以及治疗失败的风险[98]。因此，系统的安全监测是确保患者安全、优化治疗策略和促进临床转化的关键步骤（图1B）。CRS是由于CAR-T过度激活引起的。CAR-T激活后，会释放大量促炎因子，如IL-6、IFN-γ和TNF-α，导致全身炎症反应[99]。对于严重的CRS，需要使用托珠单抗（一种抗白细胞介素-6受体药物）和糖皮质激素进行干预[100]。Khalafallah等人通过分析CRS患者的CAR-T细胞，确定了IL-1B、IL-15、CD276、NCR2和CCL17这五个基因是导致CRS的关键因素。CRS的严重程度可以通过测量这些细胞因子的水平来确定[101]。过度的细胞因子释放还可能引发ICANS——一种以脑血管内皮激活或神经递质紊乱为特征的情况[102]。因此，在临床前实验中，检测CRS和ICANS是评估CAR-T安全性的重要指标。CRS的主要监测指标包括小鼠体重下降、体温升高和细胞因子过度分泌。血清中的细胞因子可以通过ELISA、Luminex多因子分析仪或流式细胞术方法检测到。ICANS可以通过小鼠的行为研究初步评估，并根据CARTOX评分标准进行分类[51]。也有报道使用成像技术进行诊断，例如使用MRI评估小鼠的脑水肿严重程度[103]，以及使用PET-CT确定小鼠的异常脑代谢[104]。Sakemura等人修改了CAR-T，使其表达NIS蛋白，通过PET成像监测细胞增殖和肿瘤靶点，并预测小鼠模型中细胞数量增加和CRS发生的阶段[105]。一些分子标记物，如GFAP、Nfl、IL-1β/IL-6和CD68也可以通过ELISA测量，以确定ICANS的位置和严重程度。CAR-T功能的临床前评估是CAR-T临床转化和应用的基础，有助于加速安全有效的CAR-T进入临床试验的开发。

**CAR-T细胞的临床疗效评估**
一旦CAR-T技术的基础研究和开发完成，就需要进一步评估其临床疗效，以验证其有效性和安全性。无论是CAR-T临床试验还是商业化CAR-T产品的应用，都需要采用多维度、动态的监测策略，以评估CAR-T治疗在整个治疗过程中的疗效、持久性和安全性——这可以确保更好的治疗效果并降低相关治疗风险。

**新型CAR-T功能监测技术**
随着AI和多模态技术等新兴技术的发展，可以从形态学、激活程度、体内分布和持久性等多个维度预测CAR-T的功能，从而评估CAR-T的治疗疗效和安全性风险[180]。与单一监测技术相比，这种方法能够提供更准确和全面的CAR-T功能监测。Lee等人开发了一种由AI技术辅助的CAR-T监测方法。

**AI技术助力CAR-T监测的发展**
AI技术正在以前所未有的深度和广度推动CAR-T细胞治疗的全面监测。从体外细胞功能的高通量评估，到动物模型中的体内追踪，再到临床患者的安全警报和疗效预测，AI正在逐步将CAR-T监测从“手动经验驱动”转变为“数据智能驱动”。在前面的章节中，我们提到了AI技术在流式细胞术中的应用。

**CAR-T功能临床监测的必要性**
CAR-T治疗后的持久性、杀伤功能、体内扩增和免疫重建是相互关联的，对CAR-T治疗的有效性和临床治疗的安全管理至关重要。例如，CAR-T的体内激活强度与治疗效果呈正相关，但如果激活过快或过强，容易引发严重的毒性，并可能导致CAR-T细胞功能下降。

**挑战与前景**
尽管CAR-T治疗的功能监测技术发展迅速，但目前的监测技术仅涵盖了肿瘤杀伤、耗竭、活性、CRS、体内分布和体内药代动力学等方面。然而，CAR-T的临床前和临床监测技术仍面临多个挑战，需要在以下领域取得革命性突破。

**结论**
CAR-T疗法作为一种突破性的免疫疗法，在治疗复发性及难治性癌症方面表现出显著效果。从血液系统肿瘤靶点到实体瘤靶点的转变以及通用CAR-T的发展代表了重大进展。在CAR-T的研究和临床应用过程中，监测CAR-T的功能（如肿瘤杀伤、浸润、迁移、安全性和持久性）对于确定CAR-T是否能够有效治疗至关重要。

**作者贡献声明**
Zilin Chen：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。
Yalin Qi：撰写——初稿、可视化。
Qingpu Zhang：撰写——初稿、方法学。
Shiyu Dong：撰写——初稿、形式分析。
Yuxiang Tang：撰写——初稿、概念构思。

**未引用参考文献**
[190], [204]。

**利益冲突声明**
作者声明没有利益冲突。

**致谢**
本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：82273885）和武汉纺织大学启动资金（项目编号：245273、255072和265047）的支持。