不同糖脂比例饮食对2型糖尿病发病率的影响

《Frontiers in Endocrinology》：Effects of different sugar-lipid ratio diets on the occurrence of type 2 diabetes mellitus

　　摘要
目的：2型糖尿病（T2DM）是由于持续的能量失衡和宏量营养素失调引起的。本研究阐明了不同的饮食中糖与脂质比例如何调节T2DM的进展，并 delineated 了其潜在的分子机制。

方法：40只C57BL/6小鼠被随机分为对照组（标准饮食）和三个高能量组，这些组的糖与脂肪比例各不相同（10%脂肪/70%碳水化合物；45%脂肪/35%碳水化合物；60%脂肪/20%碳水化合物）。通过纵向监测体重和空腹血糖来评估肥胖和T2DM的发生情况。诊断后，我们分析了血清代谢谱、胰岛素抵抗、器官指数以及肝脏、胰腺和白色脂肪组织的组织病理学。采用整合蛋白质组学和非靶向代谢组学方法分析肝脏组织，以解码机制途径，并通过分子检测验证关键靶点。

结果：较高的饮食脂肪含量剂量依赖性地加速了肥胖和T2DM的发生，加剧了糖脂失调、胰岛素抵抗、肝脏脂肪变性和脂肪炎症。蛋白质组学分析显示，差异表达的蛋白质主要定位于线粒体、内质网和细胞膜，这些蛋白质在脂质、氨基酸和辅因子代谢中富集。同时，代谢组学检测到4,276种肝脏代谢物在甘油磷脂和亚油酸途径中显著富集。综合分析表明，高脂肪饮食通过诱导特定脂质代谢网络的协调紊乱来破坏全身稳态。验证结果确认这些饮食抑制了线粒体标记物（AMPK、PGC-1α、TFAM、NRF1），同时失调了脂质调节因子（PPAR-γ上调，PPAR-α下调）。

结论：高脂肪饮食比其他宏量营养素配置对代谢的损害更为严重。这种进展是由线粒体功能障碍和脂质代谢重编程的双重交互作用网络驱动的，它们共同破坏了全身代谢稳态。

1 引言
2型糖尿病（T2DM）是一种严重的非传染性疾病，对全球健康构成威胁（1）。虽然临床上以持续性高血糖定义，但T2DM越来越多地被描述为一种由慢性能量失衡和现代饮食变化引起的复杂代谢综合征（2）。因此，风险因素主要与宏量营养素的不适应有关，特别是摄入富含糖和脂肪的高能量饮食（3）。研究指出，过量摄入脂肪会加剧T2DM的风险因素，包括脂质紊乱、肥胖和高血压（3）。来自中国成年人的纵向数据证实，向高脂肪饮食的转变与肥胖、糖尿病和全因死亡率显著相关（5）。此外，高脂肪摄入直接与T2DM的发病率有关（6–8）。相反，碳水化合物摄入与T2DM的关系并非线性。尽管高糖饮食是已知的风险因素（9, 10），但碳水化合物的能量贡献与疾病发作呈U形关联；适量摄入可最小化风险，而摄入量低于或超过这一阈值会加速T2DM的发展（11）。毫无疑问，过量摄入脂肪或碳水化合物会导致正能量平衡，从而引发肥胖和T2DM等代谢病理。虽然高脂肪饮食（HFD）和高糖饮食（HSD）都与T2DM的发病机制有关，但总热量过剩通常被认为是代谢异常的主要驱动因素。然而，一个关键且未解答的问题是，高脂肪饮食是否比高糖饮食对T2DM的进展有更严重的负面影响。到目前为止，尚无共识；现有证据表明，任何一种宏量营养素的比例升高都可能导致疾病发作，但其相对影响仍需进一步明确。从机制上讲，高脂肪和高糖饮食对T2DM发病机制的不同影响根植于全身代谢分配和食欲调节。从根本上说，长期过量摄入糖和脂肪会干扰底物氧化偏好，导致异位脂肪沉积，这是胰岛素抵抗（IR）的核心驱动因素（12）。根据生理氧化层次，人类优先氧化碳水化合物；因此，增加碳水化合物摄入会刺激相应的碳水化合物氧化（4）。相比之下，过量的饮食脂肪在短期内无法促进自身氧化，导致与等热量碳水化合物摄入相比更多的脂肪积累（13）。长期来看，这种代谢僵化有利于脂肪储存（14）。此外，高脂肪摄入会影响进食中心的调节，导致慢性正能量平衡和肥胖相关的IR（15）。与碳水化合物不同，饮食脂肪因其高能量密度和低氧化率而始终与暴饮暴食相关（16）。此外，脂肪的饱腹效应较弱，进一步促进了过量能量摄入（17）。因此，高脂肪饮食模式本质上更容易引起脂肪储存和全身代谢失调，从而增加了T2DM的风险。线粒体作为中心代谢枢纽，整合葡萄糖和脂质代谢，调节肝脏脂质积累。多组学分析显示，线粒体生物生成的受损会触发协调的蛋白质组学反应，从根本上破坏脂质和糖蛋白的稳态（18）。作为线粒体生物生成的主要调节因子，过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活剂1α（PGC-1α）协调脂质代谢和IR（19, 20）。PGC-1α具有双重调节功能：它通过激活肝脏X受体α（LXRα）介导的脂肪酸合成酶（FASN）启动子来促进脂质生成（21），同时通过共激活PPAR-α和PPAR-δ来促进线粒体β-氧化（22）。强调这一机制的是，脂肪细胞中的sortilin已被证明可以上调线粒体酰基辅酶A合成酶长链家族成员1，并激活腺苷5’-单磷酸（AMP）激活的蛋白激酶（AMPK）/PGC-1α信号通路，从而缓解高脂肪饮食引起的肥胖和IR（23）。临床上，T2DM在早期主要表现为IR，随后发展为胰腺β细胞功能障碍（24）。因此，线粒体功能障碍引起的脂质代谢失调是宏量营养素过剩与T2DM之间的关键途径。

现有流行病学证据强烈表明，饮食中来自脂肪的能量比例增加与肥胖和T2DM等慢性疾病的risk密切相关。尽管高糖和高脂肪饮食都与T2DM的发病机制有关，但关于它们的相对影响的临床研究结果不一，主要是因为难以在人类群体中分离特定的糖与脂肪比例。因此，控制动物模型对于严格评估不同宏量营养素比例对疾病潜伏期和发病率的影响至关重要。从机制上讲，我们假设高脂肪饮食模式比高糖饮食更严重地导致肝脏脂肪储存。由于线粒体是处理这两种底物的核心代谢引擎，其功能障碍被认为是脂质代谢失调的起始因素。由此产生的脂毒性可能会破坏胰岛素信号传导并加剧IR，从而推动T2DM的进展。为了验证这一假设并阐明潜在的分子途径，本研究采用了整合的多组学方法。

2 方法
2.1 动物和饮食
从北京华福康生物科技有限公司获得了40只7周大的雄性C57BL/6J小鼠（20 ± 2克）。小鼠在中国医学科学院基础理论研究所的无特定病原体（SPF）设施中饲养，在受控的环境条件下（18–22°C，40–70%相对湿度，12小时光照/黑暗周期）。每笼子饲养5只小鼠，自由饮水和进食。所有实验方案均符合伦理标准，并获得了广安门医院动物护理和使用委员会的批准（伦理批准号：IACUC-GAMH-2023-025-01）。在适应期间，小鼠喂食标准维护饮食（产品编号：1016706714625204224）。随后，实验组分别接受不同宏量营养素组成的特定饮食：60%脂肪/20%碳水化合物饮食（D12492）、45%脂肪/35%碳水化合物饮食（D12491）和10%脂肪/70%碳水化合物饮食（D12450B）。详细的饮食成分和能量比例见补充表1。

2.2 实验设计
使用随机数表将小鼠随机分为四组（n = 10）：对照组（CON）喂食正常饮食，三个实验组（M10、M45、M60）分别接受10%、45%和60%脂肪含量的饮食。每周监测一次体重、体长和空腹血浆葡萄糖（FPG）。干预在12周后结束，此时实验组达到了T2DM的诊断标准。在终点时，禁食过夜的小鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠（40毫克/千克；0.4%溶液）麻醉，并通过心脏抽血处死。收集肝脏、胰腺和附睾白色脂肪组织（eWAT）并称重以计算器官指数。组织样本被分装：一部分固定在4%甲醛或电子显微镜固定剂中用于组织学分析，其余部分在干冰上快速冷冻并储存在-80°C用于组学和分子检测。

2.3 肥胖和T2DM的评估
2.3.1 Lee指数
在12周的干预期间，测量了体长（鼻到肛门）。Lee指数是肥胖的指标（25），计算公式为：体重（克）^(1/3)/体长（厘米）。
2.3.2 肥胖发生率
每周测量一次体重。肥胖定义为单位体重超过正常对照组平均值20%以上。发生率为（肥胖小鼠/总小鼠数）× 100%。
2.3.3 T2DM发生率
每周测量一次空腹血糖（FBG）。T2DM的发生率定义为连续两次测量中FBG超过11.1 mmol/L。发生率为（糖尿病小鼠/总小鼠数）× 100%。
2.4 口服葡萄糖耐量测试
在12周的饮食干预后，小鼠进行了口服葡萄糖耐量测试（OGTT）。在6小时的光照阶段禁食后，记录基线葡萄糖水平，然后通过口服灌胃给予2克/千克的葡萄糖负荷。使用ACCU-CHEK血糖仪（Roche，瑞士巴塞尔；先前验证的线性范围：4–25 mmol/L）在给药后30、60、90和120分钟监测血糖浓度（24）。根据以下公式计算葡萄糖曲线的下面积（AUC）：
AUC = 0.5 × (BG0 + BG30)/2 + 0.5 × (BG30 + BG60)/2 + 1 × (BG60 + BG120)/2，
其中BG表示指定时间点的血糖（mmol/L）。
2.5 生化检测
使用全自动生化分析仪（东芝全自动生化分析仪，日本；Beckman AU5800自动化学发光分析仪）分析每组小鼠的血清样本。测量的具体生化参数包括胆固醇（CHO）、甘油三酯（TGs）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和LDL-C、糖化血清蛋白（GSP）。
使用以下公式计算甘油三酯葡萄糖指数（TyG）：TyG = ln[空腹TG（mg/dL）× FBG（mg/dL）/2]。
2.6 酶联免疫吸附测定
使用ELISA检测血清中的空腹胰岛素（FINS）、炎症细胞因子和脂肪因子水平。FINS使用商业胰岛素检测试剂盒（EMINS；Thermo Fisher Scientific，美国）进行定量。使用相应的ELISA试剂盒（NeoBioscience，中国用于TNF-α和IL-1β；Elabscience，中国用于IL-6）测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α；EMC102a）、白细胞介素-1β（IL-1β；EMC001b）和白细胞介素-6（IL-6；E-EL-M004）的浓度。此外，还使用各自的ELISA试剂盒分析血清中的脂联素（ED295；Lianke Bio，中国）和瘦素（EK-297；Lianke Bio，中国）的水平。所有程序均严格按照制造商的说明进行，以确保一致性和准确性。
此外，还计算了胰岛素抵抗（HOMA-IR）和β细胞功能（HOMA-β）的稳态模型：HOMA-IR = [FBG（mmol/L）× FINS（μU/mL）]/22.5，HOMA-β = [20 × FINS（μU/mL）]/[FBG（mmol/L）? 3.5]。
2.7 组织病理学形态
2.7.1 苏木精和伊红染色
将肝脏、胰腺和脂肪组织标本固定在4%中性缓冲甲醛中24小时，脱水、透明处理后嵌入石蜡。连续切片（3–5微米厚）脱蜡、复水，然后进行苏木精和伊红（H&E）染色。流程包括苏木精染色（3–5分钟），1%酸酒精中的短暂分化，然后用0.5–1%伊红复染（1–3分钟）。逐步脱水和透明处理后，将切片安装在中性介质中。通过显微镜检查评估组织形态，所有程序均重复三次。
2.7.2 Oil Red O染色
将肝脏和脂肪组织的冷冻切片风干并固定15分钟。在使用前过滤油红O工作溶液（饱和储备液：蒸馏水，6:4；在4°C下过夜孵育）。在暗处对切片进行染色（8–10分钟），依次在60%异丙醇中分化（3秒和5秒），然后清洗。核复染使用苏木精（3–5分钟），之后进行分化并染色。将切片安装在甘油明胶中并在显微镜下观察，所有程序均重复三次。
2.8 肝脏组织的蛋白质组学分析
蛋白质组学分析由上海Majorbio Bio-Pharm Technology有限公司进行。使用裂解缓冲液（8 M尿素，1% SDS，蛋白酶抑制剂）提取总肝脏蛋白，并通过BCA测定法进行定量。消化过程中，蛋白质用TCEP还原，用碘乙酰胺烷基化，然后用胰蛋白酶过夜消化。脱盐和定量后，肽在Vanquish Neo UPLC系统上使用数据独立采集（DIA）与Orbitrap Astral质谱仪（Thermo Scientific）结合进行分析。分离是在μPAC柱上进行的，使用8分钟的梯度程序，数据是在正离子模式下获取的（m/z 100–1700）。原始DIA数据使用Spectronaut?（版本19）软件根据UniProt Mus musculus数据库进行处理。差异表达蛋白（DEPs）是根据变化倍数（FC）> 2和P < 0.05（学生t检验）来识别的。功能分析，包括基因本体（GO）注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集，是使用Majorbio Cloud Platform（https://cloud.majorbio.com/）进行的。2.9 肝脏组织的代谢组学分析代谢组学分析由上海Majorbio生物制药技术有限公司进行。肝脏组织（50毫克）用含有内标物的400微升冷溶剂（乙腈：甲醇：水，2:2:1，v/v/v）提取。经过匀浆、超声处理（冰水浴）和离心（13,000×g，15分钟，4°C）后，上清液在氮气下蒸发，并用120微升乙腈：水（1:1，v/v）复溶。质量控制（QC）样品是通过合并所有样品的等量部分制备的。LC-MS/MS分析是在Vanquish UPLC系统（Thermo Fisher Scientific）上进行的，该系统与TripleTOF 6600（SCIEX）耦合。分离使用HSS T3柱（100毫米×2.1毫米，1.8微米）在40°C下进行，流速为0.40毫升/分钟。流动相由水中的0.1%甲酸（A）和乙腈：异丙醇中的0.1%甲酸（1:1）（B）组成，梯度时间为16分钟。MS数据是在正离子和负离子模式下获取的（扫描范围m/z 50–1000）。原始数据使用Progenesis QI软件进行基线校正、对齐和积分处理。代谢物通过HMDB和METLIN数据库进行鉴定。多元分析（OPLS-DA）用于筛选差异代谢物，依据变量重要性（VIP）≥ 1.0、FC > 1和P < 0.05（学生t检验）进行。通路富集是使用KEGG数据库评估的。2.10 免疫组化染色肝切片经过脱蜡、重新水化并进行了抗原回收。内源性过氧化物酶活性用3% H2O2淬灭。在血清阻断后，切片在4°C下与针对NRF1（83092-1-RR）、PPARγ（66936-1-Ig）、PGC-1α（66369-1-Ig）、PPARα（66826-1-Ig）和TFAM（22586-1-AP）的一抗孵育过夜——这些抗体均来自Proteintech——以及β-actin（TDY041；TDY，中国）。随后，切片与HRP标记的二抗孵育（50分钟，室温）。免疫反应通过二氨基苯胺（DAB）可视化，显微镜确认反应结束后终止。切片用苏木精复染，脱水，清漂，然后装片以备显微镜分析。2.11 定量实时PCR总RNA使用RNAisoPlus试剂（15596026CN；Invitrogen，美国）从肝脏组织中提取，并使用HiFiScript cDNA合成试剂盒（CW2569；CWBIO，中国）逆转录成cDNA。定量PCR使用UltraSYBR混合物（CW2602；CWBIO，中国）在StepOne Plus系统（Applied Biosystems，美国）上进行。相对mRNA表达水平根据β-actin进行标准化，并使用2?ΔΔCT方法计算。引物序列列在补充表2中。2.12 统计分析统计分析使用GraphPad Prism（版本10.4.0）进行，数据表示为平均值±标准差（SD）。正态性通过Shapiro–Wilk检验验证。两组之间的比较使用非配对学生t检验进行，多组比较使用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey的后续检验。肥胖和T2DM的累积发病率使用Kaplan–Meier生存分析和对数等级检验进行评估。P值< 0.05被认为是统计学上显著的。所有实验至少独立重复三次。3 结果3.1 高脂肪饮食加速了小鼠肥胖和T2DM事件的发生与CON组保持基线轨迹不同，喂食实验饮食的小鼠表现出显著的体重增加。在12周的时间点，M60组的形态学参数——包括体重、体重增加率和Lee指数——显著高于M45组和M10组，表明与饮食中的脂肪含量成正比。肥胖事件的时间过程分析显示了不同的发生潜伏期：M60组在第2周（P < 0.01）、M45组在第6周、M10组在第8周开始出现显著的体重差异。尽管M10组的体重增加量大于CON组，但其肥胖发生率仅为0%，表明与M60组的快速肥胖诱导相比有较长的潜伏期（图1B–G）。图1在喂食不同碳水化合物-脂肪比例饮食的小鼠中观察到了肥胖和T2DM。（A）实验流程。（B）喂食不同饮食后不同时间点的小鼠体重变化趋势。（C）各组小鼠的代表性外观图像。（D）各组小鼠肥胖事件发生的Kaplan-Meier图（n = 10）。（E）干预12周后各组小鼠的体重（n = 8）。（F）各组小鼠的体重变化率（n = 8）。（G）干预12周后各组小鼠的Lee指数（n = 8）。（H）各组小鼠T2DM事件的Kaplan-Meier图（n = 10）。（I）各组小鼠空腹血糖水平的变化趋势（n = 8）。（J）干预12周后不同饮食组的空腹血糖水平（n = 8）。（K, L）各组的口服葡萄糖耐量测试曲线和曲线下面积（AUC）（n = 6）。（M）12周干预期间各组小鼠糖化血清蛋白的水平（n = 6）。在统计分析中，所有值表示为平均值±标准差（SD）。*表示模型组与对照组之间的统计学差异，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。关于葡萄糖稳态，高脂肪饮食相对于CON组的稳定正常血糖水平诱导了显著的高血糖。到第6周时，所有模型组的FBG都升高。到12周的时间点，M60组的FBG和GSP水平最高，这与饮食中的脂肪摄入量呈正相关。OGTT证实了这一趋势，其AUC值随脂肪含量的增加而显著增加（M60 > M45 > M10 > CON），反映了不同程度的葡萄糖不耐受。生存分析进一步表明，M60饮食导致T2DM的发作更早，并且累积发病率显著高于中等和低脂肪组（图1H–M）。3.2 高脂肪饮食加剧了小鼠的胰岛素抵抗和代谢紊乱到第12周时，M60组和M45组的FINS和HOMA-IR水平显著高于对照组（P < 0.05），按照严重程度排序为M60 > M45。尽管M10组在这些标志物上显示出非显著的上升趋势，但总体模式表明各干预组之间的胰岛素抵抗程度不同。类似地，作为胰岛素抵抗替代标志物的TyG指数随饮食中的脂肪含量增加而增加，M60组和M45组观察到显著升高（P < 0.05；图2A–C）。图2喂食不同碳水化合物-脂肪比例饮食的小鼠的胰岛素抵抗和代谢特征。（A）小鼠的空腹血清胰岛素水平（FINS）（n = 6）。（B）小鼠的稳态模型评估-胰岛素抵抗（HOMA-IR）（n = 6）。（C）小鼠的甘油三酯（TyG）指数（n = 6）。（D–G）小鼠的血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平（n = 6）。（H）小鼠的血清脂联素水平（n = 6）。（I）小鼠的血清瘦素水平（n = 6）。（J）小鼠的血清TNF-α水平（n = 6）。（K）小鼠的血清IL-1β水平（n = 6）。（L）小鼠的血清IL-6水平（n = 6）。在统计分析中，所有值表示为平均值±标准差（SD）。*表示模型组与对照组之间的统计学差异，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。所有干预组都出现了血脂异常，其特征是血清TG、TC和LDL-C水平显著升高（图2D–G）。血脂升高的幅度与饮食中的脂肪百分比成正相关（M60 > M45 > M10）。尽管HDL-C水平也随着脂肪摄入量的增加而上升，但这种矛盾的升高与高脂肪饮食模型一致，可能并不表明在广泛的代谢功能障碍背景下有改善的心血管保护作用。饮食干预破坏了脂肪因子的稳态并引发了系统性炎症。脂联素水平与饮食中的脂肪含量呈负相关，从CON组的基线显著下降到M60组。相反，瘦素水平呈剂量依赖性增加。促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）在所有模型组中都升高（M60 > M45 > M10），证实了高脂肪-碳水化合物比例的饮食加剧了慢性低度炎症和脂肪细胞功能障碍（图2H–L）。3.3 高脂肪饮食在不同程度上诱导了小鼠的脂质沉积，主要集中在肝脏高脂肪饮食导致了显著的肝肿大和内脏脂肪堆积。肝脏湿重与饮食中的脂肪含量成正比增加（P < 0.05），表明对脂质过载的反应是代偿性的肥大或增生。肉眼检查显示，CON组的肝脏保持光滑的红棕色外观和正常的弹性，而实验组则表现出逐渐的苍白和颗粒状的脂肪变性——尤其是在M60组。同样，内脏脂肪积累和脂肪指数也以剂量依赖的方式显著升高（图3A–F）。图3不同碳水化合物-脂肪比例饮食下组织和器官的形态学特征。（A）各组小鼠的肝脏指数。（B）各组小鼠的肝脏湿重。（C）各组小鼠的代表性肝脏图像。（D）各组小鼠的脂肪指数。（E）各组小鼠的脂肪湿重。（F）各组小鼠的代表性脂肪图像。（G）肝脏、胰腺和脂肪组织的H&E染色（40×，比例尺：100μm）。（H）肝脏和胰腺的Oil Red染色（40×，比例尺：100μm）。数据表示为平均值±标准差，n = 6。H&E染色证实了宏观发现。对照组肝脏显示完整的肝小叶结构，没有脂肪沉积。相比之下，M60、M45和M10组表现出不同程度的肝脂肪变性、肝细胞膨胀和坏死。脂肪组织分析显示炎症细胞浸润的梯度（M60 > M45 > M10 > CON），表明脂肪细胞功能障碍严重。胰腺组织在所有组中仅显示出轻微的、不显著的病变（图3G）。Oil Red O染色进一步量化了脂质负担：肝脏的脂质积累是剂量依赖的，并且明显比胰腺中的沉积更严重，表明肝脏是这种模型中异位脂肪储存的主要部位（图3H）。3.4 蛋白质组学分析识别了高脂肪饮食激活的小鼠肝脏蛋白质和通路基于病理发现（第3.1–3.3节），表明肝脏是饮食诱导的代谢功能障碍的主要靶器官——特别是在M60组中肥胖和T2DM的快速发生——对肝脏组织进行了高通量蛋白质组学分析。目的是识别特定于高脂肪表型的分子特征并探索潜在的病理通路。主成分分析（PCA）显示重复样本内部聚类紧密，表明高重现性。值得注意的是，M45组在M10和M60组之间处于中间位置，而CON组形成了一个与所有模型组分离的独特簇，反映了体内观察到的渐进性表型严重程度（图4A）。图4蛋白质组学分析。（A）PCA分析图。（B）各模型组的DEPs条形图。（C）各模型组的DEPs文氏图。（D-F）各模型组的DEPs火山图。（G）DEPs的Reactome注释分析。（H）DEPs的亚细胞分布。（I）DEPs的GO分析。（J）DEPs的KEGG通路注释。DEPs根据严格的标准（FC > 2，P < 0.05）定义。比较分析揭示了一组在所有干预组中都发生调节的447个蛋白质。然而，为了分离导致M60组病理加速的具体因素，我们专注于该组独有的602个DEPs（图4D–F）。这种策略允许专门探索仅由高脂肪摄入激活的生物通路，而不考虑M10和M45组中观察到的中度变化。对M60组中特定DEPs的Reactome通路分析确定代谢是富集最显著的类别，其次是脂质代谢、蛋白质代谢、免疫系统和信号转导（图4G）。亚细胞定位预测显示这些独特DEPs主要定位于细胞质、细胞核和线粒体，这与它们的代谢和调节作用一致（图4H）。GO分析突出了前20个富集术语中的关键功能簇（图4I）。生物过程（BP）集中在对外来刺激的反应、过氧化物酶体组织、激素响应和抗原处理上。细胞组分（CC）在过氧化物酶体和微体结构以及MHC I类肽装载复合体中富集。分子功能（MF）主要涉及转运活性和肽抗原结合。此外，KEGG通路分析（图4J）发现广泛的代谢途径显著富集，包括不饱和脂肪酸生物合成、胆汁分泌、类固醇激素合成和硫胺素代谢。与细胞死亡（凋亡、坏死性凋亡）、内分泌功能（胰岛素分泌、脂肪分解调节）以及糖尿病相关信号传导（1型糖尿病）相关的关键调控途径也有明显体现。3.5 代谢组学分析确定了小鼠在高脂肪饮食下激活的肝代谢物和代谢途径。代谢组学关注生物层次结构（从细胞到生物系统）中动态代谢物变化的定量分析，以系统地阐明生物体内的生化调控网络（26）。高通量技术的进步使研究人员能够快速大规模分析循环代谢物。通过同时进行低分子量物质（如糖类、有机酸、脂类、氨基酸和芳香烃）的定性和定量分析，可以识别特定的差异靶标。2型糖尿病特别适合进行此类代谢组学研究，因为它是一种由多种代谢因素驱动的复杂疾病，并受到饮食和体育锻炼等生理变化的影响（27）。在这项研究中，我们利用小鼠的肝脏组织样本观察饮食干预下的代谢特征，旨在识别具有组特异性的差异代谢物。具体而言，M60组特有的代谢物接受了生物信息学分析，以探索可能促进2型糖尿病发生的生物途径。PCA分析显示CON组与其他三个模型组有明显的分离。尽管模型组之间存在一些交集，但分离趋势清晰可见，且各组之间及组内的变化程度都很显著（图5A）。为了识别共同的和独特的代谢差异，进行了Venn分析。Venn图（图5C）显示了三个模型组之间的差异代谢物的交集。发现144种差异代谢物在M60、M45和M10组中共有，而63种代谢物是M60组独有的。因此，我们将这63种独特代谢物指定为后续分析的目标集。

图5 代谢组学分析。(A) PCA分析图。(B) PLS-DA分析图。(C) 每个模型组中差异代谢物（DEMs）的Venn图。(D-F) 每个模型组中差异代谢物的火山图。(G) KEGG富集分析。(H) 差异代谢物的KEGG直方图。差异表达代谢物（DEMs）是通过OPLS-DA的变量重要性（VIP）值（或在OPLS-DA过拟合情况下使用PLS-DA）结合单变量分析的FC和p值来鉴定的。筛选标准如下：(1) OPLS-DA VIP ≥ 1，表示代谢物对组分类的区分贡献；(2) FC > 1，表明对照组和实验组之间存在定量差异；(3) P < 0.05。使用这些阈值，共分析了4276种肝代谢物。在M60组中，检测到288种DEMs，包括91种上调和197种下调的物种。结果中突出显示了前五种DEMs：Brassinolide、Chenodeoxycholyltryptophan、Gamma-Glutamyl-beta-cyanoalanine、4-acetoxy det 和 4alpha-formy-5alpha-cholesta-8,24-dien-3beta-ol（图5D-F）。随后，对差异代谢物集进行了KEGG富集和功能通路分析。主要富集的通路包括甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、甘油酯代谢、mTOR信号通路、癌症中的胆碱代谢、组氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、色氨酸代谢、精氨酸生物合成、缬氨酸和异亮氨酸生物合成、β-丙氨酸代谢、戊糖磷酸途径、缬氨酸和异亮氨酸的降解、α-亚麻酸代谢以及蛋白质消化和吸收。根据KEGG拓扑分析，排名前五的通路是甘油磷脂代谢、组氨酸代谢、甘油酯代谢、色氨酸代谢和半胱氨酸和甲硫氨酸代谢（图5G）。识别和表征这些代谢改变对我们分析至关重要，因为关键代谢物通常与功能变化相关。我们的KEGG功能通路分析显示，高脂肪饮食（HFD）扰乱了涉及脂质、氨基酸、碳水化合物、核苷酸和辅因子/维生素代谢的肝脏过程，从而影响消化系统和神经系统。同时，环境信息处理机制（如信号转导和跨膜运输）也被发现受到干扰（图5H）。

3.6 综合蛋白质组学和代谢组学揭示了与高脂肪饮食诱导的2型糖尿病相关的通路。对差异数据集的初步筛选发现了282个DEPs和32个DEMs。这种差异表明HFD引发了广泛的蛋白质组学改变，而代谢变化则更加集中。为了研究这些组学层面之间的相互作用，我们使用了O2PLS模型将数据集投影到一个共同的子空间中。所得的负荷图显示了一个明显的分布：大多数蛋白质（蓝色）聚集在原点附近，而代谢物（绿色）和特定部分的蛋白质分散在外围。这种配置表明，代谢改变并非孤立发生，而是与特定的蛋白质组学变化紧密耦合。O2PLS模型特征的定量排名（图6D）列出了贡献最大的前15-20个主成分（pq (1)）。值得注意的是，尿胆素和几种脂肪酸衍生物——特别是GPCho (18:1/20:4) 和 Ethyl 3-hydroxydodecanoate——被确定为主要的代谢驱动因素。同时，某些蛋白质（例如Q92...）因与这些代谢变化强烈相关而被突出显示。为了可视化这些相互作用，构建了一个弦图/相关性网络，将代谢物（橙色/棕色节点）与蛋白质（蓝绿色节点）连接起来，粉色和灰色线条分别代表正相关和负相关。在这个网络中，关键的脂质如Pe(p - 16:0/9:0)（一种磷脂）和GPCho (18:1/20:4)（含有脂肪酰链）尤为突出。这些脂质与特定蛋白质表达之间的关联表明，脂质代谢的紊乱与这些蛋白质组学变化密切相关。此外，联合KEGG通路富集分析显示“甘油磷脂代谢”和“ABC转运蛋白”共富集。总体而言，这些发现表明HFD通过特定脂质代谢途径中的蛋白质和代谢物的协同扰动破坏了系统的稳态。

图6 综合多组学分析。(A) DEMs和DEPs的Venn图。(B) 蛋白质组和代谢组的O2PLS模型负荷图。(C) 差异蛋白质/代谢物相关性网络图。(D) 差异蛋白质和差异代谢物负荷柱状图。(E) 蛋白质/代谢物差异最大的前10条通路。

3.7 关于不同葡萄糖-脂质比例饮食对小鼠2型糖尿病发病机制的影响的研究。先前的研究已经描述了不同糖-脂质比例饮食对2型糖尿病病理的影响，而高通量蛋白质组学和代谢组学则描绘了驱动疾病发生的通路。我们的结果表明，差异代谢物在脂质代谢中显著富集，脂质和类脂质分子主导了高脂肪饮食引起的代谢重编程。同时，差异蛋白质与这些脂质通路密切相关，显示出细胞内定位模式，表明脂质稳态的调节涉及线粒体和多细胞器的协调。整合这些表型和组学数据，我们验证了线粒体功能和脂质调节中的关键靶点。这证实了线粒体功能障碍和脂质代谢紊乱的耦合通路构成了高脂肪比例饮食加速2型糖尿病发病的独特生物学机制。因此，未来的干预策略应同时针对线粒体完整性和脂质稳态，以有效预防2型糖尿病。为了在转录水平上验证这些发现，采用了qRT-PCR来量化肝脏组织中的线粒体生物发生相关mRNA表达。结果（图7A）显示，与CON组相比，M10、M45和M60组的TFAM、PGC-1α、NRF1和AMPK的表达水平显著降低。值得注意的是，这种下调呈剂量依赖性趋势，随着饮食脂肪含量的增加而加剧（从M10到M60）。具体而言，M60处理显著抑制了线粒体生物发生基因（P < 0.05）。免疫组化进一步验证了这些线粒体代谢蛋白的关键作用。与mRNA数据一致，所有模型组的PGC-1α、NRF1和TFAM的蛋白质表达水平均低于对照组，表现为棕色-黄色染色强度减弱和H-Score降低。此外，蛋白质表达的降低随着饮食脂肪含量的增加而逐渐加深（从M10到M45再到M60）（图7C），证实了在高脂肪条件下的线粒体生物发生的抑制。

图7 不同糖-脂肪比例饮食组中线粒体功能和脂质代谢稳态相关分子蛋白和RNA的表达。（A、B）关键线粒体功能和脂质代谢基因的mRNA水平。（C）肝脏组织中的免疫组化病理图像。（D-H）肝脏组织中的免疫组化阳性区域H-Scores。* 与CON组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。H-score：指的是组织化学得分，数值越大，表示阳性强度在深度和数量上的综合优势越强。

图7B展示了不同饮食组（CON、M10、M45、M60）中参与脂肪酸代谢（FASN、ACC）和核受体（PPAR-α/γ）的mRNA表达谱。FASN表达表现出不同模式：在M60组显著上调，而M10和M45组呈现下降趋势。相反，ACC表达随饮食脂肪含量的增加而逐渐上升。关于核受体，PPAR-α的表达在所有模型组中均呈下降趋势，M60组的表达显著低于CON组。PPAR-γ的表达更为复杂：在M10组显著降低，但在M45组转为上升趋势，并在M60组达到显著增加。为了验证这些转录变化，使用免疫组化评估了喂食不同糖-脂质比例饮食的小鼠中PPAR-α和PPAR-γ的蛋白质表达。结果表明，PPAR-α蛋白水平从M10组到M45组再到M60组逐渐下降。相比之下，PPAR-γ蛋白表达呈现相反的趋势，在M60组达到峰值。值得注意的是，M45组和M60组之间的PPAR-γ表达差异具有统计学意义（图7）。

4 讨论 在构建实验模型时，选择了C57BL/6J小鼠品系，因为它对饮食诱导的肥胖具有众所周知的敏感性。虽然其他常见品系，如Kunming、ICR和BALB/c小鼠也对高脂肪饮食（HFD）有类似的反应（28），但C57BL/6J仍然是代谢研究的标准品系。相反，ob/ob小鼠被排除在外，因为其肥胖是由瘦素基因突变引起的暴食症，这无法再现由糖-脂肪饮食驱动的正常葡萄糖耐受性向高血糖的自然病理生理进展（29）。我们的饮食设计的理由有两个方面，即结合严格的初步筛选与建立的模型标准化。最初，一项初步研究筛选了五个能量密度梯度（从10%到70%脂肪），以绘制对不同糖-脂质比例的表型反应。根据这些初步发现，我们策略性地关注了三个与标准化配方一致的比率。具体来说，选择60%脂肪饮食来代表经典的脂毒性驱动的HFD模型，而45%脂肪饮食作为标准的高脂肪高糖（西方饮食）模型。这种方法有助于全面分析饮食结构如何持续影响代谢表型并驱动特定的分子机制，包括我们在组学谱中观察到的线粒体脂质重塑。干预不同糖-脂质饮食发现，糖尿病前期明显滞后于肥胖表型。具体来说，虽然体重差异在早期（高脂肪M60组的第2周）就开始了，但血糖差异直到第6周才显现。与传统的HFD模型不同，我们系统地表征了代谢紊乱的时间出现。12周的终点基于M60组设定，此时2型糖尿病的发病率达到了90%。在这一阶段，M45组主要表现为葡萄糖耐受性受损（只有30%的2型糖尿病发病率），而M10组保持了正常的葡萄糖水平，这表明饮食脂肪含量超过45%是FBG紊乱的关键阈值。体重轨迹进一步证实了时间依赖性的加速：M60组在第2周就与CON组有显著差异（P < 0.01），而M45和M10组分别延迟到第6周和第8周。总体而言，这些数据表明饮食脂肪比例控制了肥胖和2型糖尿病发病的幅度（剂量依赖性）和速度（时间加速）。在糖-脂质饮食干预后，所有模型组的脂质谱都发生了显著变化，表现为TG、TC、LDL-C和HDL-C的普遍增加。尽管HDL-C传统上被认为是“好胆固醇”，但其升高可能反映了饱和脂肪酸摄入量的增加（30）和疾病相关的重塑。已知病理状态如2型糖尿病会改变HDL颗粒的蛋白质组和代谢组组成，从而损害其功能完整性（31）。与胰岛素抵抗（IR）作为肥胖和2型糖尿病（T2DM）共同机制的作用一致，HOMA-IR和TyG指数——作为IR的公认替代标志物（32）——显示出明显趋势：HOMA-IR随着膳食脂肪含量的增加而逐步升高，而TyG指数与脂肪能量比呈正相关。这些发现证实了脂毒性在扩大IR中的作用（33）。同时，脂联素失调也很明显。所有实验组中的脂联素水平均下降，这可能削弱了其对脂肪酸氧化的刺激作用，并加剧了异位脂质沉积——这是T2DM风险的关键因素（34, 35）。相反，通常通过抑制食欲产生途径和刺激食欲抑制途径来调节体重的瘦素，在M60组中显著升高至1898 ng/mL（对照组为691.3 ng/mL），表明瘦素抵抗性的出现，其特征是瘦素血症（37）。此外，饮食习惯引发了全身性的炎症级联反应，表现为TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高。然而，与线性代谢变化不同，炎症并不严格依赖于脂肪能量比；尽管M60组的表达最高，但M10组和M45组的表达相当，这表明即使是中等程度的糖脂比例差异也足以激活炎症信号通路。

作为代谢的中心枢纽，肝脏在本研究中对脂质过载表现出高度敏感性。H&E染色显示了病理变化的梯度，包括肝脂肪变性、肝细胞坏死、气球样变和炎症细胞浸润，这些变化以剂量依赖的方式加剧（M60 > M45 > M10）。相应地，脂质染色的面积和强度也随着膳食脂肪能量比的增加而增加。相比之下，脂肪组织主要表现为巨噬细胞浸润，而没有严重的结构崩溃，而所有实验组的胰腺组织基本上没有与对照组无法区分的严重病变。这些观察结果表明，在不同的糖脂比例饮食下，肝脏是受影响最严重的器官。这种敏感性可能归因于解剖学和生理学因素。从解剖学上看，与骨骼肌（负责葡萄糖摄取）或脂肪组织（储存脂质）不同，肝脏直接通过门静脉从肠道接收富含营养的血液，从而比外周器官更早地暴露于高浓度的游离脂肪酸（FFA）和葡萄糖（38）。此外，肝脏在能量平衡中起着关键的调节作用；在处理过量底物时，它可能会释放信号分子如FGF21，这可以在脂肪组织中诱导脂解，但悖论地加剧了脂毒性（39）。最后，根据溢出假说，当膳食脂肪超过脂肪组织的储存阈值时，脂质会溢出到肝脏，触发非酒精性脂肪肝疾病，而其他器官如胰腺可能在后期才会受到脂毒性的影响（40）。总体而言，这些机制使得肝脏在糖脂饮食干预下特别容易在早期出现病变。

基于对喂食不同糖脂比例的小鼠的表型观察，本研究表征了M60高脂肪饮食组的蛋白质组学特征。在排除了与M10、M45和对照组共享的蛋白质后，分离出了独特的M60蛋白质组学特征进行功能研究。整合的GO注释和富集分析显示，这些靶蛋白主要参与代谢物和离子的跨膜转运。值得注意的是，ATP依赖性活性（如ATP酶）的富集表明能量代谢发生改变；这种ATP合成的受损可能破坏离子泵的功能，导致钙或FFA的积累以及随后的线粒体功能障碍（41）。与之一致，KEGG和Reactome通路分析强调了代谢调节的显著富集，特别是脂质代谢（包括不饱和脂肪酸生物合成、脂肪细胞脂解和固醇激素合成）、氨基酸代谢（丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸）以及辅因子/维生素处理（如硫胺素和视黄醇）。

蛋白质组学数据进一步提示了线粒体应激的机制。已知过多的脂肪酸流入线粒体进行氧化会生成高水平的活性氧，导致细胞色素c的释放和细胞凋亡（42）。此外，线粒体与脂滴之间的物理接触对于脂肪酸转移和β-氧化至关重要。在高脂肪环境中，已报道脂质代谢物的积累会诱导Mfn2的K243特异性乙酰化和泛素-蛋白酶体降解；这种Mfn2-Hsc70介导的接触的破坏会阻断脂肪酸氧化，从而引发脂毒性（43）。亚细胞定位分析表明，M60组中差异表达的蛋白质主要位于线粒体、内质网（ER）和细胞膜中。线粒体作为能量转换、脂肪酸氧化和钙稳态的中心枢纽，对于细胞器间的相互作用至关重要。特别是，线粒体-ER界面在脂肪合成和钙平衡中起着关键作用，这种相互作用在肥胖和代谢性胰岛素抵抗的组织（如肝脏和肌肉）中经常发生改变（44）。总体而言，这些蛋白质组学特征强调了线粒体在多细胞器调节脂质代谢中的核心协调作用。

整合的代谢组学和生物信息学分析揭示了喂食不同糖脂比例的小鼠与对照组相比的独特肝脏特征。代谢变异主要由Brassinolide、4α-formyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol和Doxercalciferol驱动。Brassinolide是一种油菜素类植物激素，已知调节植物糖代谢和光合作用积累（45, 46），其存在与脂肪酸积累和相关基因表达谱相关（47）。同样，4α-formyl-5α-cholesta-8,24-dien-3β-ol的检测表明胆固醇生物合成受到干扰。这个4α-formyl结构类似固醇中间体，可能代表一个未完全脱甲基的副产物或组织特异性代谢物（48, 49），可能增强核受体结合以调节脂质或炎症反应。此外，Doxercalciferol（1α-羟基维生素D2），一种合成类固醇衍生物和维生素D受体激动剂，也发生了显著变化；其活性依赖于肝脏的羟基化，并参与肾脏脂质代谢的调节（50）。

在网络层面，KEGG富集分析显示M60组的脂质和氨基酸代谢发生了显著变化。甘油磷脂和甘油脂质途径的共富集表明肝细胞膜磷脂发生了广泛的重塑（51）。由于甘油磷脂对线粒体膜完整性至关重要，它们的代谢紊乱直接破坏了电子传递链（52）。同时，组氨酸/天冬氨酸代谢与mTOR信号通路的对齐反映了氨基酸感知的破坏。失调的mTORC1信号可能通过S6K和4E-BP磷酸化驱动无差别的蛋白质和脂质合成，同时抑制线粒体自噬；这种无法清除受损线粒体的失败可能加剧了高脂肪/高糖饮食引起的代谢负担（53）。整合的蛋白质组学和代谢组学分析揭示了在高脂饮食条件下肝脏景观的同步失调。这项多组学分析表明，膳食脂质过载不仅引发了广泛的蛋白质组重编程，还导致了特定的脂质组失衡，主要影响甘油磷脂代谢和ABC转运蛋白通路。亚细胞定位数据也证实了这些紊乱主要是由线粒体功能障碍驱动的。具体来说，我们观察到脂肪酸衍生物（包括Pe(p-16:0/9:0)和GPCho (18:1/20:4)的显著变化。由于磷脂乙醇胺（PE）对膜负曲率和嵴结构至关重要，PE组成的变化表明线粒体结构完整性受损（54）。同时，GPCho (18:1/20:4)的变化——一种富含花生四烯酸（20:4）的磷脂酰胆碱种类——导致PC/PE比例失调，这是肥胖和糖尿病常见的线粒体功能障碍标志（55）。此外，代谢停滞表现为3-羟基十二烷酸的积累。这种3-羟基脂肪酸衍生物的积累表明β-氧化通量存在瓶颈，其中底物过载超过了线粒体的氧化能力，阻止了中间体的完全硫解（56）。总体而言，这些组学特征表明线粒体功能障碍，表现为结构脆弱性和氧化效率低下，驱动了脂毒性和氧化应激。这种细胞代谢灵活性的丧失为胰岛素抵抗的起始和T2DM的进展提供了分子基础。

本研究系统地描述了膳食糖脂比例对T2DM进展的影响，确定了线粒体功能-脂质代谢调节网络中的关键破坏。我们的数据显示，高脂肪饮食——特别是在M60组（>60%脂肪）——通过抑制AMPK-PGC-1α信号轴显著加速了代谢紊乱。具体来说，我们观察到所有高脂肪组中线粒体质量控制基因（AMPK、PGC-1α、TFAM、NRF1）的普遍下调。作为主要的能量传感器（57, 58），AMPK通常在Ser568位点磷酸化PGC-1α以启动转录能力（59）。这一轴的抑制破坏了PGC-1α的功能，后者是高能量组织中线粒体生物生成和功能的核心协调者（60）。因此，NRF1/2和TFAM的下游激活受到抑制，损害了线粒体DNA复制和质量控制（61, 62）。这种转录沉默反映了非酒精性脂肪肝疾病和T2DM患者中观察到的肝脏PGC-1α水平的降低，将线粒体下降与IR联系起来（64）。此外，PGC-1α的损伤通过未能共同激活PPARα而直接破坏了脂质代谢网络（63）。我们的结果展示了所有高脂肪组中PPAR-γ/α轴的失衡，表现为PPAR-γ水平升高而PPAR-α水平降低。这种分子变化表明双重失败：下调的PPAR-α降低了线粒体的β-氧化能力，而异常激活的PPAR-γ促进了脂肪生成而不是脂解（65, 66）。由此产生的脂质过载与胰岛素信号通路相互作用，引发脂毒性和全身性IR（67）。反过来，IR加剧了游离脂肪酸的释放，积累了有毒代谢物（68），并持续了一个有害的代谢恶化反馈循环。

我们认识到当前研究中的几个重要限制。首先，尽管统计分析确证在干预期间各饮食组之间的平均食物摄入量没有显著差异——有效地排除了饮食可口性引起的热量消耗差异作为我们代谢表型分析的主要混淆因素——但我们认识到记录频率不足以在结果部分提供详细的时间序列图表示。在后续研究中，我们将实施更频繁和系统的食物摄入监测，以实现全面的纵向评估。其次，当前研究中省略了水分摄入数据。我们计划在后续实验中纳入常规的水分摄入监测，以全面考虑这一潜在的混淆因素。第三，这里报告的组学途径仅代表了初步的探索性见解，需要进一步的实验验证；确切的潜在机制仍有待明确。我们承诺在未来的研究中进行专门的机制研究，以稳健地验证并显著扩展这些观察结果。

总之，高脂肪饮食与其他宏量营养素组合相比，通过涉及线粒体功能障碍和脂质代谢重编程的双重相互作用网络，对T2DM产生了更为明显的不利影响，共同破坏了全身代谢稳态。