从野外到养殖场：两点蟋蟀（Gryllus Bimaculatus）养殖过程中Pantoea Agglomerans肠道细菌组的差异及其作为益生菌的潜力

《Probiotics and Antimicrobial Proteins》：From Wild to Farm: Gut Bacteriome Differences and Probiotic Potential of Pantoea Agglomerans in Two-Spotted Cricket (Gryllus Bimaculatus) Rearing

　　摘要
肠道微生物组在昆虫的营养和性能中起着至关重要的作用，然而其在蟋蟀养殖中的目标性利用 aún 未被充分探索。在此，我们结合了野生和养殖的Gryllus bimaculatus肠道微生物群的分析以及宿主来源细菌分离株的益生菌测试，以探索基于微生物组的可持续蟋蟀养殖策略。野生蟋蟀的Shannon多样性较高，但系统发育多样性较低；而养殖蟋蟀则富含Oscillospiraceae和Christensenellaceae家族 bacteria。在199个细菌分离株中，野生种群中具有尿酸分解能力的菌株比例较高（44% vs 31%），这与氮循环有关；而养殖蟋蟀中具有果胶分解能力的菌株比例较高（70% vs 50%），这与植物纤维降解相关。我们选择了具有广泛酶活性的Pantoea agglomerans I53BLB进行益生菌评估，并提供了其基因组序列及分析，以阐明其代谢和益生菌潜力。我们进行了一个2×3因子设计的喂养实验（两种饮食×三种益生菌处理，每组10个重复实验），比较了对照鸡饲料与添加了农业副产品的高纤维饲料，每种饲料均补充了活的或热灭活的P. agglomerans。结果显示，在体重增加（χ2 = 18.8, p = 0.0021）和成虫出现率（χ2 = 17.7, p = 0.0033）方面存在显著的饮食×益生菌交互作用。只有当活的P. agglomerans与高纤维饲料结合使用时，其效果才显著提升：个体平均湿重达到0.602克（而热灭活菌株为0.451克，p = 0.035；水对照组为0.427克，p = 0.003），且成虫出现率显著高于其他处理组合（13%，p < 0.05），这表明可能存在与碳水化合物消化相关的共生效应。在生存率或繁殖产出方面未观察到显著效果。值得注意的是，仅高纤维饲料的表现与商业饲料相当，这表明使用农业副产品有可能实现可持续的蟋蟀生产。这些发现证明了基于微生物组的益生菌策略在提高蟋蟀养殖效率的同时降低饲料成本的可行性。

图形摘要
肠道微生物组在昆虫的营养和性能中起着至关重要的作用，然而其在蟋蟀养殖中的目标性利用尚未得到充分探索。在此，我们结合了野生和养殖的Gryllus bimaculatus肠道微生物群的分析以及宿主来源细菌分离株的益生菌测试，以探索基于微生物组的可持续蟋蟀养殖策略。野生蟋蟀的Shannon多样性较高，但系统发育多样性较低；而养殖蟋蟀则富含Oscillospiraceae和Christensenellaceae家族细菌。在199个细菌分离株中，野生种群中具有尿酸分解能力的菌株比例较高（44% vs 31%），这与氮循环有关；而养殖蟋蟀中具有果胶分解能力的菌株比例较高（70% vs 50%），这与植物纤维降解相关。我们选择了具有广泛酶活性的Pantoea agglomerans I53BLB进行益生菌评估，并提供了其基因组序列及分析，以阐明其代谢和益生菌潜力。我们进行了一个2×3因子设计的喂养实验（两种饮食×三种益生菌处理，每组10个重复实验），比较了对照鸡饲料与添加了农业副产品的高纤维饲料，每种饲料均补充了活的或热灭活的P. agglomerans。结果显示，在体重增加（χ2 = 18.8, p = 0.0021）和成虫出现率（χ2 = 17.7, p = 0.0033）方面存在显著的饮食×益生菌交互作用。只有当活的P. agglomerans与高纤维饲料结合使用时，其效果才显著提升：个体平均湿重达到0.602克（而热灭活菌株为0.451克，p = 0.035；水对照组为0.427克，p = 0.003），且成虫出现率显著高于其他处理组合（13%，p < 0.05），这表明可能存在与碳水化合物消化相关的共生效应。在生存率或繁殖产出方面未观察到显著效果。值得注意的是，仅高纤维饲料的表现与商业饲料相当，这表明使用农业副产品有可能实现可持续的蟋蟀生产。这些发现证明了基于微生物组的益生菌策略在提高蟋蟀养殖效率的同时降低饲料成本的可行性。

引言
Gryllus bimaculatus广泛分布于欧洲、非洲和亚洲的热带和亚热带地区[1]，由于其高营养价值、短生命周期以及相对于其他蟋蟀物种而言较大的体型和更高的经济产量，被认为是亚洲最重要的可食用昆虫之一[2]。尽管欧盟食品安全局（EFSA）尚未批准其在欧洲作为新型食品使用，但其潜力仍然巨大，特别是在地中海地区自然分布的情况为人工养殖种群的遗传改良提供了持续的野生个体来源。此外，它在亚洲有着长期的安全食用历史，具有高营养价值、高效的饲料转化率和低环境影响，因此非常符合欧盟当前的可持续性和食品安全目标。

从营养角度来看，G. bimaculatus含有约54–58%的粗蛋白、6.90%的粗纤维、26.90%的脂肪和78.90%的总可消化养分（以干物质为基础），以及包括蛋氨酸、赖氨酸、组氨酸、缬氨酸和亮氨酸在内的必需氨基酸[3, 4]。研究表明，G. bimaculatus中的铁、锌和钾含量高于传统植物和动物来源[5]。除了营养应用外，G. bimaculatus提取物还显示出治疗潜力，能有效对抗脂肪肝和细胞凋亡，同时减轻肠道对微生物毒素的通透性并抑制细胞炎症[6]。

蟋蟀生产的主要成本之一是昆虫饲料[7]，这推动了开发含有农业副产品的人工饲料的研究。鉴于蟋蟀是杂食性物种，预计它们能够消化各种植物和动物来源的物质[1]。然而，关于使用农业工业副产品和副产品配制的饲料的研究表明，当植物纤维含量超过10%时，会对这种昆虫的生长和饲料转化效率产生负面影响[8,9,10,11]。这些研究的共同点是所有研究的样品都是在人工饲养条件下长期使用合成饲料饲养的蟋蟀，这表明负责促进植物纤维消化的肠道微生物群可能减少或不存在。

为了支持基于微生物组的策略来改进蟋蟀养殖，我们追求了两个互补的目标。首先，我们通过高通量测序16S rRNA基因来表征和比较野生和养殖G. bimaculatus的肠道细菌群，并筛选具有昆虫营养相关特性的可培养分离株。其次，我们假设通过益生菌补充增强肠道微生物群的功能能力可以改善纤维消化和养殖性能。为此，我们选择了一种具有广泛酶活性的宿主相关细菌分离株，并使用由农业副产品配制的高纤维饲料对其益生菌潜力进行了体内评估。

材料与方法
2022年9月的最后一周，我们从西班牙四个不同的地点（Castelldefels（3只）、Aldehuela-Salamanca（3只）、St. Guim de Freixenet（3只）和Rota, Andalucía（4只）收集了3到4只野生成年蟋蟀（补充表1）。夜间通过捕捉它们的鸣叫声来定位野生个体，然后手动捕获并分别放入无菌塑料容器中，立即放入装有冰块的便携式冷却器中，运往实验室。用于生产的成年蟋蟀由位于西班牙和荷兰的三位匿名私人昆虫繁殖者提供，每位繁殖者提供3只个体。在实验室到达后，昆虫被立即储存在-20°C条件下，这也作为安乐死的方法，直至进一步处理。昆虫运输时使用装有5×5厘米鸡蛋盒碎片的塑料容器，以增加可用表面积，并附带每家公司使用的相应饲料。为了确认收集到的个体属于G. bimaculatus，移除了每只昆虫的一条后腿，并使用DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen Sciences）按照制造商的协议提取DNA。使用引物LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）和HCO2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）扩增线粒体细胞色素氧化酶I（COI）基因，靶向708 bp片段。PCR产物使用Sanger方法进行测序，所得序列与NCBI核苷酸数据库（GenBank）进行比对以确定物种身份。

细菌DNA提取和测序
在安乐死昆虫后，整个昆虫经过三步表面消毒处理：首先短暂浸入无菌水中，然后使用70%乙醇处理，最后用无菌水冲洗。然后在无菌条件下提取整个消化道，并将其 homogenized 在2 ml 0.9% NaCl溶液中。其中一半匀浆液用于DNA提取，其余部分用于细菌分离。

为了比较野生和养殖蟋蟀的微生物群，分别处理了单个肠道样本。使用DNeasy Blood and Tissue kit（Qiagen Sciences）从1 mL肠道匀浆液中提取微生物DNA。处理后的DNA样本被送往Novogen（英国）进行文库构建（NEB Next? Ultra? II FS DNA PCR-free Library Prep Kit，New England Biolabs，美国）和测序。通过使用引物341F（CCTAYGGGRBGCASCAG）和806R（GGACTACNNGGGTATCTAAT）针对16S rRNA的V3-V4变量区域，在Illumina NextSeq平台上进行测序，读取长度为250 bp的配对末端序列。根据制造商的建议生成测序文库，并添加索引。16S rRNA（V3–V4）宏条形码扩增子序列已存入NCBI GenBank，访问号为PRJNA1271293。

生物信息学分析
扩增子序列处理和下游多样性分析按照Saati-Santamaría等人的方法进行[12]。简而言之，序列数据在QIIME2（v2023.2）[13]中处理。使用q2-demux进行去多路复用和质量控制后，通过DADA2 [14]将序列聚类为扩增子序列变体（ASVs）。分类学分配使用SILVA参考数据库（版本138.1）[15]。我们使用稀释曲线来估计测序深度的充分性和样本的代表性。多样性分析包括alpha指标（Shannon、Pielou均匀度、Faith的系统发育多样性）和beta指标（Bray-Curtis和UniFrac距离）。为了测试组间群落组成的显著差异，应用了PERMANOVA（Adonis test）[16, 17]，使用beta-group-significance方法。最后，使用ACOM-BC [18]来确定组间差异丰富的分类单元。

具有益生菌潜力的肠道细菌共生体的分离
从每个肠道样本中取系列稀释液接种在Luria Bertoni（LB）（Sigma-Aldrich）琼脂培养基（1.5%）上，在28 °C下培养72小时。选择LB作为非选择性复杂培养基，以最大化从肠道中回收可培养的异养细菌，这与其在昆虫肠道微生物组研究中的广泛应用一致[19,20,21,22]。显示独特形态特征的菌落被分离出来，通过连续传代培养纯化，并在-80 °C下用甘油保存以长期储存。

为了评估植物聚合物的降解能力，细菌分离株在添加了特定底物的LB琼脂（1.5%）上培养：添加0.5%羧甲基纤维素（CMC）或桦木木聚糖以评估纤维素降解和木聚糖降解活性；以及1%马铃薯淀粉或柑橘果胶以评估淀粉降解和果胶降解活性（所有底物均来自德国Darmstadt的Sigma-Aldrich）[23]。通过用1% Congo red（用于纤维素和木聚糖降解）或Lugol’s iodine溶液（用于淀粉和果胶降解）染色后观察细菌菌落周围形成的透明晕圈来检测酶活性。

还评估了这些分离株代谢氮化合物的能力。尿酸降解的评估遵循Callegari等人的方法[24]，即在Nutrient Broth（NB）–Uric Acid培养基（0.8% NB、0.5%尿酸和1.5%琼脂）上接种分离株，在28 °C下培养48小时后观察形成的透明晕圈。脲酶活性通过在96孔板中使用 urea broth（Fluka Biochemika）在28 °C下培养48小时不搅拌来测定。培养基从黄色变为粉色表示脲酶活性阳性。

为了鉴定具有益生菌潜力的肠道细菌共生体，仅识别了能够水解所有植物聚合物并代谢氮化合物的细菌。为此，根据制造商指南使用DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen Sciences）提取细菌DNA。16S rRNA基因扩增使用通用引物27F（AGAGTTTGATCATGGCTCAG）和1492R（TACGGTTACCTTGTTACGACTT）。PCR反应（25 μL）包含3 μL模板DNA、15 μL REDTaq? ReadyMix?（Merck）、2.5 μL每种引物（2 μM）和2 μL ddH2O。PCR程序包括初始变性（95 °C，9分钟），随后是35个循环：94 °C 60秒、56.2 °C 90秒、72 °C 90秒，最后在72 °C下延伸7分钟。在使用GeneJET PCR Purification Kit（Thermo Fisher Scientific）进行纯化后，产品由Nucleus Services（西班牙萨拉曼卡）进行测序。所得序列使用BioEdit [25]进行比对，并通过EzBioCloud平台 [27] 与EzTaxon 16 S rRNA [26] 数据库中的模式菌株序列进行比较。

**基因组测序与分析**
细菌菌株I53BLB在28°C下于液体LB培养基中培养过夜，振荡速率为200 rpm。细胞通过6,000 × g相对离心力（RCF）离心收集，弃去上清液，将细胞沉淀重悬在500 μL 0.9% NaCl中。保存后的细胞被送往Plasmidsaurus（美国）服务公司进行基因组DNA提取和全基因组测序。基因组DNA提取、文库制备、测序和初步生物信息学处理均按照Plasmidsaurus的标准协议使用Zymo Quick-DNA Fungal/Bacteria Miniprep Kit完成。全基因组测序采用Oxford Nanopore Technologies（ONT）和Illumina的混合技术进行。无扩增的ONT长读长测序文库使用v14文库制备化学试剂制备，通过加标记技术实现最小程度的序列非依赖性片段化，并使用R10.4.1流式细胞仪和无需引物的方案进行测序。碱基呼叫使用Dorado（Oxford Nanopore Technologies [28]）的Super-Accurate模式和默认的Q10质量过滤标准进行。ONT读取数据通过Filtlong v0.2.1 [29]去除质量最低的5%的数据进行过滤。基因组大小估计和读取数据降采样使用Autocycler辅助功能完成，多个从头组装分别使用Flye v2.9.6+ [30]、Hifiasm [31]和Plassembler v1.8.0+ [32]生成。随后使用Autocycler [33]处理组装结果，去除低覆盖率和小型contig，并识别最佳共识组装，然后使用dnaapler将其旋转到最佳起始位置。长读长组装使用Medaka v1.8.0进行优化。

**混合组装 polishing**
为了混合组装的进一步优化，生成了配对端的Illumina短读长（2 × 150 bp），并专门使用Polypolish v0.6.0 [34]进一步优化ONT组装。基因组注释使用Bakta v1.11进行。组装质量、完整性和污染程度使用CheckM v1.2.2进行评估。最终混合组装的共识准确率约为Q60（≥ 99.9999%），组装覆盖率为110x。P. agglomerans I53BLB的全基因组序列和16 S核糖体RNA序列分别存入NCBI GenBank，访问号为PRJNA1404461和PV702186。菌株I53BLB的种级分类基于全基因组相似性指标进行评估。使用pyANI [35]计算基于BLAST的平均核苷酸identity（ANIb），将I53BLB基因组与Pantoea属内的参考基因组进行比较。数字DNA-DNA杂交（dDDH）值使用Type (Strain) Genome Server（TYGS）和默认参数 [36]计算。物种归属基于细菌物种划分的既定阈值（ANI ≥ 95% 和 dDDH ≥ 70% [37, 38]）进行确认。质粒复制类型、迁移能力和接合系统使用MOB-suite（特别是mob_typer v3.1.9）预测，该工具根据松弛酶类型、配对形成（MPF）系统和预测的迁移能力对质粒进行分类 [39]。根据是否存在完整的接合机制，质粒被分为不可移动型和可接合型。使用PlasmidHunter [40]进一步确认质粒身份。

**实验饮食的制备**
实验饮食使用当地来源的农业副产品和副产品配制，具有高纤维含量，特别是干面包残余物、小麦麸皮（Biobram，阿尔科彭达斯，马德里）和玉米蒸馏残渣（DDGS，COPASA，萨拉曼卡，西班牙），并添加有机大豆粉（Biobram，阿尔科彭达斯，马德里）以匹配对照饮食的粗蛋白含量。除了干面包残余物（通过近端分析确定粗纤维含量< 2%）外，所有成分的粗纤维含量均来自供应商提供的技术数据表。实验饮食的最终营养成分如下：粗蛋白17.5%；脂肪5.13%；粗纤维23%；能量2450 Kcal/kg。所有成分均研磨并通过0.7 mm筛网获得均匀的面粉状混合物。对照饮食由磨碎的有机鸡饲料（0.7 mm，Piensos Ecológicos BIBE，帕哈雷斯戴拉拉古纳，萨拉曼卡）组成，其中包含小麦、玉米、大豆粉、葵花籽饼、豆粉和豆油（粗蛋白：17.5%；脂肪：5.2%；能量：2500 Kcal/kg）。两种饮食的蛋白质含量相同（均为17.5%），但纤维含量不同，能量也不完全相同（2450 vs. 2500 Kcal/kg）。两种饮食均添加了等量的矿物质预混剂。需要注意的是，所有成分均来自具有标准化技术数据表的商业产品，选择这些成分是因为它们在当地容易获得。然而，由于未对最终混合饮食进行近端分析，因此在复制此配方时应考虑成分组成可能因加工而产生的变化。

**益生菌细胞的分离**
选择了一种能够水解四种植物聚合物并代谢氮化合物的细菌分离株，鉴定为Pantoea agglomerans I53BLB。为了评估其作为益生菌的潜力，该菌株在两个2-L烧瓶中分别含有500 mL LB液体培养基中培养，温度为28°C，振荡速率为180 rpm，培养时间为48小时，遵循类似研究中报道的P. agglomerans菌株的接种方案 [39]。其中一个烧瓶在121°C下高压灭菌15分钟以灭活细菌，该方法之前已被验证用于昆虫喂养实验中制备具有后生物活性/热失活的细菌对照。细胞通过6,000 × g RCF离心7分钟收集，然后用0.9% NaCl洗涤三次。进行系列稀释以达到光学密度（OD）为1（波长600 nm）。该程序既适用于活细胞也适用于热失活细胞。

**评估添加了P. agglomerans的高纤维饮食**
进行了喂养实验，以评估P. agglomerans I53BLB对蟋蟀表现的影响，将细菌作为益生菌补充剂和水分来源。测试了两种饮食类型：有机鸡饲料（蟋蟀常规使用的饮食）和实验性高纤维饮食。在每种饮食类型中，评估了三种益生菌补充条件：无益生菌（仅加水）、活性P. agglomerans或热失活P. agglomerans，从而得到六个实验组：(i) 有机鸡饲料加水（C + W），作为标准饮食的对照；(ii) 有机鸡饲料加活性P. agglomerans（C + LP）；(iii) 有机鸡饲料加热失活P. agglomerans（C + AP）；(iv) 实验饮食加水（ED + W），作为高纤维饮食的对照；(v) 实验饮食加活性P. agglomerans（ED + LP）；(vi) 实验饮食加热失活P. agglomerans（ED + AP）。益生菌悬浮液（1 × 10? CFU/mL）替代了水中的成分，同时提供水分和益生菌补充。该浓度被选为昆虫研究中报告的有效剂量范围（1 × 10?至1 × 1011 CFU/mL [44,45,46]）内的中间剂量。每个实验单元包括一个4-L塑料容器（14 × 26 × 19 cm），带有五个0.3-cm的通风孔。每个容器内有两个50-mm Petri皿提供饮食（有机鸡饲料或实验饮食）和水分/益生菌来源，同时两个15 × 15 cm的蛋盒增加了可用表面积。每个处理包含十个重复实验，每个重复实验有十只两周大的若虫，提供无限量的食物和5 mL的分配水分/益生菌来源，每两天补充一次。所有容器保持在29°C、60%相对湿度和12小时的光照周期。三周后，记录了湿生物量、存活率和达到成年的个体百分比。

**之后，为了评估处理对后代产量的影响，从达到成年的个体中选取每个处理的40个个体（每个重复实验5只雄性和5只雌性，共四个重复实验），并将这些成年个体放置在新容器中，保持相同的环境条件并允许它们交配。在8天期间监测卵的孵化情况，每48小时计数一次卵的数量。尽管在每个时间点都记录了孵化情况，但数据分析基于整个8天期间每个重复实验累积的孵化蛋总数。**

**昆虫中肠的组织学分析**
在完成添加了P. agglomerans的高纤维饮食的评估后，从每个处理组（W + ED和LP + ED）随机选取两个成年个体（一只雄性和一只雌性），在-20°C下冷麻醉2分钟后再进行解剖。随后解剖消化系统，并分离中肠组织进行组织学检查。中肠样本首先在2.5%戊二醛中固定2小时，然后用磷酸盐缓冲液洗涤四次（每次30分钟）。之后用锇四氧化物进行后固定，并通过逐步乙醇系列脱水。脱水后，样本嵌入8% Epon树脂中，并使用切片机切成约6 μm的半薄切片。切片使用蛋清溶液（约1% w/v）作为粘合剂固定在玻璃载玻片上，并在染色前干燥24小时。载玻片用甲苯胺蓝染色，并在光学显微镜下进行形态学分析。

**喂养实验的统计分析**
使用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性。由于某些变量不符合正态性假设，因此应用了非参数统计方法。使用Kruskal-Wallis秩和检验评估饮食类型（对照组与实验组）、益生菌处理（水、活性益生菌和热失活益生菌）及其交互作用的效果。对于交互作用分析，同时检查了所有六种处理组合。当检测到显著差异时，使用Dunn检验进行事后成对比较，并应用Bonferroni调整进行多重比较。分析包括蟋蟀的平均湿重、存活率、达到成年阶段的个体百分比和孵化蛋的总数。所有统计分析均在R版本4.0 [47]中进行，显著性阈值为p = 0.05。使用ggplot2包（版本3.5.2） [48]生成的箱形图可视化处理组之间的数据分布。

**G. bimaculatus野生和养殖个体的肠道细菌组多样性和组成**
从22个G. bimaculatus肠道样本中获得了总共1,567,041个高质量读长（16 S rRNA基因），平均每个样本71,229 ± 14,303个读长。这些序列被分类为5,062个独特的扩增子序列变体（ASVs）。基于观察特征的稀释分析表明，测序深度足以捕获大多数样本中的细菌多样性（见补充图S1A）。分类学分析显示，在分析的22个样本的肠道微生物群中，共有24个门、36个纲、94个目、182个科和379个属。野生蟋蟀肠道的细菌组主要由Bacillota门（52%）、Bacteroidetes门（26%）和Pseudomonadota门（19%）主导，而养殖蟋蟀肠道的主要门则是Pseudomonadota门（35%）、Bacillota门（32%）和Bacteroidetes门（29%）（图1A）。野生蟋蟀肠道的主要纲是Clostridia纲（38%）、Bacteroidia纲（26%）、Gammaproteobacteria纲（17%）和Bacilli纲（14%），而养殖蟋蟀肠道的主要纲是Bacteroidia纲（29%）、Gammaproteobacteria纲（27%）、Clostridia纲（16%）和Bacilli纲（16%）（图1B）。在属水平上，野生G. bimaculatus中最常见的属是Candidatus_Soleaferrea（11%）、Parabacteroides（9%）和Lactococcus（9%），而养殖蟋蟀则是Parabacteroides（17%）、Candidatus_Hepatincola（10%）和Pragia（9%）（图1D；补充图S1B）。

**基于16 S rRNA基因分析的野生和养殖G. bimaculatus肠道细菌组成的相对丰度**
尽管养殖和野生蟋蟀都携带多样化的肠道细菌群落，但野生蟋蟀的Shannon指数始终更高（Kruskal-Wallis检验：H = 12.79，p < 0.01）。相比之下，Faith的系统发育多样性分析显示养殖蟋蟀的肠道系统发育多样性高于野生蟋蟀（H = 12.4，p < 0.01）。然而，Pielou均匀性指数的结果表明分布更为不均匀，某些分类群（如Parabacteroides、Candidatus_Hepatincola和Pragia）在养殖蟋蟀中的数量显著多于野生蟋蟀（H = 5.0，p < 0.01）（图2A、B和C）。图2的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

野生和养殖的G. bimaculatus之间的微生物多样性和组成分析。Alpha多样性指数通过箱形图显示：A为Pielou均匀性指数，B为Shannon指数，C为Faith的PD指数。** p < 0.01。Beta多样性通过主坐标分析（PCoA）图显示：D为Bray-Curtis加权距离，E为Unweighted UniFrac距离。红色点代表野生样本，蓝色点代表养殖样本。微生物组组成的分析（ANCOM-BC）显示野生和养殖种群之间肠道细菌的F目、G科和H属存在差异。条形图表示细菌分类群的相对丰度对数倍数变化，蓝色条形表示养殖种群中的富集，红色条形表示野生种群中的富集。

我们发现组别（野生 vs. 养殖）显著解释了微生物群落组成的变异（ADONIS，R2 = 0.09，p < 0.001）。随后基于Bray-Curtis、加权UniFrac和未加权UniFrac距离的成对比较确认了野生和养殖蟋蟀之间的显著差异（成对PERMANOVA，p < 0.001），并且在图表上显示出明显的分离（图2D–F）。

我们识别出几个在不同数量的分类群，这些分类群在野生和养殖蟋蟀的肠道细菌组之间存在差异。在属水平上，Oscillospiraceae和Christensenellaceae家族的未分配属在野生蟋蟀的肠道中更丰富（LFC = -1.0和-0.8；p-adj < 0.05），而Parabacteroides属在养殖蟋蟀的肠道中更丰富（LFC = +1.8；p-adj < 0.05）（图2F-H）。

鉴定G. Bimaculatus肠道中的核心细菌属

表征核心微生物群非常重要，因为它们是一组在大多数个体中一致存在的微生物分类群，有助于理解肠道细菌群落的稳定和潜在的功能组成部分。这些核心成员可能在宿主生理、消化、免疫或整体微生物组韧性中发挥作用，并可能有助于区分由宿主驱动和环境驱动的变异。在我们的数据集中，有15个属被鉴定为核心细菌，存在于超过90%的样本中。相对于整个细菌群落，核心微生物组中最丰富的分类群包括Lactococcus（平均相对丰度5.1%）、Bacteroides（0.4%）、Wolbachia（0.33%）和Enterococcus（0.32%）。

野生和养殖蟋蟀的核心微生物群中有8个属是共有的，包括Bacteroides、Bifidobacterium、Candidatus Soleaferrea、Desulfovibrio、Enterococcus、Lachnoclostridium、Lactobacillus和Lactococcus。在野生蟋蟀中，有16个属被鉴定为核心成员，其中Lactococcus（4.7%）、Bacteroides（0.47%）、Wolbachia（0.45%）和Enterococcus（0.29%）最为丰富。相比之下，养殖蟋蟀中有12个核心属，其中Lactococcus（3.6%）、Parabacteroides（0.50%）、Lachnoclostridium（0.23%）和Bacteroides（0.17%）最为丰富。

从G. bimaculatus的肠道中分离并鉴定出199株纯培养物，其中134株来自野生个体，65株来自养殖个体。在野生蟋蟀分离株中，分别有54%、50%、42%和9%具有分解淀粉、果胶、纤维素和木聚糖的能力（图4A）。有两株分离株，被鉴定为P. agglomerans I53BLB和Bacillus cereus I173B（与模式菌株的相似度为100%），能够同时降解这四种化合物。此外，分别有44%和15%的分离株具有分解尿酸和尿素的能力（图3）。

在养殖的G. bimaculatus中，分别有59%、70%、27%和8%的分离株具有分解果胶、淀粉、纤维素和木聚糖的能力（图3）。有一株菌株能够降解所有四种多糖，最初根据EzBioCloud分析被归类为Klebsiella属；然而，其16S rRNA基因序列与最接近的有效命名分类群Klebsiella huaxiensis的相似度仅为94.25%。这种程度的相似性表明这些分离株可能代表Enterobacteriaceae科中的一个新属。此外，分别有31%和16%的分离株具有分解尿酸和尿素的能力（图3）。

图3的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

图4的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

箱形图表示饮食类型和益生菌补充对A个体重量（g）、B达到成年阶段的个体百分比、C存活百分比以及D G. bimaculatus中孵化蛋总数的全因子分析效果。“C”和“ED”分别代表对照有机鸡饲料和高纤维实验饲料。“AP”代表高压灭菌（热灭活）的P. agglomerans（I53BLB），“LP”代表活的P. agglomerans（I53BLB），“W”代表水对照处理。不同的小写字母表示处理组合之间的显著差异（p < 0.05）。

与Pantoea agglomerans I53BLB中的多糖降解和氮循环相关的基因组特征

我们关注Pantoea agglomerans I53BLB是因为它在分离和筛选过程中显示出独特的特性组合。选择P. agglomerans I53BLB进行益生菌评估是因为它能够降解所有四种测试的植物多糖以及尿酸。尽管其他分离的细菌种类，如Bacillus cereus，也显示出类似的代谢能力，但这种物种经常被报告为各种昆虫物种的病原体，也可能对食品安全构成威胁[49, 50]。此外，Pantoea存在于80%的样本个体中，这表明这种微生物可能已经适应了G. bimaculatus的消化系统。这些特征使P. agglomerans I53BLB成为探索多功能共生及其益生菌潜力的理想候选者。

Pantoea agglomerans I53BLB的基因组由一个染色体和三个完全封闭的质粒组成，总大小约为4.96 Mb（GC = 55.13%）。这三个质粒的大小不同：contig_2为551 kb，contig_3为173 kb，contig_4为156 kb。根据复制和移动性预测，contig 2和3是不可移动的，而contig 4是可接合的，表明具有水平基因转移的潜力。基于基因组分析的分类学鉴定确认I53BLB属于Pantoea agglomerans物种，其数字DNA-DNA杂交（dDDH）值为79.4%，与模式菌株Pantoea agglomerans DSM 3493（GCA_019048385.1）的平均核苷酸同源性（ANIb）为97.6%。

Pantoea agglomerans I53BLB携带多种糖苷水解酶（GHs），能够降解主要的植物多糖，包括果胶、淀粉和木聚糖。染色体编码的主要果胶降解酶包括GH28内聚半乳糖醛酸酶和GH105鼠李糖半乳醛酸裂解酶，而次要活性涉及GH43阿拉伯呋喃糖苷酶和GH2 β-半乳糖苷酶。淀粉降解依赖于多个GH13亚家族（GH13_5、GH13_10、GH13_18）在初级水平上的作用，其次级作用由α-葡萄糖苷酶（GH31）和β-葡萄糖苷酶（GH1）辅助。纤维素的分解主要由GH8内葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶（GH3、GH1）实现，促进纤维素链的顺序水解。木聚糖的降解似乎仅限于次要酶，如β-葡萄糖苷酶（GH1）和β-半乳糖苷酶（GH2_10），表明半纤维素底物被部分利用。

有趣的是，与这些降解途径相关的几个GH基因也位于质粒上，特别是β-葡萄糖苷酶和阿拉伯半乳糖醛酸内-β-1,4-半乳糖苷酶（GH53），这些酶可能通过水平基因转移赋予适应性优势。这种多功能的酶谱支持P. agglomerans I53BLB在昆虫肠道中多糖转化中的作用，有助于宿主营养和微生物组的调节。染色体和质粒携带的GH基因共同强调了其作为能够分解复杂饮食聚合物的益生菌的有效性。

除了碳水化合物代谢外，染色体还编码了一整套参与尿酸降解和氮循环的基因。关键酶如尿酸氧化酶（uaZ）、FAD依赖的尿酸羟化酶（hpxO、hpyO）和5-羟基异尿酸水解酶（uraH—— chromosome中有2个拷贝，质粒中有1个拷贝，hiuH）的存在，以及所有antoinase（allB）、allantoate脱氨基酶（allC）和负责将尿氨酸转化为草酸脲酸和最终尿素和草酸的下游酶（例如，pucG、hpxY、hpxW）。这种基因组配置表明其在昆虫肠道环境中具有强大的氮废物化合物循环能力，可能 enhancing 微生物组和宿主的氮可用性。这些基因位于质粒上进一步暗示了潜在的水平基因转移和适应性灵活性。

总之，多糖降解和氮循环的酶谱强调了P. agglomerans I53BLB作为多功能共生体的生态作用，能够提高宿主从复杂和富含氮的基质中利用营养的能力。

评估添加了P. Agglomerans I53BLB的高纤维饮食

在蟋蟀养殖中，通常避免使用高纤维饮食，因为它们与饲料转化率降低和存活率下降有关[51, 52]。然而，目前的知识表明，蟋蟀是非特化的杂食性动物，对植物材料和其他食物来源都有偏好[53]。我们假设P. agglomerans I53BLB作为益生菌可以帮助蟋蟀耐受高纤维摄入。因此，我们也在实验设置中包含了这一变量。

我们发现不同益生菌处理组之间的平均体重有显著差异（Kruskal-Wallis χ2 = 11.45，d.f. = 2，p = 0.0033），但在不同饮食类型之间没有观察到显著差异（χ2 = 0.47，d.f. = 1，p = 0.4914）。然而，饮食和益生菌处理之间的交互作用对体重有显著影响（χ2 = 18.8，d.f. = 5，p = 0.0021）。事后比较显示，在实验饮食（ED）中，接受活益生菌（LP）处理的个体体重显著更高（平均 = 0.602 g），而接受高压灭菌益生菌（AP）（平均 = 0.451 g）或水（平均 = 0.427 g）处理的个体体重较低（图4A）。相比之下，在C饮食（对照有机鸡饲料）下，不同益生菌处理之间的体重没有显著差异（所有p > 0.05），尽管LP组的体重中位数略高（图4A）。总体而言，LP菌株与最大的体重增加相关，特别是在ED饮食下。

关于达到成年阶段的个体百分比，单独的饮食类型之间没有显著差异（χ2 = 1.87，d.f. = 1，p = 0.1717）或单独的益生菌处理之间也没有显著差异（χ2 = 5.06，d.f. = 2，p = 0.0797）。然而，饮食和益生菌处理之间的交互作用有显著影响（χ2 = 17.7，d.f. = 5，p = 0.0033）。事后Dunn检验显示，ED + LP处理的成年百分比显著高于C + LP（平均 = 13%，p = 0.008），ED + AP（平均 = 13%，p = 0.016），以及ED + W（平均 = 13%，p = 0.007）处理（图4B）。

存活百分比在不同饮食类型之间（χ2 = 0.004，d.f. = 1，p = 0.952）或益生菌处理之间（χ2 = 4.31，d.f. = 2，p = 0.116）没有显著差异，这些因素之间的交互作用也没有显著差异（χ2 = 6.66，d.f. = 5，p = 0.247）（图4C）。此外，不同饮食类型之间（χ2 = 0.23，d.f. = 1，p = 0.631）或益生菌处理之间（χ2 = 1.65，d.f. = 2，p = 0.437）的孵化蛋数量也没有显著差异。同样，饮食和益生菌处理的组合也没有显著影响孵化（χ2 = 4.08，d.f. = 5，p = 0.538）（图4D）。

对P. Agglomerans I53BLB对G. Bimaculatus中段肠效果的解剖学分析

对中段肠横截面的解剖学检查显示，处理组之间的组织形态没有可观察到的差异。ED + W（实验饮食 + 水）和ED + LP（实验饮食 + 活益生菌）两组均表现出正常的上皮结构，细胞组织完好无损（图5）。上皮层显示出均匀排列，基底层膜完整，细胞分化正常。腺细胞保持其特征性的形态和分布模式，而肌肉细胞也显示出正常的结构组织。在任一组中均未检测到组织损伤、细胞退化或炎症反应。管腔保持清晰，没有细胞碎片或异常积聚。这些发现表明，在测试的实验条件下，P. agglomerans I53BLB的补充没有在中段肠中引起可检测的组织病理学变化。

图5的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

讨论

益生菌越来越多地被认可为支持昆虫养殖系统健康和性能的有希望的工具[54, 55]。尽管人们对昆虫-微生物共生关系的兴趣日益增加，但这项研究是首次评估在具有工业重要性的蟋蟀中宿主相关细菌的益生菌潜力，特别是G. bimaculatus，这是一种在食用昆虫产业中具有高商业价值的物种。作为我们研究的一部分，我们比较了野生蟋蟀和养殖蟋蟀的肠道微生物群，发现了微生物组成的显著差异。然后，我们分离并鉴定了具有潜在对宿主有益的功能特性的细菌菌株，并选择了候选菌株进行体内测试。我们的结果表明，在高纤维饮食中添加从G. bimaculatus肠道中分离出的P. agglomerans I53BLB菌株，可以显著提高其生长表现。这些发现突显了基于微生物组的干预措施在蟋蟀养殖中的潜力，并为提高食用昆虫产业的生产力和可持续性开辟了新途径。

**野生和养殖G. bimaculatus的肠道细菌组多样性和组成**

我们发现野生和养殖个体的肠道细菌组存在明显差异。在G. bimaculatus中，野生蟋蟀的Shannon多样性较高，但系统发育信度多样性较低，而养殖蟋蟀则相反。这种有趣的模式表明，虽然野生蟋蟀拥有更多种类的细菌，但由于圈养环境中的暴露于人类相关细菌，养殖蟋蟀的细菌群落具有更高的系统发育多样性。养殖蟋蟀较低的Pielou均匀度表明细菌类群的分布更加不均匀，这可能是由于养殖环境中的选择压力所致。这一现象与其他动物的普遍趋势一致，即野生个体的肠道微生物组通常更加多样化。这些结果与其他昆虫物种的研究结果一致，例如蟋蟀Teleogryllys oceanicus [57]、鹿甲Dorcus hopei hopei [58]和家蚕Bombyx mori [59]，其中驯化导致肠道微生物组的多样性发生变化。这种变化可能与野生和养殖蟋蟀的饮食组成差异有关。Pseudomonadota与植食性昆虫的饮食有关 [60]，这与养殖蟋蟀通常使用的合成植物基饲料（如易于消化的鸡肉饲料成分）相符。Bacteroidota则被报道为圈养动物（包括昆虫）中最丰富的门之一，尤其是在喂食高度加工或化学定义饲料的动物中 [57, 59, 61, 62]。在蟋蟀中，Bacteroidota的增加与富含简单碳水化合物的饮食有关，包括缺乏脂肪的饮食 [63]，以及高蛋白/低碳水化合物的饮食 [64]。

此外，我们发现野生个体的Peptostreptococcales-Tissierellales、Peptococcales和Christensenellales目以及Oscillospiraceae、Peptococcaceae和Anaplasmataceae科菌株比养殖个体更为丰富。Peptostreptococcales-Tissierellales目常见于多种动物的消化道和粪便中，但由于其严格的厌氧性质，该类群的研究较少。从功能上讲，Peptostreptococcales-Tissierellales主要参与发酵过程，利用氨基酸、简单糖或有机酸等底物产生短链脂肪酸和甲基化化合物等代谢物。此外，该目还被认为属于能够降解木质纤维素的微生物群落的一部分，从而促进植物生物质的分解 [67]。

野生蟋蟀中Peptococcales、Christensenellales及其相应的Peptococcaceae、Christensenellaceae科和Oscillospiraceae的丰富度高于养殖个体，这可能为它们提供了营养和生理优势。这些细菌群以其能够发酵复杂的不可消化碳水化合物而闻名 [68,69,70]，可能使野生蟋蟀能够从原本无法利用的饮食成分中提取能量。尽管这尚未在昆虫中进行深入研究，但在其他动物物种中的研究表明，这些微生物的发酵作用会产生短链脂肪酸（SCFAs），这与降低胃肠道pH值、限制病原体生长和增强矿物质吸收有关 [71, 72]。

养殖蟋蟀中Parabacteroides属的丰富度高于野生个体，这与之前关于蟋蟀肠道微生物组的研究结果一致。该属一直被认为是Gryllus assimilis和Acheta domesticus微生物组的核心组成部分 [73]。这些厌氧细菌在不同蟋蟀物种中的普遍存在表明它们在蟋蟀肠道中具有保守的功能角色。Parabacteroides已知参与植物多糖的发酵，这对蟋蟀后肠的消化过程至关重要（Kaufman和Klug, 1991）。养殖蟋蟀中Parabacteroides的丰富度可能反映了它们对圈养环境中富含可发酵植物成分的饮食的适应。有趣的是，这些菌株也在蟋蟀粪便和饲料中被发现，表明它们可能通过食物链和环境传播 [73]。

大多数核心细菌属的丰度较低，除了Lactococcus；具体来说，Lactococcus garvieae在基于扩增子的肠道微生物组分类谱中始终以较高的相对丰度被检测到（补充表2）。L. garvieae在多种直翅目昆虫的肠道生态系统中被发现，表明其具有功能性意义；例如，在Locusta migratoria中，这种细菌在整个发育阶段和养殖及野生群体中都占主导地位，表明其在发育和营养过程中可能发挥作用 [24, 74]。此外，该物种还与有效的纤维素降解有关，增强了宿主代谢含有纤维成分的植物饮食的能力 [74]。在Chorthippus parallelus的研究中，L. garvieae被发现在肠道和生殖组织的核心微生物组中，表明其具有生殖功能 [75]。在Anabrus simplex和Scapsipedus marginatus中，这种细菌有助于营养吸收，并在参与碳水化合物代谢和免疫的肠道区域占主导地位 [62, 76]。这种细菌在直翅目物种和发育阶段的持续存在表明它们对关键生理机制的贡献。

**具有益生菌潜力的肠道细菌共生体**

从G. bimaculatus中分离出的可培养肠道相关细菌的代谢潜力在野生和养殖个体之间存在显著差异，反映了它们对各自环境和饮食的适应性。野生蟋蟀含有更高比例能够降解纤维素和半纤维素（常见于天然植被中的植物多糖）的菌株。这与野生昆虫更广泛且控制较少的饮食相符，后者可能包含需要特殊微生物酶来消化的纤维植物材料。相比之下，养殖蟋蟀含有更高比例的果胶和淀粉水解细菌，表明它们适应了更简单的碳水化合物，这可能是由于它们的饮食中包含了水果、蔬菜和加工饲料 [77]。水果和蔬菜富含果胶，而像鸡粉这样的饲料富含淀粉 [78]，共同促进了果胶分解菌和淀粉分解菌的生长。尽管碳水化合物降解特征存在差异，但两种环境都支持了一小部分能够降解所有四种植物来源聚合物的细菌菌株。有趣的是，这些菌株属于不同的分类群：野生蟋蟀中的P. agglomerans (I53BLB)，而养殖个体中可能是Enterobacteriaceae科的新属。除了生态相关性外，这些代谢特征还指出潜在的生物技术应用，因为其他植食性昆虫的肠道相关细菌已被证明含有有助于生物质转化、生物修复和工业过程的木质纤维素分解酶 [23]。

野生G. bimaculatus中含有的尿酸分解菌（44%）比例高于养殖个体（31%），这可能反映了它们自然栖息地中氮的限制，其中昆虫的饮食通常氮素供应不足，需要共生微生物的补充。同时，尿酸分解菌通过将尿酸（昆虫的主要氮废物）分解为氨和其他可用形式来帮助循环氮 [79]。这些过程可以在蛋白质受限的条件下支持昆虫的发育。此外，野生蟋蟀的觅食行为可能使它们接触到土壤和植物表面的根际微生物。许多根际细菌具有与氮循环相关的功能特性，如固氮和矿化 [80]。由于它们使用洞穴作为庇护所和产卵场所，频繁接触根际可能有助于获取这些有益的共生体 [81]。

**添加P. Agglomerans I53BLB的高纤维饮食的评估**

饮食和益生菌处理对体重和成虫出现百分比的显著相互作用表明，P. agglomerans的益处取决于饮食条件，而不仅仅是在所有饮食条件下都存在。这一发现表明P. agglomerans I53BLB菌株可能具有独特的性质，只有在结合实验饮食时才能促进宿主生长。多项研究表明，P. agglomerans是昆虫消化系统中的常见共生体，提供多种生理优势，如改善消化、增加氮的获取和提高生存率 [82,83,84]，有助于氮和磷酸盐的利用，解毒植物化感物质，通过破坏其微生物伴侣来抑制昆虫病原体，以及合成生物活性分子如信息素和抗真菌代谢物 [51, 85, 86]。与此一致的是，P. agglomerans还主要与L. migratoria的消化系统相关，特别是在野生种群中，它是该物种核心细菌组的一部分，以及在Lissorhoptrus oryzophilus中也是如此。这种一致的关联强化了其主要功能与营养吸收和消化效率相关的观点 [24, 86]。同样，Jin和Kim [87] 的研究表明，用氨苄西林喂养Frankliniella occidentalis可以显著减少细菌负荷并延缓发育，但补充P. agglomerans BFoK1菌株能有效缓解发育迟缓，支持P. agglomerans作为有益共生体在昆虫发育中的作用。除了昆虫之外，甚至来自P. agglomerans的脂多糖（LPS）也在其他动物模型中显示出有益效果，包括提高生长性能、增强免疫活性和增加虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的肠杯状细胞密度 [88]，以及促进人类癌症患者的免疫刺激和肿瘤消退 [89]。这些多功能作用支持了其作为有益益生菌的潜力，特别是在增强宿主代谢、免疫和发育方面。

从工业角度来看，相同时间内达到成年的蟋蟀比例的增加可以缩短生产周期、提高周转率和减少饲料消耗。考虑到饲料是蟋蟀生产中最主要的成本之一，通常占总运营成本的60-70% [90, 91]，任何缩短收获时间的行为都可以显著提高经济效益。这一观点与水产和家禽系统的发现一致，其中生产周期的微小减少可以带来显著的财务收益。例如，Luna等人 [92] 表明，优化水产养殖的收获时间和生产策略可以增加40%的利润，Sz?ll?si等人 [93] 报告称，将肉鸡生产周期缩短一天可将年收入提高约0.55欧元/平方米。饮食和益生菌处理之间的显著相互作用表明高纤维饮食和益生菌之间存在协同效应。LP组的表现提升可能是由于P. agglomerans I53BLB能够降解植物多糖 [94]，从而使更多的营养物质可供宿主利用。鉴于实验饮食中的纤维含量大约是对照组的五倍，其不可消化的成分可能起到了益生元的作用，促进了有利于P. agglomerans I53BLB定植和代谢活动的肠道环境。相比之下，对照组饮食由更容易消化的成分组成，这种额外的多糖降解功能可能不太相关，这可以解释该组观察到的较小效果。值得注意的是，这种多糖降解能力部分编码在质粒上，包括糖苷水解酶，可能进一步增强了代谢灵活性，并有助于观察到的饮食依赖性益生菌效应。在Pantoea中，大的质粒已被证明会发生驯化和垂直遗传，提供稳定的、专门的功能，有助于生态适应和生态位分化，并且已知作为附带代谢特征的储存库 [12, 95]。

益生菌和益生元（称为共生体）的组合可以通过促进有益细菌的活动来增强昆虫的健康和表现，包括改善发酵过程、增加营养物质的可用性和整体调节肠道微生物组 [55]。在这个背景下，观察到的LP组性能提升可能反映了共生作用的结果，其中高纤维含量选择了性地刺激了益生菌菌株的增长或活性，最终使宿主受益。尽管在体重和成虫出现方面存在差异，但各组之间的存活率和卵孵化率没有显著差异。这可能表明益生菌带来的好处更多地与营养吸收和能量分配有关，而不是直接对死亡率抵抗力或繁殖产量的影响。这些结果与之前的研究一致，这些研究在Bactrocera cucurbitae、B. mori、Hermetia illucens和Tenebrio molitor中都发现，益生菌提高了生长能力，而没有显著影响存活率或繁殖能力[96,97,98,99]。在我们的研究中，我们没有确定P. agglomerans I53BLB是否被传递到了卵中，或者后续世代是否会通过持续的益生菌效应在其肠道微生物群中保持较高的P. agglomerans丰度。这将在未来的研究中很有价值，因为如果有益效果可以跨世代持续而不需要重新施用，那么益生菌的应用可能会更加经济。

有趣的是，尽管P. agglomerans I53BLB在这项研究中没有增强繁殖参数，但有报道称该物种具有垂直传播能力，并且不仅存在于昆虫肠道中，还存在于卵巢等生殖器官中[100, 101]。这表明它可能在早期发育过程中发挥作用或具有跨代效应。Itoh等人的研究[102]表明，在像Dolycoris baccarum这样的臭虫中，相关的Pantoea物种通过卵表面涂抹进行垂直传播，雌性虫子中肠后部的特殊扩大的隐窝有助于将共生体转移到卵表面。这种传播机制确保了后代在孵化后立即获得共生体。类似机制也可能适用于我们研究中的P. agglomerans，这支持了可持续的跨代益生菌效应的可能性，值得进一步研究。

值得强调的一点是，高纤维实验饮食（ED）的表现与对照有机鸡饲料（C）相当，平均体重、存活百分比、成虫出现率或卵孵化率没有显著差异。这些结果表明，G. bimaculatus能够有效利用高纤维饮食而不影响其表现，至少在使用我们实验配方中的特定成分时是这样。虽然我们的实验饮食含有23%的纤维，但先前的研究表明，当纤维含量超过干物质的20%时，由于不可消化的木质素、纤维素和半纤维素成分，通常会抑制蟋蟀的生长[10, 103, 104]，然而我们的发现挑战了这一假设。这表明纤维的消化率可能主要取决于其来源而不仅仅是数量。

我们的结果与[1]的研究一致，他们发现基于木薯的饮食（含19%纤维）在适当搭配蛋白质来源的情况下，能够实现最佳的体重增长和存活率。然而，我们的研究没有评估这些蟋蟀的营养组成。尽管这些高纤维饮食产生的蟋蟀的发育参数与商业饲料饲养的蟋蟀相似，但确定其蛋白质和脂肪含量仍然很重要，因为蟋蟀养殖的主要目标之一是生产蛋白质。未来的研究应该探讨高纤维饮食如何影响G. bimaculatus的营养状况，以进一步优化其作为可持续蛋白质来源的价值。

总之，这项研究为G. bimaculatus的微生物组提供了新的见解，并强调了利用与宿主相关的共生体来提高昆虫养殖效率的潜力。对野生和养殖蟋蟀的比较分析揭示了肠道细菌组成的明显差异，野生个体拥有更功能多样的细菌群落，尤其是富含分解纤维和氮代谢的菌类。这些发现表明，长期圈养和人工饮食可能会减少对消化复杂植物基质至关重要的有益共生体的存在。在所分离的菌株中，P. agglomerans I53BLB因其能够水解多种植物聚合物和降解尿酸而脱颖而出。当在高纤维饮食中作为益生菌使用时，P. agglomerans I53BLB显著提高了G. bimaculatus的体重增长和成虫出现率，且对存活、发育或繁殖没有负面影响。这些结果表明，这种细菌与宿主之间可能存在共生协同作用，尤其是在模拟农业工业副产品喂养条件的饮食情况下。高纤维饮食本身的表现与商业对照饮食相当，进一步支持了使用经济高效、可持续成分进行蟋蟀生产的可行性。

从应用的角度来看，将P. agglomerans I53BLB整合到蟋蟀养殖系统中为提高生长效率和促进可持续生产提供了一条有前景的方法。它在野生蟋蟀中的高 prevalence 以及广泛的代谢能力使其成为益生菌开发的理想候选者。未来的研究应探索最佳剂量和输送方法，评估其在不同生命阶段和世代中的持久性，并评估其在其他蟋蟀物种或昆虫模型中的应用潜力。同时，还应进行技术经济评估，以确定大规模应用这种益生菌的成本效益平衡。总体而言，这些发现突显了基于微生物组的策略在可食用昆虫养殖中的价值，并为更加韧性强、高效和循环的生产系统铺平了道路。