来自选定的克鲁维氏乳杆菌（Kluyveromyces lactis）菌株的后生物（postbiotics）和副生物（paraprobiotics）的功能特性研究

《Probiotics and Antimicrobial Proteins》：Functional Characterization of Postbiotics and Paraprobiotics Derived from Selected Kluyveromyces lactis Strains

　　**摘要**
本研究对源自克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）菌株的益生菌后产物（postbiotics）和类益生菌物质（paraprobiotics）进行了表征，以评估其生化组成和功能潜力。首先筛选出14种具有益生菌特征的菌株，其中5种因其能够在模拟胃肠道条件下保持高存活率（存活率＞70%）、具有中等至高的疏水性和自聚能力以及较强的DPPH自由基清除活性（＞30%）而被选用于进一步制备益生菌后产物和类益生菌物质。所得产物展现出不同的生物活性特征。与类益生菌物质相比，益生菌后产物具有更高的酚类化合物含量和抗氧化能力，其成分以槲皮素、没食子酸和3-羟基苯甲酸为主。进一步研究了这些产物对多种产生物膜的病原体的抑制作用，结果显示ANO7菌株产生的益生菌后产物对金黄色葡萄球菌ATCC 25,923的生物膜抑制效果最强，最大抑制率达到97.10±1.54%。ANO7益生菌后产物的游离氨基酸谱包含39种氨基酸，其中亮氨酸（3088.95 mg/L）含量最高，必需氨基酸指数为88.1%，同时检测到了γ-氨基丁酸（GABA）。研究结果凸显了源自K. lactis ANO7菌株的益生菌后产物作为一种非活性生物活性成分的技术和功能价值，其在功能性食品、天然抗菌策略及营养增强方面的应用潜力巨大。

**引言**
益生菌是指在适宜剂量下能够为宿主健康带来益处的活微生物[1]。尽管益生菌酵母在多方面具有广泛的功能，但其在实际应用中仍存在诸多限制，包括生产及储存过程中维持存活率和稳定性的难度、肠道定植效率的不确定性以及安全风险（如机会性感染、炎症反应乃至免疫功能低下个体的菌血症风险）。此外，益生菌的效果通常依赖于具体菌株，导致不同应用结果存在差异[5]。在复杂食品体系中保持活细胞的数量是一个重要的技术挑战。因此，非活性微生物衍生物因其不依赖细胞存活率或定植能力而具有优势，如更高的安全性、更长的货架稳定性和更稳定的功能表现[6]。

**益生菌后产物与类益生菌物质**
益生菌后产物和类益生菌物质是指由活细胞分泌的代谢物或细胞裂解后释放的物质，包括短链脂肪酸、肽、多糖、氨基酸和有机酸[7]。而类益生菌物质则是通过物理、化学或酶处理等灭活方法从益生菌菌株中获得的非活性微生物成分。与传统益生菌相比，这类方法可为产品配方提供更大的灵活性，并实现更可控、可重复的功能效果，尤其适用于工业和临床应用[6]。克鲁维酵母（K. lactis）被认定为安全菌株（GRAS），是研究益生菌后产物和类益生菌物质的理想模型。该酵母可产生β-半乳糖苷酶，主要用于无乳糖牛奶制品中；同时作为奶酪发酵的辅助菌种，可赋予产品温和、奶油味及轻微果香，市场上有多种商业化的菌种可用[8,9]。此外，其在乳清发酵中的应用还能将乳制品副产物转化为高附加值化合物[10]。虽然其工业价值显著，但相关研究也显示其对人体健康和微生物平衡具有积极作用[11,12]。然而，直接使用活的K. lactis菌株可能存在应用范围有限的问题，因此转向益生菌后产物和类益生菌物质成为一种有吸引力的替代方案。早期研究证实K. lactis衍生物具有抗氧化和抗菌特性[13]，进一步证实了其作为有益生物活性物质来源的潜力。

**材料与方法**
本次研究使用了从传统奶酪样品中分离出的14株K. lactis内源性菌株[21]，这些菌株的基因序列已录入GenBank（NCBI，美国马里兰州贝塞斯达；登录号PX444446-PX444459）。作为对照，还使用了S. cerevisiae var. boulardii ATCC MYA-796菌株进行初步的体外益生菌特性分析。酵母培养物在Yeast Peptone Dextrose (YPD; Merck, 德国达姆施塔特)培养基中于28°C下培养24–48小时。

**第一阶段：体外益生菌特性分析**
通过模拟胃肠道条件下的胃酸消化（GD）和胰酶消化（PD）实验评估菌株的存活能力，所用合成胃液和胰液配方根据Aydin等人的方法制备[13]。培养前后的活细胞计数通过平板计数法测定（使用Yeast Extract Glucose Chloramphenicol (YGC; Merck, 德国达姆施塔特)琼脂平板）。存活率（VI）计算公式如下：
$$\:VI\:\left(\%\right)=\frac{\text{l}\text{o}\text{g}\text{N}\:\left(\text{a}\text{f}\text{t}\text{e}\text{r}\:\text{t}\text{r}\text{e}\text{a}\text{t}\text{m}\text{e}\text{n}\text{t}\right)}{\text{l}\text{o}\text{g}\:\text{N}\:\left(\text{b}\text{e}\text{f}\text{o}\text{r}\text{e}\:\text{t}\text{r}\text{e}\text{a}\text{t}\text{m}\text{e}\text{n}\text{t}\right)}\:x\:100$$
总存活率（Overall survival）同样通过计算实验开始至胰酶消化结束时的活细胞对数值来表示：
$$\:Overall\:survival\:\left(\%VI\right)=\frac{\text{l}\text{o}\text{g}\:\text{N}\text{P}\text{D}\text{e}\text{n}\text{d}}{\text{l}\text{o}\text{g}\:\text{N}\text{i}}\:x\:100$$

**自聚性与细胞表面疏水性评估**
采用de Lima等人的方法[22]检测菌株与上皮细胞和黏膜表面的粘附能力，通过测量4小时和24小时培养后600 nm处的吸光度下降百分比来评估自聚程度。结果分为低自聚（<30%）、中等自聚（30–60%）和高自聚（>60%）。细胞表面疏水性通过600 nm处的吸光度计算，分为低疏水性（<25%）、中等疏水性（25–50%）和高疏水性（>50%）。

**抗氧化活性分析**
采用2,2-二苯基-1-picrylhydrazyl (DPPH; Sigma-Aldrich, 美国密苏里州圣路易斯)作为抗氧化指标。菌株在YPD培养基中28°C下培养48小时后进行离心（2150 x g，4°C，10分钟），用磷酸钠缓冲液（50 mmol/L，pH 6.0）洗涤两次，然后重悬至0.5 McFarland浓度。将800 μL酵母悬浮液与1 mL 0.2 mM DPPH甲醇溶液混合，在25°C下避光培养30分钟。没食子酸溶液作为阳性对照，吸光度在517 nm处测量[2]。结果通过扣除无菌YPD培养基的背景值进行校正，抑制百分比计算公式如下：
$$\:\text{D}\text{P}\text{H}\:\text{s}\text{c}\text{a}\text{v}\text{e}\text{n}\text{g}\text{i}\text{n}\text{g}\:\text{a}\text{c}\text{t}\text{i}\text{v}\text{i}\text{t}\:\left(\%\right)=1-\frac{\text{A}517\left(\text{y}\text{e}\text{a}\text{s}\text{t}\:\text{s}\text{u}\text{s}\text{p}\text{e}\text{n}\text{s}\text{i}\text{o}\text{n}\right)}{\text{A}517\:\left(\text{c}\text{o}\text{n}\text{t}\text{r}\text{o}\text{l}\right)}\:x\:100$$

**统计分析**
每株菌株分别制备两个独立培养物以确保持生性的重现性，每个重复三次。数据经单因素方差分析（one-way ANOVA）处理，差异通过JMP Pro 16.0软件中的Tukey Honestly Significant Difference (HSD)检验（P < 0.05）进行评估。根据存活率和活性水平将菌株分类为0、1或2（见表S1）。通过Bartlett检验确认数据适合进行主成分分析（PCA）[24]。筛选出具有优异体外益生菌活性的菌株进行后续分析。

**第二阶段：益生菌后产物与类益生菌物质的制备**
采用Garcia等人的方法[25]进行制备，略有修改。将5种具有优异益生菌潜力的K. lactis菌株在YPD培养基中28°C下复活24小时，随后在70°C水浴中热灭活30分钟。灭活后的细胞通过离心（2150 x g，10分钟）收集，上清液通过0.22 μm膜过滤器过滤。细胞用0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4）洗涤。无菌上清液称为“益生菌后产物样本”，热灭活后的细胞沉淀物称为“类益生菌样本”用于进一步分析。整个制备流程详见图S1（补充文件）。此步骤后未对益生菌后产物或类益生菌物质进行额外热处理。为验证无活性细胞，将样本接种在YGC琼脂上并在28°C下培养48小时。非活性样本保存在-18°C。

**酚类化合物含量与抗氧化活性测定**
益生菌后产物样本直接使用，类益生菌物质则在10、20和40 μg/mL浓度下进行检测。测定总酚类化合物含量（TPC）时，将每种样本与0.2 mL Folin–Ciocalteu试剂（Sigma-Aldrich, 美国密苏里州圣路易斯）混合10分钟，再加0.6 mL 20%碳酸钠溶液，30°C下孵育30分钟。吸光度在765 nm处测量。益生菌后产物的TPC值用相同条件下的无菌YPD培养基进行校正；类益生菌样本由于未使用培养上清液，则无需校正。使用没食子酸（0–200 mg/L）构建了校准曲线，结果以没食子酸当量（GAE）/L表示，反映了每体积液体样品中的酚类含量[26]。根据这个评估结果，选择了五种表现出最具前景的益生菌特性的酵母分离株，以便进一步制备和表征它们的后生物制品和副生物制品形式。图1：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图片。

通过主成分分析来选择最具前景的益生菌菌株：A. 变量的投影；B. 分离株的分布。AAC：自动聚集能力；AOA：抗氧化活性；GD：胃消化能力；HPBI：疏水性指数；OS：整体存活率；PD：胰腺消化能力。

**后生物制品和副生物制品的抗氧化活性评估**
选定的K. lactis菌株的总酚含量（TPC）和抗氧化活性（AOA）见表2。TPC值随着副生物制品浓度的增加而增加，直到20 μg/mL，之后没有观察到进一步的显著增长。后生物制品的TPC和AOA值明显高于其对应的副生物制品形式（20 μg/mL）。这些发现与Ayd?n等人[13]的报告一致，他们指出后生物制品的AOA显著高于K. lactis的完整细胞。对于后生物制品，TPC与DPPH清除活性（r = 0.9271）和TPC与ABTS清除活性（r = 0.5837）之间存在正相关。同样，副生物制品形式也显示出TPC与DPPH清除活性（r = 0.9602）和TPC与ABTS清除活性（r = 0.7970）之间的正相关。

表2：选定菌株的后生物制品/副生物制品的总酚含量和抗氧化活性
全尺寸表格

在测试的分离株中，ANO7在后生物制品（709.96 ± 8.21 mg GAE/L）和副生物制品（94.68 ± 0.32 mg GAE/L）形式中表现出最高的酚含量。尽管TPC值低于某些LAB（如Pedicoccocus acidilactici [37]和Lactiplantibacillus plantarum [38]）的后生物制品，但它们超过了S. cerevisiae [39]的记录值。另一方面，这些结果与K. marxianus、Pichia fermentans和Yarrowia lipolytica [20]的报告结果相当。不同酵母物种之间的差异可能反映了影响酚类衍生物和其他抗氧化代谢物生物合成的物种特异性代谢途径。相比之下，酵母来源的后生物制品与LAB来源的后生物制品之间的差异可能部分归因于这些微生物群体在细胞结构和代谢组织上的根本差异，这些差异可以影响酚类相关代谢物的性质和丰度[17]。

所有后生物制品都表现出强效的自由基清除活性（DPPH > 30%），如表1所总结的。随着副生物制品浓度的增加（最高至20 μg/mL），自由基清除活性有所增强；然而，更高的浓度并没有带来显著的额外效果。这表明抗氧化活性成分达到了饱和状态，20 μg/mL是实现最大DPPH和ABTS自由基中和的有效浓度。副生物制品的AOA低于活细胞悬浮液，突显了分泌代谢物的重要性，这些代谢物在后生物制品中更为集中。ANO7再次显示出最高的AOA，DPPH清除活性为61.14 ± 1.05%，ABTS清除活性为86.02 ± 1.25%。关于酵母后生物制品的ABTS活性的报告仍然较少；然而，Perpetuini等人[40]和Ayd?n等人[20]也观察到相对于DPPH更高的ABTS值。这种趋势与测试的化学选择性一致：DPPH主要检测亲脂性抗氧化剂，而ABTS可以检测亲水性和亲脂性化合物[41]。后生物制品和副生物制品因其增强产品功能的能力而日益受到认可，特别是通过提高抗氧化稳定性、延长保质期以及保持食品的营养和感官质量[42]。

**后生物制品和副生物制品中的酚类化合物评估**
通过LC-MS/MS和GC-MS鉴定出的化合物见表3。副生物制品的酚含量明显低于后生物制品，这与它们相对较低的TPC和AOA值一致。在后生物制品中检测到7种酚类化合物，而在副生物制品中检测到8种。槲皮素是两种制品中最丰富的酚类化合物，其次是没食子酸和3-羟基苯甲酸。Peonidin-3-O-葡萄糖苷仅在ANO 14副生物制品中被检测到，这可能导致粉红色色素的形成。尽管有几项研究考察了酵母来源后生物制品的AOA，但详细的代谢谱分析主要集中在S. boulardii [43, 44]和K. marxianus [20]上。

表3：后生物制品和副生物制品中的酚含量
全尺寸表格

Ayd?n等人[20]报告称，K. marxianus ETP12后生物制品含有更高水平的富马酸（19.13 ± 0.18 ppm）和奎宁酸（3.95 ± 0.05 ppm），较低的槲皮素含量（5.20 ± 0.21 ppm），以及相当的没食子酸含量（4.55 ± 0.16 ppm）。同样，Datta等人[43]报告称S. boulardii后生物制品包含香草酸、肉桂酸和苯乙基醇，而Fu等人[44]在酵母来源的后生物制品中鉴定出几种芳香化合物。此外，Demirgül等人[45]在S. cerevisiae、Kazachstania humilis和Torulaspora delbrueckii的生物量提取物中检测到没食子酸和槲皮素，而咖啡酸仅存在于S. cerevisiae中。在本研究中，槲皮素被鉴定为主要成分，并且其含量明显高于之前报道的水平。槲皮素以其抗炎和神经保护作用而闻名[46]。没食子酸在本文中也十分丰富，具有广泛的生物活性，包括抗癌、抗溃疡生成、抗菌和抗真菌特性，并因其强大的自由基清除能力而被广泛用作天然防腐剂[47]。3-羟基苯甲酸也与抗菌、抗真菌、雌激素样和抗突变作用相关，并参与多种与黄酮类代谢相关的生化途径[48]。

酚类化合物以其强大的抗氧化作用和抑制致癌及突变的能力而受到关注[49]。这些代谢物的生物合成和分泌取决于每种微生物的酶库，这在不同物种和环境条件之间存在差异[50]。通常，酵母产生的酚类化合物比LAB少，这可能反映了酚类前体代谢和酶促转化能力的差异[17]。例如，P. acidilactici的后生物制品含有15种酚类化合物，其中主要的成分是没食子酸（52.90 ± 4.95 mg/L）、原花青素B2（20.36 ± 0.06 mg/L）和对香豆酸[51]。同样，L. plantarum ATCC 14,917的冻干后生物制品含有22种酚类化合物，主要以4-羟基苯甲酸（143.63 ± 12.04 mg/kg）、没食子酸（85.95 ± 9.68 mg/kg）和儿茶素（66.69 ± 0.50 mg/kg）为主[38]。虽然酚类化合物对观察到的抗氧化活性有显著贡献，但酵母来源的AOA不能仅仅归因于酚类化合物。先前的研究表明，生物活性肽、谷胱甘肽以及结构多糖（如β-葡聚糖和甘露聚糖）也可能发挥显著的自由基清除和金属螯合作用[16, 52]。需要进一步的研究，包括代谢组学和蛋白质组学分析、肽分级以及谷胱甘肽和细胞壁多糖的靶向定量，以阐明酵母来源后生物制品和副生物制品抗氧化潜能中的特定非酚类成分。

**生物膜形成的预防**
BIC值及其对应的浮游生长对照分别显示在表4和表S3中。值得注意的是，浮游生长的抑制作用很小，GI通常超过85%，所有值都保持在70%以上，这个阈值被广泛认为与类似研究中未经处理的对照组相当[35, 53]。与某些LAB[54]和S. boulardii[39]后生物制品不同，K. lactis后生物制品在抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌浮游细胞生长方面效果较差。Ozma等人[55]报告称，在益生菌酵母和LAB培养物中，酵母后生物制品对大肠杆菌的抗菌活性最低。我们的研究结果表明，观察到的生物膜生物量的减少不是由于非特异性生长抑制造成的。

表4：后生物制品对几种形成生物膜的病原体的生物膜抑制能力
全尺寸表格

据报道，来自益生菌酵母和LAB培养物的后生物制品具有抗菌活性，包括生物膜抑制和浮游生长抑制[4, 13, 54, 56]。在本研究中，K. lactis后生物制品对测试的病原体表现出明显的、依赖于菌株的生物膜抑制活性，如其BIC值所示（表4）。在测试的菌株中，ANO7对所有病原体的抑制率最高，分别为49.20 ± 3.89%、97.10 ± 1.54%、51.71 ± 2.52%和45.01 ± 1.57%。ANO14后生物制品也显示出显著的抗生物膜潜力，特别是对Staph. aureus ATCC 25,923（75.21 ± 3.17%）和C. sakazakii（44.60 ± 0.94%）。相比之下，ANO13和ANO23的抑制作用有限，大多数病原体的抑制率低于35%。ANO13对L. monocytogenes ATCC 13,932（5.87 ± 0.20%）和Ps. aeruginosa ATCC 27,853（15.36 ± 0.22%）的抑制作用最低。ANO7后生物制品的优越BIC可能主要归因于其高含量的没食子酸和槲皮素。这些化合物具有公认的抗生物膜和群体感应抑制作用[57]。它们可以干扰细菌信号传导，减少构成生物膜黏附性和结构基础的胞外聚合物的产生，从而抑制附着和成熟过程[58]。此外，已知它们能调节Ps. aeruginosa和Staph. aureus中的酰基-高丝氨酸内酯介导的信号传导[59]。酵母来源的后生物制品含有多种外代谢物，包括酶、肽和抗菌化合物，这些都可能有助于BIC[60]。酚类成分分析显示，后生物制品主要以槲皮素、没食子酸和3-羟基苯甲酸为主，这些化合物已被报道可以通过防止细菌附着和抑制群体感应途径来抑制生物膜的形成[61,62,63]。需要进一步的研究来阐明BIC的潜在机制，特别是通过研究群体感应相关的基因表达。

**FAA评估**
由于在先前的评估中发现了ANO7后生物制品的卓越功能特性，因此选择了它进行FAA分析。评估其EAA组成、整体蛋白质质量和潜在的健康益处。总蛋白质含量为3.36 ± 0.04%，表明蛋白质成分含量显著。大多数EAA的浓度超过了FAO/WHO[30]的参考标准，表明EAA组成平衡良好。支链氨基酸谱中亮氨酸占主导，约占总支链氨基酸含量的一半。亮氨酸在营养上非常重要，因为它在激活肌肉蛋白质合成途径中起关键作用[67]。另一方面，组氨酸被确定为主要的限制性氨基酸，导致EAA指数为88.1%，化学得分为49.7%。尽管存在这一限制，但整体氨基酸分布表明其具有较高的营养价值，如PER值（5.35）所示。该值显著高于之前报道的S. cerevisiae、T. delbrueckii和K. humilis来源的酵母生物量[45]，表明其具有更强的支持蛋白质合成的能力。ANO7后生物制品的FAA谱总结在表5中。其中含有39种必需和非必需氨基酸。其中，亮氨酸（3088.95 ± 134.45 mg/L）、赖氨酸（2154.19 ± 101.71 mg/L）和丙氨酸（1904.42 ± 55.22 mg/L）含量最高，同时检测到γ-氨基丁酸（GABA）（22.84 ± 2.14 mg/L）。最近，Ayd?n等人[20]报告称K. marxianus ETP12后生物制品的FAA谱与对照组相似，但在赖氨酸（3195.61 mg/L）和甘氨酸（2252.01 mg/L）的浓度上存在显著差异。同样，S. cerevisiae和T. delbrueckii的生物量提取物中也包含23种氨基酸，其中亮氨酸、缬氨酸和赖氨酸为主要成分[45]。Fu等人[44]在S. cerevisiae和S. boulardii中检测到26种FAA及其衍生物，表明菌株特定的FAA谱差异与氨基酸代谢途径的变化密切相关。这种代谢物组成的差异表明了酵母来源后生物制品的功能和生物活性潜力的菌株和物种依赖性[48]。需要进一步的研究来阐明不同菌株间后生物制品组成的代谢基础。

**表5：后生物制品ANO7的自由氨基酸谱**
全尺寸表格

亮氨酸有助于缓解与年龄相关的衰退和肌肉损失（Borack和Volpi [68]），赖氨酸具有抗病毒作用[69]，丙氨酸可以防止肌肉损伤和炎症[70]。GABA 主要通过 L-谷氨酸或其衍生物的不可逆脱羧反应合成，这一过程由谷氨酸脱羧酶介导。这种神经递质已被证明在缓解失眠和抑郁症状方面有效，而产生 GABA 的微生物主要归因于乳酸菌（LAB）[38]，相比之下，关于酵母衍生产物的研究相对较少[44, 71]。因此，K. lactis ANO7 后生物制剂中丰富的短链脂肪酸（FAAs）可能使其成为功能性饮料、多种食品和膳食补充剂中的理想选择。需要注意的是，这些结论仅基于体外观察结果，应视为未来应用研究的初步指标，而非在食品或营养补充剂系统中有效性的直接证据。

**结论**

本研究成功将 K. lactis ANO7 识别为乳制品来源的后生物制剂候选菌株。它表现出强大的体外益生菌特性，具有由槲皮素和没食子酸驱动的抗氧化活性，对关键食源性病原体具有显著的抗菌作用，并且含有丰富的营养成分相关的氨基酸，这些特性有望提升未来功能性食品的的营养价值。这些特点突显了酵母衍生后生物制剂在体外增强食品功能方面的潜力，能够在保留生物活性的同时提供非活益生菌的替代方案。然而，目前的研究结果仅限于体外分析，尚未进行细胞毒性或体内验证。代谢特征分析也仅针对部分生物活性成分，未全面评估短链脂肪酸及其他细胞外代谢物。未来的研究应包括细胞毒性评估、体内实验、全面的物理化学和代谢组学分析以及全基因组测序，以阐明该菌株的生物技术潜力。