一种来自亚马逊地区的灵芝菌株作为抗氧化蛋白的来源：浸渍发酵条件对菌丝体结构及生物活性的影响

《Brazilian Journal of Microbiology》：An Amazonian Ganoderma isolate as a source of antioxidant proteins: Influence of submerged fermentation conditions on mycelial architecture and bioactivity

　　摘要
Ganoderma sp. 1962是一种来自亚马逊地区的菌株，据报道具有生产生物活性化合物的潜力；然而，特定浸没发酵参数对菌丝结构以及蛋白质提取物的回收率和生物活性的影响仍不完全清楚。本研究评估了不同浸没发酵条件对Ganoderma sp. 1962中抗氧化蛋白回收率的影响。通过测序内部转录间隔区（ITS）并进行系统发育分析来进行分子鉴定。该菌株在四种营养组合下进行培养，同时采用振荡（A）和非振荡（NA）两种培养方式，共得到八种实验条件。使用扫描电子显微镜（SEM）和衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（FTIR-ATR）对菌丝生物量进行了结构表征。从菌丝生物量中提取的蛋白质提取物被分析了可溶性蛋白含量、总酚类化合物（TPC）和还原糖（RS）。抗氧化活性通过ABTS•+、DPPH•、金属螯合作用能力和还原能力测定进行评估。ITS rDNA序列的BLAST分析显示其与Ganoderma multiplicatum具有高度相似性（>98%的同一性），这一点随后通过使用GenBank中的参考序列进行了系统发育分析得到了证实。生物量产量介于5.57至8.73克/升之间，不同条件下的葡萄糖消耗量存在显著差异，而振荡培养条件下倾向于pH值升高。宏观形态学差异主要表现为振荡培养条件下的菌丝团块形成和静态条件下的菌丝聚集。微观形态学分析揭示了培养依赖性特征，包括非振荡条件下形成的短而高度分枝的“鹿角”状菌丝，而振荡培养条件下则促进了长而丝状的菌丝生长。FTIR-ATR分析显示样品之间的光谱差异显著，表明培养基组成对生物量的化学组成有强烈影响。实验3（非振荡条件，E3NA）产生的可溶性蛋白含量最高（218.35±16.95毫克/克提取物），而实验1（振荡条件，E1A）的RS（25.50±1.59毫克/克提取物）和TPC（31.96±1.39毫克GAE/克提取物）含量最高。E1A提取物显示出最强的抗氧化活性，其ABTS•+值为90.34±0.66%，DPPH•值为68.09±1.74%，还原能力值为0.335±0.011，这表明蛋白质-酚类和蛋白质-碳水化合物相互作用可能对抗氧化活性有贡献，相关分析也支持了这一观点。尽管非振荡发酵有利于可溶性蛋白的回收，但蛋白质-代谢物相互作用可能在抗氧化活性中起更重要的作用。总体而言，本研究为G. multiplicatum在浸没发酵条件下生产抗氧化蛋白的潜力提供了新的证据。

引言
Ganoderma属包括一组具有药用价值的蘑菇，它们因能够产生多种具有药理意义的生物活性化合物而受到广泛认可，这些化合物包括萜类、多糖、甾体、生物碱和蛋白质[1, 2]。其中，多糖和三萜类已经被广泛研究，而蛋白质和其他代谢物类别尽管具有重要的生物学潜力，但仍未得到充分探索[3]。来自Ganoderma的蛋白质包含多种对人类健康有益的功能类别。其中，真菌免疫调节蛋白（FIPs）因其免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗过敏、血凝和抗氧化等特性而受到特别关注[4]。在这种情况下，亚马逊地区代表着一个未探索的真菌多样性的重要宝库，提供了识别能够合成具有独特生物化学和功能特性的新菌株的潜力[5]。例如，Ganoderma sp. 1962这种菌株就是在巴西亚马孙州的马瑙斯分离出来的[6]。该菌株表现出显著的蛋白质合成能力，表现为培养后残留物中蛋白质含量的增加[6]，并且在培养于亚马逊木质纤维素残余物时能够产生具有药理意义的蛋白质，如纤维溶酶和蛋白酶抑制剂[7]。
比较Ganoderma sp. 1962与商业Ganoderma sichuanense菌株的研究发现，在浸没发酵过程中它们的菌丝生物量产量存在显著差异[8]。然而，需要强调的是，培养条件对蛋白质含量起着关键作用，而蛋白质含量并不总是与高菌丝生物量产量相关[9]。这种分离突显了不仅需要优化蛋白质回收的培养策略，还需要采用能够快速评估生物量组成的分析方法。在这方面，快速且非侵入性的分析技术变得越来越重要。傅里叶变换红外光谱（FTIR）已被证明是识别和表征生物聚合物和其他代谢物的有效工具[10]。特别是衰减全反射-FTIR（FTIR-ATR）技术可以实现与蛋白质相关的功能团的非破坏性分析，使其适用于成本效益高且可扩展的工业应用[11]。然而，仅仅化学组成并不能完全解释代谢物合成的差异，因为真菌的生理特性也受到浸没培养过程中形态组织的强烈影响。
与此同时，形态工程作为一种将真菌形态与特定代谢物合成相关联的方法也逐渐受到重视[12]。例如，相关研究表明，Ganoderma lucidum在浸没培养条件下通过改变细胞壁结构、形成菌丝团块以及合成富硒蛋白质来提高对亚硒酸钠的耐受性[13]。尽管已有报道描述了Ganoderma sp. 1962的蛋白质生产能力，但浸没发酵条件、菌丝结构与抗氧化生物活性之间的关系尚未明确建立。因此，本研究旨在探讨特定的浸没发酵条件如何调节菌丝形态、生物量组成以及从亚马逊地区Ganoderma菌株中获得的富含蛋白质提取物的抗氧化特性。通过结合微观分析、生物化学表征和抗氧化测定，本研究试图阐明培养条件、菌丝结构与浸没培养条件下真菌提取物的抗氧化活性之间的关系。

材料与方法
**生物材料与分子鉴定**
Ganoderma sp. 1962这种大型真菌由巴西亚马孙州马瑙斯国立亚马逊研究院（COTEI-INPA）的可食用真菌培养实验室提供。该菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上保存和常规处理。浸没发酵在pH 6.0的葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨（GYP）培养基中进行，培养温度为25°C，持续10天，条件与之前报道的Ganoderma spp. 相同[9]。采用静态条件是为了获得标准化的菌丝生物量，因为振荡培养通常会促进多糖积累，从而干扰DNA提取的效率和纯度。回收的菌丝生物量在液氮中浸泡，然后按照Invitrogen?公司的PureLink?基因组DNA试剂盒的说明书提取基因组DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳评估DNA的完整性和提取效率。使用ITS1/ITS4和ITS5/NL4引物对通过聚合酶链反应（PCR）扩增ITS区域，扩增产物在0.8%琼脂糖凝胶上进行分析。使用BigDye? Terminator v3.1试剂盒在3500 Genetic Analyzer仪器上进行测序。使用Phred质量评分评估序列质量，并将正向和反向读长组装成共识序列。将所得序列与NCBI数据库中的参考序列进行BLASTn比对。本研究中生成的ITS序列被存入GenBank，登录号为PX736081。

**系统发育树构建**
系统发育树采用MEGA X软件中的最大似然法构建，使用Kimura 2参数模型和离散Gamma分布（+G）来考虑位点间的变异率，并进行了1000次自助法重复。树状图使用iTOL v7软件可视化。数据集包括来自NCBI/GenBank的Ganoderma物种的ITS序列，优先考虑类型衍生或参考序列（在线资源1），并以Tomophagus colossus作为外群[14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44]。

**浸没发酵**
使用在PDA培养基上生长的Ganoderma sp. 1962作为接种物进行浸没发酵。将七个直径为7毫米的菌丝盘接种到装有125毫升不同成分培养基（见表1）的250毫升Erlenmeyer烧瓶中，培养基的pH值为6.0。烧瓶在25°C下培养12天，分别采用120 rpm的振荡（A）和非振荡（NA）条件，共得到八种实验条件，这些条件基于我们研究小组之前报道的培养参数[9]。每种实验条件准备了25个Erlenmeyer烧瓶，以确保有足够的生物量用于后续分析。

**生产参数**
发酵结束后，随机选择每种条件下的三个烧瓶作为独立生物重复样本，用于确定生产参数。将内容物在20°C下离心（10,000 rpm，10分钟）以分离菌丝生物量与发酵液。菌丝生物量产量（克/升）根据60°C烘烤后的干重进行估算。通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定发酵液中的还原糖（RS）来计算葡萄糖消耗量。为此，使用了三个未接种培养基的烧瓶作为初始对照（第0天），并通过从第12天的RS浓度减去初始值来计算葡萄糖消耗量[9]。剩余的Erlenmeyer烧瓶用于蛋白质提取和后续分析。

**形态分析**
发酵结束后，通过数字摄影记录真菌的宏观形态。对于微观形态分析，将天然状态的菌丝生物量片段（约0.5厘米）固定在改良的Karnovsky溶液中（2%甲醛和2.5%戊二醛，0.2 M Sodium cacodylate缓冲液，pH 7.4），在室温（25°C）下固定24小时。样品在0.2 M Sodium cacodylate缓冲液（pH 7.4）中洗涤四次，然后在含有1%锇酸盐和0.8%铁氰化钾（1:1，v/v）的溶液中固定2小时。样品通过分级乙醇系列（30%、50%、70%、80%、90%及三次100%）脱水20分钟，最后使用Leica EM CPD300进行临界点干燥。干燥后的材料使用碳带固定在铝芯上，并用Leica EM ACE600仪器以大约10纳米的厚度喷涂铂。使用扫描电子显微镜（JEOL JSM IT500HR）在5 kV的加速电压下以二次电子模式获取显微照片。形态学观察结果进行了定性评估，并结合生化学成分和抗氧化活性数据进行了解读。红外光谱分析采用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱仪（FTIR-ATR，Cary 630）在4000至400 cm?1的光谱范围内进行，分辨率为8次扫描。简要来说，每种冻干并研磨后的菌体生物量各5毫克在室温（25°C）下进行分析，每次测量前都会收集背景光谱。光谱数据来自代表每种实验条件的混合菌体样本[11]。

蛋白质提取将菌体生物量（5克）置于0.15 M氯化钠（1:20 w/v）溶液中，在120 rpm转速下搅拌2小时，温度为10°C。之后将样品离心（10,000 xg，20分钟，4°C），并在4°C下使用12 kDa分子量截留的纤维素膜对上清液进行48小时透析，以分离出中等到高分子量的蛋白质组分。最后，再对透析后的样品进行离心（4.667 xg，20分钟，4°C），然后进行冻干[9]。

生物分子定量蛋白质浓度采用Bradford方法[45]进行测定，该方法适用于96孔板，并使用牛血清白蛋白（BSA）标准曲线进行校准。总酚类化合物（TPC）含量通过Folin-Ciocalteu方法测定，结果以每克样品中的没食子酸当量（GAE）表示[46]。还原糖的定量使用DNS方法进行，其值基于葡萄糖标准曲线估算[9]。所有测量均重复三次进行。

抗氧化活性蛋白质提取物（5毫克/毫升）的抗氧化活性通过2,2′-偶氮双（3-乙基苯并噻唑琳-6-磺酸）（ABTS•+）、2,2-二苯基-1-吡啶肼（DPPH•）、亚铁离子螯合能力以及铁还原抗氧化能力（FRAP）测定法进行评估，这些方法均适用于96孔微孔板。在还原能力测定中，吸光度增加表明抗氧化潜力更强[47]。所有测定均重复三次进行。

实验设计和统计分析实验采用完全随机设计，采用4×2因子方案（四种培养基×两种培养条件）。所有定量分析均重复三次，并进行方差分析（ANOVA）。使用Statistica 7软件通过Tukey检验在1%的显著性水平（p < 0.01）下比较各组均值。FTIR-ATR数据通过主成分分析（PCA）进行化学计量处理，并使用OriginPro 2025软件进行了生物分子与抗氧化活性之间的相关性分析。

分离株的鉴定所得序列与Polyporales目内的真菌高度相似，特别是与Ganoderma属的物种相似，这与NCBI数据库中存储的序列进行了比较。最高相似度见于Ganoderma sp.菌株CIRM-BRFM 1410和2361（99.10%的同一性；100%查询覆盖率；E值0.0），以及G. multiplicatum分离株CC8（98.74%的同一性；100%查询覆盖率；E值0.0）和Dai 17,395（98.73%的同一性；99%查询覆盖率；E值0.0）。在使用代表性Ganoderma序列构建的系统发育树中，亚马逊分离株与G. multiplicatum聚集在同一分支中（图1）。

图1：该图片的替代文本可能由AI生成。基于ITS区域序列的最大似然系统发育树，显示了亚马逊分离株Ganoderma multiplicatum 1962的位置（用橙色标出）。节点处的Bootstrap值（1000次重复）已标示。Tomophagus colossus被用作外群。

生长参数不同发酵条件下培养的G. multiplicatum 1962的菌体生物量范围为5.57 ± 0.89克/升（E3NA）至8.73 ± 0.16克/升（E4NA）（图2a）。G. multiplicatum的葡萄糖消耗量从4.44克/升（E3NA）变化到13.40克/升（E4NA）（图2b）。所有评估条件均观察到中等程度的酸化，其中搅拌培养的最终pH值较低（图2c）。E1A条件下的pH值最低（3.00 ± 0.08），而E3NA条件下的pH值最高（4.85 ± 0.27）。E4NA和E4A条件下的生物量生产和葡萄糖消耗量最高（图2d）。

图2：该图片的替代文本可能由AI生成。不同淹没发酵条件下培养的Ganoderma multiplicatum 1962的生产参数。(a) 干燥生物量，(b) 发酵过程中的葡萄糖消耗量，(c) 最终pH值，以及(d) 总结评估生产参数的雷达图。数据表示为平均值±标准差（n = 3）。条形图上方的不同字母表示根据单因素ANOVA及后续Tukey检验结果，处理组之间存在统计学上的显著差异（p < 0.05）。

真菌形态在搅拌条件下，G. multiplicatum表现出颗粒状生长，其特征是具有光滑表面的球形结构。相比之下，静态培养条件下则形成交织的菌体聚集体，分散在培养基表面（图3）。不同条件下的颗粒大小各异：E1A条件下颗粒大小不一，E2A主要为小颗粒，E3A为中等至大颗粒，E4A为中等大小的颗粒（图3）。还观察到了培养基颜色的变化，某些条件下出现了铜色调的培养基。在搅拌培养中，尤其是在实验2和3中，菌体团块附着在Erlenmeyer烧瓶壁上（图3）。

图3：该图片的替代文本可能由AI生成。不同淹没发酵条件下培养的Ganoderma multiplicatum 1962的大形态。图1-4实验中搅拌和非搅拌条件下菌体生长的代表性图像。

微形态学观察在不同培养条件下观察到差异。搅拌培养的菌体表现出长而坚硬的管状菌丝，而静态培养则显示出短而高度分枝的“鹿角”状菌丝（图4）。在E1A、E2NA、E3A和E4A中观察到菌丝上沉积的小型装饰性球形结构（图4i, j, m, o, p）。在E1A、E2NA和E4NA中观察到与菌丝相关的光滑表面球形结构（图4q, t, x）。除了E1A条件外，所有实验条件下均观察到菌丝间的夹持连接（图4）。在E2NA和E3NA中鉴定出卵孢子（图4t, x）。在所有培养条件下都观察到覆盖菌丝的蜘蛛网状细胞外基质（ECM）结构（图4）。

图4：该图片的替代文本可能由AI生成。不同淹没发酵条件下培养的Ganoderma multiplicatum 1962菌体生物量的微形态。扫描电子显微镜（SEM）图像显示了四种实验设置下菌丝的整体组织和特化菌丝结构（a–h）。彩色箭头指示特定的形态特征：深绿色表示管状菌丝；红色表示鹿角状菌丝；橙色表示装饰性球形结构；浅绿色表示光滑表面的球形结构；粉色表示夹持连接；浅蓝色表示卵孢子；黄色表示细胞外基质。

FTIR和化学计量分析FTIR-ATR分析显示所有处理组的吸收带轮廓一致，不同发酵条件下获得的菌体生物体之间具有相似的光谱模式（图5a）。不同条件间的吸光强度存在差异，尤其是E3A和E1A显示出最高的吸光值。光谱在3270（O–H和N–H伸缩）、2924（C–H伸缩）、1624（酰胺I，C = O伸缩）和1544 cm?1（酰胺II，N–H弯曲）处显示出明显的吸收峰，以及在1403–1236 cm?1（C–H弯曲和C–N伸缩）和1143–1023 cm?1（C–O伸缩）处也有吸收带。895 cm?1处的带是β型糖苷键的特征（图5a）。主成分1（PC1）解释了总方差的97.1%，并在PCA图中沿X轴分离了样品（图5b）。加载分析表明1150至950 cm?1的光谱区域对样品分离贡献最大。

图5：该图片的替代文本可能由AI生成。(a) 不同淹没发酵条件下获得的Ganoderma multiplicatum 1962菌体生物量样本的FTIR-ATR光谱；(b) 基于光谱数据的主成分分析（PCA）得分图。A.U.：吸光单位。A：搅拌；NA：非搅拌；E：实验（1–4）。

蛋白质提取物的特征蛋白质提取物的微结构分析显示不同发酵条件之间存在明显的形态差异。E1A条件下的菌体呈现出高度碎片化的形态，由边缘不规则的层状片状结构组成。E4A和E4NA也观察到了类似但不那么碎片化的特征。相比之下，E1NA、E2A和E2NA的提取物显示出较大、较薄且分布更均匀的层状结构。E3A和E3NA呈现第三种微结构模式，其特征是紧凑且聚集形成的密集团块或颗粒（图6）。

图6：该图片的替代文本可能由AI生成。不同淹没发酵条件下培养的Ganoderma multiplicatum菌体生物量提取物的扫描电子显微照片，突出了碎片化模式的变化。搅拌（A）和非搅拌（NA）条件下提取物的代表性图像。E：实验（1–4）。

生化学成分在静态条件下获得的提取物中可溶性蛋白质含量较高，特别是在E3NA中，其含量达到218.35 ± 16.95毫克/克提取物（图7a）。相比之下，搅拌条件下观察到较高的酚类化合物和还原糖含量（图7b, c）。E3NA显示出最高的蛋白质百分比，而E1A的蛋白质含量最低（图7c）。尽管E1A的蛋白质浓度最低（80.03 ± 13.37毫克/克提取物），但它表现出最高的还原糖（25.50 ± 1.59毫克/克提取物）和总酚类化合物（31.96 ± 1.39毫克GAE/克提取物）含量（图7a–c）。考虑相对生化学组成时，这一模式也得到了体现（图7d）。

图7：该图片的替代文本可能由AI生成。不同淹没发酵条件下Ganoderma multiplicatum蛋白质提取物中(a) 可溶性蛋白质，(b) 还原糖，(c) 总酚类化合物，以及(d) 这些生物分子的相对百分比组成的数据。数据表示为平均值±标准差（n = 3）。条形图上方的不同字母表示根据单因素ANOVA及后续Tukey检验结果，处理组之间存在统计学上的显著差异（p < 0.05）。

抗氧化活性提取物E1A表现出最高的自由基清除活性，其抑制值分别为90.34 ± 0.66%（ABTS•+）和68.09 ± 1.74%（DPPH•）（图8a, b）。所有样本的金属螯合活性较低，E3NA的值最高（44.66 ± 1.97%）（图8c）。在铁还原抗氧化能力（FRAP）测定中，E1A显示出最高的吸光度（0.335 ± 0.011）（图8d）。

图8：该图片的替代文本可能由AI生成。不同淹没发酵条件下培养的Ganoderma multiplicatum蛋白质提取物的抗氧化活性，通过(a) ABTS•+，(b) DPPH•，(c) 金属螯合能力和(d) 还原能力进行评估。数据表示为平均值±标准差（n = 3）。条形图上方的不同字母表示根据单因素ANOVA及后续Tukey检验结果，处理组之间存在统计学上的显著差异（p < 0.05）。

进行了Pearson相关性分析，以评估蛋白质含量、总酚类化合物、还原糖和抗氧化活性之间的关系（图9）。总酚类化合物和还原糖与ABTS•+、DPPH•和还原能力呈正相关。相比之下，金属螯合活性与可溶性蛋白质含量呈正相关。

图9：该图片的替代文本可能由AI生成。Pearson相关矩阵展示了不同淹没发酵条件下可溶性蛋白质含量、酚类化合物、还原糖和抗氧化活性（ABTS•+、DPPH•、金属螯合能力和还原能力）之间的关系。颜色强度代表了Pearson相关系数（r）的大小和方向。

尽管之前已经获得了纯真菌培养物，并根据大形态特征初步鉴定为Ganoderma sp. 1962，但至今尚未报告该分离株的分子鉴定数据[6]。鉴于Ganoderma属内基于形态的鉴定存在局限性，因为该属具有高度的表型可塑性，因此需要分子标记才能实现准确的物种水平鉴定。在这种情况下，内部转录间隔区（ITS）已被确立为真菌鉴定的通用DNA条形码[48]。ITS测序在Ganoderma物种及其商业产品的鉴定和认证中的有效性已有充分文献记载，能够可靠地分析不同类型的样本，包括新鲜菌体和脱水材料[41, 49, 50]。G. multiplicatum是一种新热带物种，最初在巴西被描述，以其形态变异性而闻名，这导致了历史上将其误鉴定为G. lucidum[51]。在巴西，该物种已在多个州被报道，包括Alagoas、Amazonas、Mato Grosso do Sul、Pará、Rio de Janeiro、Paraíba、Rond?nia和Roraima。在Amazonas州，已在Humaitá、Barcelos和Manaus等市镇有记录[52, 53]。先前的研究报道了该物种对人类病原体的抗微生物潜力，以及对乳腺、肺、宫颈和结肠肿瘤细胞的抗增殖作用[54, 55]。然而，这些研究主要集中在从野生采集的子实体中提取的次级代谢产物和多糖上。专门研究G. multiplicatum在淹没发酵条件下产生的生物活性蛋白质的研究仍然有限。

本研究获得的生物量值高于Silva等人[8]的报告结果，他们记录在同一菌株在Melin-Norkrans Modified（MNM）和Polysaccharide（POL）培养基中淹没发酵14天后的最大产量为4.5克/升。这种增强的生物质积累可能与培养基成分的差异有关，特别是使用了容易吸收的有机氮源，如酵母提取物和大豆胨，这些来源可以通过提供氨基酸和肽来降低氮同化的代谢成本[56]。此外，在所评估的条件下，不添加无机盐可能也有助于促进生长，因为类似的趋势在Ganoderma curtissii的 submerged 发酵中也有所报道[57]。培养基的组成似乎是影响生物质生产的主要因素，因为在相同培养基条件下，搅拌和静置条件之间没有观察到统计学上的显著差异。这与之前对G. sichuanense CC22的研究结果一致[9]，即葡萄糖浓度为20 g L?1时比10 g L?1时观察到更高的生物质积累，无论大豆胨的浓度如何。这种趋势可能与碳氮比（C:N）的差异有关，在所评估的条件下，较高的碳可用性支持了菌丝生长和生物质形成。葡萄糖被广泛认为是Ganoderma菌丝生长和生物分子生产的关键碳源[58]，因此是一个重要的评估参数。相比之下，G. sichuanense CC22是一种与稳定生长和生产性能相关的驯化菌株，在submerged 发酵条件下，其葡萄糖消耗量被报道约为8 g L?1[9]。相比之下，这里评估的野生亚马逊分离株表现出更高的葡萄糖消耗量，表明其碳代谢更为活跃。这一观察可能反映了野生和驯化菌株在代谢行为上的差异，突显了野生Ganoderma分离株在生物过程开发中的潜在价值。在submerged Ganoderma培养中，葡萄糖消耗量在5到10 g L?1之间通常被认为是较高的，并且与有机酸的产生有关，导致pH值相应下降[59]，在本研究中也观察到了这一现象，尤其是在搅拌条件下。已知在葡萄糖存在的情况下进行submerged 发酵的担子菌会产生草酸和L-苹果酸等有机酸，以及三羧酸循环的低分子量中间产物[60]。此外，Ganoderma物种可以合成统称为灵芝酸的次级代谢物，这些代谢物可能进一步促进培养基的酸化[61]。

E3NA处理条件下的生物质产量最低，并且与葡萄糖吸收减少和pH值变化较小相关。对于G. sichuanense CC22也有类似的发现，在静置培养条件下，由于缺乏混合和均质化机制，导致营养物质分布受限，从而产生较低的生物质产量[9]。在这种情况下，C:N比是影响培养蘑菇菌丝生长和代谢产物产生的一个公认因素[62]。培养基的组成和搅拌条件已知会影响submerged 发酵过程中的颗粒形成、真菌形态以及目标产物的合成[63]。观察到的颗粒大小变化与培养基成分导致的培养液物理化学性质的变化有关，正如先前的研究中所描述的[64]。培养基颜色的变化可能与色素合成有关，如在含有胨的G. lucidum培养中观察到的情况[65]，或者与培养基成分的酶促降解有关[66]。菌丝簇对烧瓶壁的粘附可能会对菌丝生物量的产生产生负面影响。这种现象发生在菌丝从颗粒上脱落时，由于离心力和剪切力的作用，无法重新形成颗粒状生长，随后粘附在玻璃表面上[67]。在G. lucidum的submerged 发酵过程中也观察到了类似的现象，其中菌丝片段在玻璃-菌丝界面呈现一层富含碳水化合物的凝胶状物质，这通常与胞外多糖的产生有关[67, 68]。在搅拌和静置培养条件下观察到的菌丝显微形态差异与之前对Ganoderma属的描述一致[69,70,71]。在静置培养条件下出现的鹿角状菌丝之前已在G. sichuanense中报道过，这与对氧气限制的生理响应有关。在非搅拌条件下，扩散受限的氧气传递可能导致局部缺氧微环境，从而促进菌丝分支的增加。这种形态差异可能增加与培养基接触的表面积，有助于菌丝向空气-液体界面的扩展，可能有利于在低氧条件下的生长，并触发适应性代谢响应，包括细胞内蛋白质积累的增加[72, 73]。本研究中发现的装饰性球形结构在G. sichuanense中已有描述，可能与生物分子或营养物质的储存有关，可能是由菌丝液泡化引起的[74, 75]。与菌丝相关的光滑球形结构（细胞角质层）以及观察到的夹紧连接，对应于在Ganoderma物种的submerged 培养中已报道的特征性形态特征[69, 75,76,77]。卵孢子的存在可能表明对不利条件的适应性响应，并且与表现出耐热性的快速生长表型相关[78, 79]，这与本研究中观察到的生产模式一致。蛛网状结构对应于其他担子菌submerged 培养中描述的细胞外基质（ECM）。ECM由蛋白质、碳水化合物和脂质聚合物组成，可以促进粘附、保护和养分储存[80, 81]。FTIR-ATR吸收光谱的变化表明，特定的培养条件可能影响了细胞内生物分子的积累，而与总体生物质产量无关。其他Ganoderma物种的子实体也观察到了类似的光谱特征，通常与蛋白质、多糖（β-葡聚糖和几丁质）和萜类化合物（包括灵芝酸和 lucidenic 酸）相关[10]。1150至950 cm?1之间的光谱区域对样品之间的化学区分贡献最大，这与归因于碳水化合物和萜类相关结构的带状谱峰一致，包括Ganoderma次级代谢物相关的谱峰。这些信号通常与C–O伸缩、C–CH3振动和环变形有关[82]。

对蛋白质提取物进行扫描电子显微镜（SEM）分析（图6）显示，E1A处理条件下的微观结构高度破碎，这表明存在较小的颗粒组装体，这些颗粒组装体已知会影响蛋白质材料的功能性能[83]。颗粒大小是影响蛋白质溶解度的重要因素，因为较小的颗粒通常具有更大的表面积，有利于水合和溶剂相互作用[84]。尽管本研究中没有直接量化平均颗粒大小，但E1A条件下的微观结构特征表明，这种条件可能有利于生成溶解度和分散性更好的蛋白质提取物。从应用角度来看，这些方面是相关的，因为颗粒大小和微观结构组织与蛋白质提取物的技术和生物功能特性有关，影响其工业应用的潜力[85, 86]。尽管E3NA处理的真菌生长最低，但其可溶性蛋白质含量最高。相比之下，之前对G. sichuanense的研究表明，类似于E3NA的条件与较低的生物质和蛋白质产量相关，这可能是由于C:N比接近1:1[9]。这种比较表明，在低C:N比下蛋白质积累可能涉及不同Ganoderma物种之间的不同代谢响应。富含氮的条件会增加氮同化和氨基酸生物合成的能量需求，并且已知会限制真菌生长，同时有利于蛋白质合成。因此，基于有机氮源的培养基通常具有较低的C:N比，被认为有利于蛋白质积累[56, 87]。在非搅拌条件下观察到的较高蛋白质回收率与之前的发现一致。当对G. sichuanense评估相似的培养基和生长条件时，也报告了静置培养中蛋白质回收率增加的趋势，其值达到大约400 mg g?1的提取物[9]。这一观察结果与缺乏剪切力有关，因为在搅拌条件下剪切力可能会促进细胞损伤和细胞内容物的泄漏[72]。本研究中蛋白质的定量主要是为了比较不同发酵条件下的结果。然而，与其他研究中报告的绝对蛋白质值进行直接比较时应谨慎，因为蛋白质-代谢物复合物的形成可能会干扰比色测定，例如Bradford方法。该测定依赖于Coomassie Brilliant Blue与碱性及芳香族氨基酸残基的相互作用；然而，蛋白质与酚类化合物或糖基化基团的结合可能会部分掩盖染料结合位点，从而导致蛋白质含量的低估[88, 89]。可溶性蛋白质含量与FTIR吸收光谱之间没有观察到一致的关系，这可能归因于菌丝生物质中存在的不溶性成分[90]。在Ganoderma物种中，多糖和萜类是主要成分之一，它们可以显著影响红外光谱，可能掩盖与可提取蛋白质、酚类化合物和碳水化合物相关的变化[91]。在静置条件下观察到的较高可溶性蛋白质积累似乎与短鹿角状菌丝有关（图4b, d, f, h）。这种菌丝形态与气生菌丝的发展有关，这代表了一种旨在改善养分（包括氧气）获取的生长策略[69, 92]。在G. sichuanense中也报告了在静置条件下培养的菌丝中蛋白质积累的增加，这种差异化的菌丝形式被解释为对环境条件的适应性响应，可能会直接或间接调节生物分子合成[72]。由于这些蛋白质提取物倾向于与低分子量化合物（如酚类化合物和碳水化合物）共沉淀，因此对其的表征可能具有挑战性[93]。尽管预期透析可以去除这些物质，但当它们与蛋白质结合时，这一过程可能无效[94]，这种情况可能在当前研究中发生过。然而，蛋白质-酚类和/或蛋白质-碳水化合物复合物的形成可以改变蛋白质的性质，并可能增强其生物活性，包括抗氧化活性[95, 96]。酚类化合物可能作为化学屏障，通过非共价相互作用限制蛋白质氧化并增强构象稳定性[97]。同时，碳水化合物通过维持水合层和提供保护来稳定蛋白质，防止物理化学应力（如脱水、冷冻和热变性），这些机制在制药和生物技术配方中得到了广泛应用[98]。在这种情况下，E1A提取物中较高的酚类化合物和碳水化合物浓度可能有利于形成稳定的分子组装体，从而保持蛋白质的完整性并增强其功能性能。在E1A条件下获得的蛋白质提取物中观察到的破碎组织可能与总酚类化合物（TPC）和碳水化合物含量较高有关，这可能会干扰蛋白质-蛋白质聚集并阻碍紧凑结构的形成。这一观察与之前对G. sichuanense蛋白质提取物的描述一致[69, 72]。在本研究中观察到的抗氧化活性谱表明，仅蛋白质浓度并不能解释G. multiplicatum蛋白质提取物的抗氧化潜力。E1A提取物的优异抗氧化性能可能与其独特的微观结构组织有关，正如SEM所揭示的，以及总酚类化合物（TPC）和还原糖含量的较高。在之前的研究中，Espinosa-García等人[54]报告了在两阶段submerged 发酵下培养的Ganoderma有机提取物具有较低的抗氧化潜力，这与较低的TPC含量（13 mg GAE g?1）相关。这些发现表明，培养条件的差异可能会影响抗氧化相关化合物的积累。Gu等人[99]还报告了使用ABTS•+测定法评估时G. lucidum肽的抗氧化活性高于DPPH•，这支持了ABTS•+法适用于评估主要是亲水性化合物的适用性。本研究中观察到的低螯合活性可能与羟基（–OH）、巯基（–SH）和羧基（–COOH）等功能基团的减少可用性有关，这些基团参与金属离子的络合[100]。获得的还原力值与G. lucidum的报告相当，在20 mg mL?1的水溶性孢子提取物[101]和多糖组分[102]中观察到的吸光度值约为0.3。观察到的相关性表明，蛋白质提取物中的抗氧化活性可能来源于生化关联，而不仅仅是单个化合物的作用。基于氧化还原的测定与酚类化合物和还原糖强烈相关，支持了蛋白质-酚类和蛋白质-碳水化合物相互作用对抗氧化性能的贡献。相比之下，蛋白质含量与金属螯合活性之间的正相关表明蛋白质在非氧化还原抗氧化机制中的潜在作用。这些发现支持了提取物中抗氧化活性是多因素共同作用的结果。在灵芝属（Ganoderma）中，已有多种基于蛋白质的化合物被报道具有抗氧化活性，包括富硒蛋白质、抗氧化酶、蛋白多糖、糖肽和蛋白质提取物，这突显了它们在制药领域的应用潜力[103,104,105,106,107]。因此，正如本研究中所观察到的那样，回收具有显著抗氧化活性的蛋白质组分是一种有前景的策略，可以为灵芝衍生产品增加价值，尤其是那些来自未充分研究的亚马逊地区分离物的产品。值得注意的是，本研究提供了来自巴西亚马逊地区的G. multiplicatum具有抗氧化蛋白潜力的证据。

**结论：**
真菌分离株1962被鉴定为G. multiplicatum，其生物量组成和微观形态受到 submerged 培养条件的显著影响。静态培养促进了不同的菌丝结构，包括鹿角状结构，这些结构与较高可溶性蛋白质的回收率密切相关。相比之下，在含有10 g L?1葡萄糖、5 g L?1酵母提取物和2.5 g L?1大豆胨的培养基中，在搅拌条件下培养得到的蛋白质提取物表现出优于其他条件的抗氧化性能。这一结果归因于蛋白质、酚类化合物和碳水化合物的同步回收，有助于形成具有增强功能活性的蛋白质-代谢物复合物。这些发现表明，搅拌驱动的 submerged 培养是一种可行的策略，可用于从亚马逊地区的G. multiplicatum 中获得富含抗氧化蛋白的提取物。