对从腹泻型肉鸡中分离出的轮状病毒A、D和F株的VP6基因进行了部分核苷酸序列分析

《Brazilian Journal of Microbiology》：Partial nucleotide sequence analysis of the VP6 gene from rotavirus species A, D, and F identified in diarrheic broiler chickens

　　摘要
轮状病毒（RV）在多种家畜物种中引起病毒性肠道疾病。它是一种无包膜的二十面体病毒，具有11个双链RNA基因组片段，编码6种结构蛋白（VP）。VP6是最丰富的蛋白质，位于RV衣壳的中间层，常用于RV种的检测和分类。禽类RV分为四个种：RVA、RVD、RVF和RVG，其中RVA在禽类宿主体内最常见，但相关研究仍较少。本研究旨在鉴定RV种及其可能的共感染情况，通过银染聚丙烯酰胺凝胶电泳法确认的RV阳性粪便样本中的VP6基因特征，并评估其系统发育和多样性关系。采样包括55份来自1-2周龄肉鸡的RV阳性粪便样本，这些鸡表现出腹泻和吸收不良综合征的临床症状。提取核酸后，应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）针对RVA、RVD、RVF和RVG的VP6基因进行检测。扩增产物被测序，33个核苷酸（nt）序列被提交进行系统发育分析。结果在10份（18.2%）、17份（30.9%）和28份（50.9%）粪便样本中分别检测到RVA、RVD和RVF种。每份粪便样本中仅检测到一种RV种。在任何粪便样本中均未扩增到RVG的VP6基因。系统发育分析显示，10株RVA菌株属于基因型I11。RVD和RVF菌株的核苷酸同源性分别为87.7-90.1%和87.9-98.4%。对禽类中流行RV菌株的分子特征进行分析有助于了解这些感染的流行病学情况。

引言
轮状病毒（RV）感染是全球幼龄动物（包括哺乳动物和禽类）腹泻的主要病毒病因[1]。除了儿童外，哺乳动物感染在多种家畜中也有重要的临床和流行病学意义，尤其是犊牛[2]和仔猪[3]。禽类RV是导致禽类肠道感染的常见原因，可引起腹泻和脱水[4]。在肉鸡中，RV感染与多种临床症状相关，统称为吸收不良综合征或生长迟缓综合征[5]。该综合征会降低体重增长、批次间差异明显，并导致较高的淘汰率[6]。在巴西，已在有症状[7,8,9,10]和无症状[11,12,13,14,15,16]的肉鸡和蛋鸡中检测到禽类RV的存在。根据衣壳中层存在的VP6病毒蛋白，目前已描述了11种RV[17]：α-胃肠炎轮状病毒（RVA）、β-胃肠炎轮状病毒（RVB）、γ-胃肠炎轮状病毒（RVF）、δ-胃肠炎轮状病毒（RVD）、φ-胃肠炎轮状病毒（RVF）、ε-胃肠炎轮状病毒（RVG）、θ-胃肠炎轮状病毒（RVH）、ι-胃肠炎轮状病毒（RVI）、κ-胃肠炎轮状病毒（RVJ）和λ-胃肠炎轮状病毒（RVL）。在禽类中已鉴定出4种RV（RVA、RVD、RVF和RVG）[5]。RVA感染同时发生在哺乳动物和禽类中，而D、F和G型RV则仅存在于禽类宿主中[1]。公共数据库中关于禽类RVD、RVF和RVG的VP6（基因型I）核苷酸序列的有限可用性阻碍了基因型的确定，并限制了我们对这些病毒遗传多样性和进化动态的理解[18]。然而，对于禽类RVA野外菌株，可以通过VP6基因的系统发育分析来确定基因型I。与在哺乳动物中鉴定出的RV菌株不同，禽类RV野外菌株的分子特征研究仍较为有限[18]。

在英[19]、日[20]、德[21]和尼日利亚[22]进行的研究中，首次在禽类RVA菌株中鉴定出I4基因型VP6。最近，在波兰的家鸽中也发现了RVA基因型I4[23]。I11基因型在爱尔兰[24]、德[6, 21, 24, 25]和尼日利亚[22]被描述。I21基因型在野生日本普通鸥的粪便样本中被鉴定出来[26]。此前在巴西对商业鸡的粪便样本进行的研究发现RVA野外菌株中含有I4和I11基因型[15]。本研究旨在通过RT-PCR鉴定流行的RV种，并调查RV共感染情况。利用之前通过银染聚丙烯酰胺凝胶电泳法确认为RV阳性的禽类RV野外菌株的部分VP6基因序列，进一步分析其遗传多样性和系统发育关系。

材料与方法
伦理批准
实验程序遵循巴西动物实验协会（COBEA）制定的伦理原则，并获得了帕拉纳联邦大学动物使用伦理委员会（CEUA/协议编号15/2014）的批准。

生物样本
来自COBB 500商业品种的1-2周龄小肉鸡（生长不良个体）的55个单独肠道内容物样本，这些鸡表现出腹泻和吸收不良综合征的临床症状，已通过ss-PAGE法确认为RV阳性[10]。所有粪便样本均来自巴西南部帕拉纳州的10个禽群，储存于-80°C直至处理。

核酸提取
将粪便样本以10%（w/v）的比例悬浮在Tris/钙缓冲液（10 mM Tris–HCl；1.5 mM CaCl2；pH 7.3）中，以5,000 × g离心10分钟。取500 μL上清液，加入十二烷基硫酸钠（最终浓度1%），在56°C下孵育30分钟。使用苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）和硅胶/胍异硫氰酸酯组合方法[27]提取核酸。核酸用50 μL含有二乙基焦磷酸酯（DEPC）（Invitrogen Life Technologies，CA，美国）的超纯无菌水洗脱，并储存于-80°C以待RT-PCR测定使用。DEPC水作为阴性对照，每个禽类RV种的阳性样本在核酸提取和RT-PCR过程中用作阳性对照。

RT-PCR测定
为确认禽类RV种的存在并检测可能的RV共感染，提取的核酸被用于四种平行单扩增RT-PCR测定，使用特异性引物（表1）。这些测定分别扩增了787 bp、741 bp、875 bp和1,034 bp的VP6基因片段，对应于RVA[21]、RVD[28]、RVF和RVG[14]。RT-PCR扩增产物在含有溴化乙锭（0.5 μg/mL）的2%琼脂糖凝胶（TBE缓冲液pH 8.4，89mM Tris、89mM硼酸和2mM EDTA）上进行电泳，并在紫外光下观察。

表1 用于扩增禽类轮状病毒野外菌株VP6基因并进行测序的具体逆转录-聚合酶链反应引物，包括预期扩增片段大小、基于原型菌株的基因组位置信息及参考文献

测序和系统发育分析
对应于RVA（n=10）、RVD（n=12）和RVF（n=11）的RT-PCR扩增产物使用PureLink? Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo试剂盒（Invitrogen Life Technologies）纯化，并使用Quant-iT? dsDNA BR Assay Kit（Invitrogen Life Technologies）在Qubit?荧光计中定量。测序反应采用与RT-PCR相同的正向和反向引物，在ABI3500 Genetic Analyzer测序仪上使用BigDye? Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems，CA，美国）进行。使用PHRED软件进行核苷酸序列质量分析，并使用CAP3软件（http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/）组装一致性序列。核苷酸序列相似性搜索使用GenBank中的序列通过Basic Local Alignment Search Tool（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）软件进行比较。此外，核苷酸序列还提交至Virus Pathogen Database and Analysis Resource（http://www.viprbrc.org/）的自动化基因分型工具以确认禽类RVA基因型[29]。核苷酸和氨基酸（aa）序列使用ClustalW [30]与从GenBank检索的其他RV种的代表性菌株进行比对。排除NCBI可用序列的标准包括：未发表的期刊、非Sanger双脱氧测序技术生成的序列以及长度少于300 nt的序列。系统发育树使用MEGA软件包（版本10.2.6）的最大复合似然（ML）方法及Tamura-3参数加Gamma分布+不变位点（T92+G+I）模型，通过1,000次自助法复制得到[31]。RVA、RVD和RVF的核苷酸和氨基酸同源性矩阵使用BioEdit软件7.2.5版本生成[32]。

结果
通过RT-PCR测定评估的55个单独粪便样本中，分别有10份（18.2%）、17份（30.9%）和28份（50.9%）样本确认存在禽类RVA、RVD和RVF种。在任何分析样本中均未检测到RVG种的VP6基因。所有RV阳性样本中的RNA仅来自一种禽类RV种。表2显示了本研究中的禽类RV野外菌株与参考原型RV菌株之间的核苷酸和氨基酸同源性百分比比较，还包括与其他巴西和全球RVA、RVD和RVF种禽类RV菌株的比较。RVA、RVD和RVF种的同源性矩阵分别为729 nt（349至1,077 nt）和243 aa（117至359 aa）；561 nt（183至743 nt）和186 aa（55至240 aa）；以及645 nt（92至736 nt）和215 aa（23至237 aa）。

表2 本研究中的禽类轮状病毒（RV）野外菌株与参考原型菌株以及其他来自巴西帕拉纳州的RVA、RVD和RVF种禽类RV菌株之间的核苷酸和氨基酸同源性百分比比较

10株禽类RVA野外菌株的推导氨基酸序列与参考原型菌株（Ch-06V0661 - GenBank访问号：EU486969）进行了比对。发现这些野外菌株有9个氨基酸替换（128 Y→N；140 D→N；141 M→L；181 C→W；183 T→N；200 D→N；202 H→Q；214 V→L；258 K→N）。将本研究中的RVA菌株推导氨基酸序列与2008年收集的巴西22/08菌株（GenBank访问号：KX198692）进行比较，显示出94.7至95.1%的核苷酸同源性和97.5%的氨基酸同源性，以及6个不同的氨基酸差异（238 I→V；250 D→E；272 V→N；284 N→K；285 F→K；316 N→T）。与2011年收集的韩国AvRV-2菌株（GenBank访问号：JQ085406）进行比较，显示出92.7至93.5%的核苷酸同源性和99.1%的氨基酸同源性，以及2个氨基酸差异（188 I→L和284 N→K；285 F→K）；与德国Ch-03V0158G3菌株（GenBank访问号：EU486966）进行比较，显示出93.1至94.1%的核苷酸同源性和99.5%的氨基酸同源性，以及1个氨基酸差异（202 Q→H）（表3）。

表3 显示了117至359个氨基酸（aa）的禽类轮状病毒A菌株VP6蛋白的部分比较分析及氨基酸替换位置示意图。上述数字对应于与参考菌株Ch-06V0661（GenBank访问号：EU486969）的氨基酸位置。本研究获得的序列用粗体标示并带▲符号。

12株RVD菌株与原型06V0047参考菌株（GenBank访问号：JN034679）有一些相似性，有两个氨基酸替换（93 V→I；230 E→D）。将本研究中推导出的RVD菌株的氨基酸序列与印度菌株2012（GenBank登录号：JX187435）进行比较，显示核苷酸（nt）同一性为90.0%至90.1%，氨基酸（aa）同一性为98.9%，存在两个氨基酸差异（149 M→T和228 I→M）；与孟加拉国菌株2010（GenBank登录号：JN034683）比较，核苷酸同一性为88.2%至88.4%，氨基酸同一性为98.9%，存在两个氨基酸差异（95 V→A；102 V→I）（表4）。表4部分比较了禽类轮状病毒D菌株VP6蛋白的55至240个氨基酸（aa），以及氨基酸替代位置的示意图。上述数字对应于参考菌株06V0047（GenBank登录号：JN034679）的氨基酸位置。本研究中获得的序列用粗体加●符号标记。然而，11株RVF田间菌株和原型RVF菌株（GenBank登录号：NC_021635）有十个氨基酸替代（30 I→V；51 V→I；60 T→A；110 T→M；121 T→A；164 I→V；171 A→P；175 N→D；226 G→D；237 V→I）。VP6FPR_70菌株（GenBank登录号：OR165114）在第25位有一个额外的氨基酸替代（S→F）。将本研究中推导出的RVF菌株的氨基酸序列与巴西菌株进行比较，发现两个不同的氨基酸（51 I→V和237 I→V），与AVRVFBR03菌株2009（GenBank登录号：KF926655）的核苷酸同一性为92.8%至93.6%，氨基酸同一性为98.6%至99.0%。与意大利956_1菌株（GenBank登录号：KT073228）比较，发现五个氨基酸差异（45 Q→H；57 T→I；204 Q→R；230 S→T；237 I→V），核苷酸同一性为88.2%至88.4%，氨基酸同一性为97.2%至97.6%（表5）。表5部分比较了禽类轮状病毒F菌株VP6蛋白的23至237个氨基酸（aa），以及氨基酸替代位置的示意图。上述数字对应于参考菌株03V0568（GenBank登录号：NC_021635）的氨基酸位置。本研究中获得的序列用粗体加▼符号标记。对于系统发育树，选择了每种RV物种的两个描述过的田间菌株。本报告中描述的RVA菌株属于I11基因型。RVD菌株聚类在一起，形成了一个独立的支系（亚群），与之前描述的RVD菌株不同；RVF菌株与两个之前描述的巴西RVF菌株（GenBank登录号：KP824808和MN648929）聚类在一起（图1）。图1该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像基于本研究描述的禽类轮状病毒A（RVA）、D（RVD）和F（RVF）物种的VP6基因的部分386（356至741）个核苷酸（nt）序列，以及代表性菌株。该树使用最大似然法构建，采用了Tamura三参数模型加上伽马分布+不变的核苷酸替代位点。显示自举值大于50%的条目。提供了菌株的GenBank登录号。本研究中获得的VP6 nt序列分别用黑色方块、圆圈和倒三角形表示禽类RVA、RVD和RVF。两个菌株代表分析了10株RVA、12株RVD和11株RVF野生型菌株的序列。RVG的VP6基因序列被用作外群。本研究中描述的禽类RVA、RVD和RVF菌株的部分VP6 nt序列在GenBank中的登录号分别为OR165102至OR165110和MZ964147、OR188340至OR188350以及MZ935731、OR165111至OR165120和MZ964148。讨论RV被认为是家禽中重要的肠道病原体，会导致腹泻、生长迟缓和全球商业鸡群的经济损失。然而，关于商业和野生鸟类中RV感染的经典和分子流行病学的信息非常有限[18, 22, 33, 34]。在本研究中，我们从患有腹泻的肉鸡中鉴定并表征了禽类RV A、D和F物种，为巴西家禽生产中 circulating 菌株的VP6基因提供了分子层面的见解。我们鉴定了已知导致鸟类肠道感染的四种RV物种中的三种。所有检测到的野生型RV菌株均来自表现出吸收不良综合征临床症状的商业肉鸡群体。这些症状性雏鸡中存在RVA、RVD和RVF RNA，强调了这些禽类RV物种对于这种综合征的贡献，这种综合征被认为有多种原因[5, 6]。与其他之前在鸟类中描述的RV物种（RVA、RVD和RVF）相比，RVG的报告较少[14, 33]。然而，在多个国家[35, 36]（包括巴西[14, 16, 37]）记录了RVG感染病例。在本研究中，通过RT-PCR检测的55份粪便样本中均未检测到RVG。在巴西之前关于RVG诊断的报告中，样本主要来自成鸟和无症状鸟类的粪便池[33, 36]。我们认为采样方法可能导致了RVG未能被检测到的结果[10]。此外，潜在的因素也可能导致这种情况，包括采样鸟类的年龄、是否出现腹泻和脱水症状、样本类型（个体肠道内容物、个体粪便样本或混合粪便样本）以及所采用的诊断方法[10, 36]。使用RT-PCR在同一生物样本中同时检测到多种禽类RV物种的核酸是常见的。多项报告描述了全球商业和野生鸟类中不同种类的禽类RV的共检测[33, 36]（包括巴西[12, 37, 38]）。然而，在本研究中，每个肠道内容物样本中最多只检测到一种禽类RV物种。考虑到诊断方法相同（RT-PCR检测），采样方法可能对这些不同的结果有所影响。在一些研究中，生物样本是单独采集的[6, 10, 38]或作为混合样本采集的[14, 33, 36]。评估的鸟类年龄范围差异很大，分析包括了有症状的[7, 9, 10]和无症状的[9, 13, 14, 15, 16, 38]鸟类。我们的研究仅包括来自年轻（出生第一和第二周）和有症状（腹泻）雏鸟的粪便样本。这种采样方法可能有助于识别单一感染。在本研究中，对巴西禽类RVA田间菌株VP6基因的部分序列分析显示，与Ch-06V0661原型菌株[21]以及其他来自巴西的禽类RVA序列（94.7%至97.5%核苷酸同一性）相比，遗传变异性略低（90.9%至92.3%）。来自德国、韩国和尼日利亚的其他禽类RVA菌株属于I11基因型，核苷酸同一性为92.7%至94.5%[21, 22, 39]。此外，与巴西菌株22/08[15]和参考菌株[21]相比，分别存在六个和九个氨基酸差异。与原型菌株的低同一性和更多的氨基酸差异可能是由于采集日期的不同。原型菌株来自2006年，而巴西野生菌株较新，分别来自2008年、2009年和2015年[15, 21]。系统发育分析证实了每种VP6基因型的禽类RVA都有不同的分支，这一结论得到了高自举值的支持。我们的RVA菌株与其他在巴西描述的禽类RV菌株聚类在一起。VP6的部分系统发育分析表明，本研究中发现的禽类RVA菌株与2008年、2009年和2015年从肉鸡和蛋鸡商业农场收集的其他I11基因型菌株聚类在一起[15]，以及其他国家的菌株，如2002至2006年的德国[21, 25]、2010年和2011年的韩国[39, 40]以及2011年和2013年的尼日利亚[22]。尼日利亚的一种不同宿主物种珍珠鸡也属于I11基因型[22]。在德国和巴西的雏鸡和火鸡中鉴定出两种禽类RVA基因型（I4和I11）[15, 21, 25, 41]。两种基因型与日本菌株相关，I21来自普通鸥，I4来自鸽子[26, 42]。位置153的组氨酸残基参与锌结合，这对VP6的三聚体结构是必需的，并在所有RVA分离株中保守，但在其他RV物种中不保守[43]。His153在所有分析的巴西RVA菌株序列中都得到保守。RVD序列与参考菌株和全球RVD菌株相比，分别有一个或两个氨基酸差异。尽管核苷酸同一性（87.7%至90.1%）略低，但氨基酸分析显示与VP6 RVD参考菌株的相似性很高（98.9%[44]），与巴西菌株的相似性为100%[13, 28, 34, 45]，与全球菌株的相似性为98.9%至100%[22, 44, 46, 47]。本研究中RVD菌株的核苷酸同一性与巴西和其他国家的时间相关菌株相当，如尼日利亚[22]和印度[47]，表明基因分化有限。2010年收集的巴西蛋鸡RVD菌株的核苷酸同一性为87.7%至87.8%[45]，2008年和2011年收集的肉鸡RVD菌株的核苷酸同一性为88.9%至89.3%[13, 28]，分别与此处描述的菌株相比。与本研究中2018年收集的鹦鹉宿主菌株（89.1%至89.3%）和2011年收集的肉鸡菌株相比，核苷酸同一性更高。这里描述的巴西RVF菌株显示出较低的多样性，可能是因为所有菌株都接近这些研究样本的时间点（2015年采集）。本文描述的巴西RVF菌株与2003年收集的德国原型菌株[35]以及GenBank上发布的唯一全球菌株（2010年从鹌鹑猎鸟身上采集的意大利菌株[36]的核苷酸和氨基酸相似性较低。与之前在巴西描述的菌株相比，核苷酸相似性在92.8%至98.4%和98.6%至100%之间，前者有一个氨基酸差异（25 S→F）在VP6FPR_70菌株[12, 14, 16, 34, 37]中。巴西菌株的核苷酸同一性未能跟上宿主和时间的模式。分析显示2010年从肉鸡农场收集的样本的核苷酸同一性为97.3%至98.2%[14]，2018年从野生鹦鹉收集的样本为97.5%至98.4%[34]。2018年从无症状肉鸡中收集的巴西RVF菌株的核苷酸同一性较低，分别为93.1%至94.2%[16]、2013年为93.3%[37]和2009年为92.8%至93.6%[12]。需要进一步的查询和可用序列来了解VP6基因的RVA和非RVA物种的突变率、时间和地理模式以及宿主模式[35, 38]。尽管VP6是RV中最丰富和保守的蛋白，但序列数据分析可以阐明并提供关于多种禽类宿主中RV感染的流行病学方面和知识，以及与最高生产区域的商业肉鸡的相互作用。RV是一种影响雏鸟生命最初几周的肠道感染，导致腹泻和脱水[5]。前述因素会对批次产生不利影响，包括体重减轻、饲料转化率降低、均匀性下降、存活率降低以及二次疾病风险增加[13]。根据感染的严重程度，经济损失可能很大[10, 48]。总体而言，对禽类RVA、RVD和RVF菌株VP6基因的分子表征有助于更好地理解巴西年轻肉鸡中RV感染的遗传多样性和流行病学。本研究存在一些局限性，包括地理采样范围有限、仅分析了具有临床症状的年轻肉鸡，以及使用了部分VP6基因序列。因此，结果可能无法完全代表在其他宿主、年龄组或地理区域中循环的禽类轮状病毒的遗传多样性。