对鼠疫耶尔森菌（Y. pestis）YfeA蛋白中金属结合位点2的研究：Fe(II)、Mn(II)和Zn(II)复合物的溶液学分析

《Dalton Transactions》：Investigation of the metal-binding site 2 of Y. pestis YfeA protein: solution studies of Fe(II), Mn(II), and Zn(II) complexes

　　YfeABCD是一种存在于鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）中的金属离子转运系统，负责吸收Fe(II)和Mn(II)离子。YfeA是一种胞质膜外的底物结合蛋白（SBP），它在胞质膜外与金属离子结合，并促进其转移到跨膜蛋白YfeC和YfeD。有趣的是，质谱互作（ITC）和晶体学数据表明，尽管YfeABCD系统可能不转运锌，但YfeA也可以优先结合Zn(II)离子。YfeA拥有两个金属结合位点，其中位点2能够结合Zn(II)和Mn(II)离子，但不能结合Fe(II)离子。在这项研究中，我们调查了YfeA位点2的肽模型在金属结合方面的特性。我们使用多种物理化学方法来表征Fe(II)、Mn(II)和Zn(II)复合物的化学计量比、稳定常数和金属结合残基。

### 引言

细菌为了支持生长和发育，能够以足够的量获取必需元素通常是一个决定性因素。1,2 细菌表达的各种金属转运蛋白强调了金属吸收的重要性。3,4 在铁的吸收方面，细菌发展出了多种策略来吸收Fe(II)和Fe(III)离子，这是一种进化适应，使它们能够在厌氧和有氧环境中生存（这两种环境中分别以亚铁和铁的形式存在）。Fe(II)具有足够的溶解度，可以以自由金属离子的形式穿过细菌的内膜。5 这一过程由多种转运系统完成，通常涉及一个跨膜蛋白作为直接的金属转运蛋白，该蛋白可以被位于细菌细胞质、膜或胞质膜外的辅助蛋白所支持。只有少数Fe(II)转运系统在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中广泛存在。例如Feo系统，被认为是最广泛和最重要的细菌亚铁吸收系统。6 其他系统则相对特定于某些病原体群体，甚至某些特定的病原体，如IroT、FbpABC、SitABCD，分别具有嗜肺军团菌（Legionella）、奈瑟菌（Neisseria）和沙门氏菌（Salmonella）的特征。另一个例子是YfeABCD系统，它存在于鼠疫耶尔森菌中，这种细菌是引起瘟疫的致病菌，包括腺鼠疫、败血症型和肺鼠疫三种形式。10

YfeABCD或Yfe系统于20世纪90年代末被发现，并被归类为ABC-转运蛋白家族的一员。11–13 该系统由四种蛋白质组成：胞质膜外的金属结合蛋白YfeA、ATP结合蛋白YfeB以及跨膜蛋白YfeC和YfeD（见图1）。图1展示了Yfe系统转运Fe(II)和Mn(II)的示意图。该系统包括胞质膜外的底物结合蛋白YfeA、跨膜蛋白YfeC和YfeD、ATP结合蛋白YfeB，以及功能未知的内膜蛋白YfeE。Fe(II)和Mn(II)离子最有可能通过孔蛋白穿过外膜，然后在胞质膜外被YfeA结合；接着，这些金属离子利用ATP水解释放的能量通过YfeC和YfeD蛋白转运穿过内膜。UniProt数据库中的条目分别为：Q56952（YfeA）、Q56953（YfeB）、Q56954（YfeC）、Q56955（YfeD）、Q56956（YfeE）。这些蛋白质使用UCSF Chimera软件进行了可视化。14

Yfe系统已被证明可以转运Fe(II)和Mn(II)，因此它不是特定于某种金属的转运蛋白，这与其他许多二价金属离子转运蛋白（如MntH或ZupT）类似。5 它受到Fur蛋白的调控，并且不依赖于TonB，M(II)离子可能通过一般的或特定于金属的孔蛋白穿过外膜。16 由于铁在同宿主感染过程中的重要性，Yfe在鼠疫耶尔森菌的致病性中起着重要作用。研究发现，尽管yersiniabactin这种铁载体在瘟疫初期对于铁的吸收至关重要，但Yfe系统在疾病从淋巴结扩散到其他器官的过程中可能发挥更大的作用。13 相反，Feo和Yfe系统对于肺鼠疫的发展并不显著，但它们似乎在腺鼠疫的形成中起作用。18,19 Yfe系统基因的突变仅在没有氧气的条件下导致鼠疫耶尔森菌的生长缺陷，这与Yfe系统作为在厌氧条件下稳定的Fe(II)转运蛋白的特性一致。19 然而，Feo和Yfe系统都被证明可以在还原性和非还原性条件下转运铁。此外，它们还能够使用Fe(II)和Fe(III)，尽管铁在转运之前很可能被还原为亚铁形式。20

作为胞质膜外的底物结合蛋白（SBP），YfeA在决定Yfe转运系统的金属离子特异性方面起着关键作用。虽然Yfe主要被认为是Fe(II)和Mn(II)的转运蛋白，但ITC实验表明Zn(II)也可以以与Mn(II)相似的亲和力结合到YfeA上。测定的解离常数值处于纳摩尔范围，表明这两种金属离子的结合非常紧密。21 Zn(II)结合到YfeA上的可能性进一步通过蛋白质的晶体结构得到了证实，这些结构显示锌优先结合到两个金属结合位点上，但目前尚不清楚这种行为是蛋白质的错误配位还是表明在某些条件下Yfe也能转运锌。22 与其他许多SBP一样，YfeA采用了一种C型夹结构。深度埋藏的典型金属结合位点由两个组氨酸残基、一个谷氨酸残基和一个天冬氨酸残基组成（H76、H141、E207、D282）。X射线荧光数据显示，这个位点按优先顺序结合Fe(II)、Mn(II)和Zn(II)。有趣的是，在蛋白质表面发现了第二个金属结合位点，它由谷氨酸和组氨酸残基组成，两个水分子完成了Zn(II)和Mn(II)的配位球。然而，尚未获得结合了Fe(II)的YfeA的晶体。位点2暴露在蛋白质表面，以及金属配位球中存在水分子，表明金属结合可能是不稳定的，并且可能与其他YfeA部分有调节或通讯作用。此外，研究表明当金属由多个YfeA分子结合时，位点2也可以参与Zn(II)和Mn(II)的配位。23 当位点2结合金属时，另外四个残基可以结合锌，其中三个（D164、H167、E169）靠近该位点（E162、H163）。22

尽管X射线数据提供了金属结合位点的位置和结合金属离子的身份的精彩概述，我们非常希望进一步了解金属结合的特性，例如对所讨论金属离子的亲和力。溶液研究有助于表征蛋白质的配位化学，并在更接近其自然环境的条件下识别其金属结合位点。然而，由于蛋白质的大小及其所含大量脱质子化残基，研究溶液中的金属离子结合偏好颇具挑战性。在这种情况下，可以使用精心设计的模拟各种蛋白质结合位点的肽模型作为简化的蛋白质模型，以更好地理解影响复合过程和所研究金属离子配位化学的因素。我们认识到肽模型无法完全再现长程静电相互作用或折叠蛋白质的刚性骨架，这两者都可能影响结合的熵。尽管如此，使用肽模型和全长蛋白质的研究提供了不同但互补的见解。对完整蛋白质的研究主要关注生物学功能和整体结构的角色，而肽模型则能够分离并精确表征结合位点自身的基本配位化学，包括热力学、化学计量比和几何结构。这些内在特性往往在蛋白质的复杂结构环境中被掩盖。这种简化方法对于本质上无序的蛋白质或具有明确局部结合基序的蛋白质特别有价值，因为在这些蛋白质中，金属配位主要由局部化学亲和力而不是三级结构控制。24,25 此外，肽模型成本效益高，允许快速筛选，无需蛋白质过表达。它们还便于进行系统性的修饰，例如丙氨酸扫描或插入非天然残基，从而提供关于个别氨基酸对金属结合的具体贡献的详细信息。26,27 最后，使用肽模型可以降低光谱复杂性，使得可以使用核磁共振（NMR）光谱和质谱（MS）等技术进行高分辨率表征（见下文）。由于Y. pestis的YfeA位点2在蛋白质序列中所有金属结合残基都彼此靠近，因此非常适合使用肽模型进行详细研究，与位点1相比。我们选择了包含位点2（E162、H163）和三个辅助锌结合残基（D164、H167、E169）的YfeA片段（Ac-V161EHDPAHAET170-NH2）（见图2）。该肽的N端和C端分别进行了乙酰化和酰胺化，以模拟蛋白质条件。虽然位点2仅显示可以结合Zn(II)和Mn(II)，但我们决定也研究Fe(II)复合物，希望能发现金属结合的差异，这可能解释了位点2在天然YfeA蛋白中的金属偏好。图2展示了使用肽模型可视化的YfeA结构，其中选择了包含位点2的序列。该序列包含了YfeA的金属结合位点2（在肽序列中标记为红色），以及辅助的锌结合残基D164、H167和E169（标记为蓝色）。PDB条目为6Q1C。使用UCSF Chimera软件进行了可视化。考虑到在处理Fe(II)和Mn(II)复合物时遇到的所有挑战，例如Fe(II)离子易被氧化，或在使用光谱方法识别Mn(II)结合残基方面的限制，为了彻底表征设计好的肽模型与Fe(II)、Mn(II)和Zn(II)形成的复合物，我们使用了多种物理化学方法，如质谱（MS）、电位滴定、电子顺磁共振（EPR）和圆二色性（CD）光谱。由于迫切需要深入了解影响这些金属离子复合物热力学稳定性的因素，我们相信这些研究丰富了关于肽与Fe(II)和Mn(II)离子相互作用的文献，这些研究目前还仅限于少数例子。28–31 这些知识可能有助于进一步阐明天然蛋白质中金属结合-结构-功能的关系。

### 材料

肽配体L1（Ac-VEHDPAHAET-CONH2）是从KareBay? Biochem购买的。通过质谱实验确认了其身份，其纯度通过Gran方法在电位滴定数据上确认为>98%。Titripur? 0.1 M无碳酸盐氢氧化钠（Sigma-Aldrich）使用邻苯二甲酸氢钾（Sigma-Aldrich）进行了标准化，并作为电位滴定的滴定剂。浓缩的70%高氯酸（Sigma-Aldrich）和固体氢氧化钠（Sigma-Aldrich）用于制备NMR、EPR和CD实验中不同浓度的溶液。高氯酸钠（Sigma-Aldrich）用于调整电位滴定、CD和EPR实验中的离子强度。氧化氘（Sigma-Aldrich）用于NMR实验中的样品制备。Mn(II)和Zn(II)的溶液是从相应的高氯酸盐（Sigma-Aldrich）制备的，而莫尔盐（硫酸铁(II)铵（Sigma-Aldrich）用于在厌氧条件下制备Fe(II)溶液。Mn(II)和Zn(II)溶液使用ICP-OES和莫尔盐与乙二胺四乙酸二钠盐（Na2H2EDTA）的复杂ometric滴定进行了标准化。Fe(II)溶液的浓度通过1,10-菲罗啉（Sigma-Aldrich）的颜色测定法确定。由于Fe(II)容易氧化，所有含有Fe(II)的样品都是在手套箱内的氩气气氛中准备，并在实验前立即使用脱氧溶剂制备的。在将样品从手套箱中取出进行实验之前，含有样品的实验室玻璃器皿（电位滴定容器、CD比色皿、NMR管、MS实验的小瓶）都被仔细密封。在整个实验过程中，样品保持无色，我们没有观察到Fe(III)的氧化。只有在实验结束后将样品暴露在空气中后，才观察到黄色，表明存在Fe(III)。在NMR实验后向样品中加入硫氰酸盐阴离子时，未观察到与Fe(III)复合物相关的信号。因此，我们相信我们为Fe(ii)实验准备的样品程序是可靠的，可以防止实验过程中Fe(ii)被氧化成Fe(iii)。采用电喷雾离子化质谱（ESI-MS）技术进行了分析。

Mn(ii)和Zn(ii)配合物的质谱是在Shimadzu LCMS-9050-QTOF质谱仪上记录的，而Fe(ii)样品则是在Bruker Q-TOF紧凑型质谱仪上记录的。配体浓度为0.1 mM，M:L比例为1:1和1:2。所有样品都是在LC-MS级的甲醇：水混合物（50:50，w/w）中制备的，并在注射前用甲醇稀释。质谱以正离子模式记录。对于Shimadzu LCMS-9050-QTOF，质谱采集的参数如下：雾化气体：氮气，雾化气体流量：3.0 L min?1，干燥气体流量：10 L min?1，加热气体流量：10 L min?1，接口温度：300 °C，脱溶剂线温度：400 °C，检测器电压：?2.02 kV，接口电压：4.0 kV，碰撞气体：氩气，流动相：MeCN +0.1% HCOOH。Bruker Q-TOF紧凑型质谱仪使用的部分参数包括：干燥气体，氮气；温度T = 170 °C；毛细管电压：4500 V；离子能量：5 eV。质谱数据使用LabSolutions软件（Shimadzu，京都，日本）和Compass Data Analysis 4.0软件（Bruker Daltonics）进行处理。

电位滴定是在由Metrohm Titrando 905滴定仪和Dosino 800加液系统组成的自动系统上进行的。实验过程中使用InLab Semi-Micro（Mettler-Toledo）电极测量电位。电极通过2 ml 4 mM高氯酸的酸碱滴定进行校准。每次滴定都使用标准化的Titripur?氢氧化钠作为滴定剂。利用SUPERQUAD32和HYPERQUAD 200833软件根据电位数据计算了Fe(ii)、Mn(ii)和Zn(ii)配合物与配体L1的稳定常数。HYSS34软件用于制备物种分布图和竞争图，并计算pM和Kd值。样品中含有1 mM浓度的配体，0.1 M的高氯酸钠作为离子强度调节剂，以及4 mM的高氯酸以将pH调整到大约2.0。使用Gran方法确定配体的确切浓度。对于金属配合物的滴定，M:L比例为1:1.1。HYPERQUAD 2008计算的标准偏差仅代表随机误差。在计算稳定常数时考虑了Fe(ii)、Mn(ii)和Zn(ii)的水解常数（表S1）。

核磁共振（NMR）实验使用了配备5 mm自动调谐系统和匹配宽带探头（BBFO）的Bruker Ascend? 400 MHz质谱仪，该探头具有z梯度。用于NMR实验的样品浓度在0.4到1.0 mM之间，并溶解在90/10 (v/v) H2O–D2O溶剂混合物中。所有NMR实验均在298 K下，在5 mm NMR管中进行。2D 1H–13C异核相关谱（HSQC）是使用相位敏感序列获得的，该序列采用Echo-Antiecho-TPPI梯度选择，所有180°脉冲的f2通道都进行了解耦处理。此外还采用了增强灵敏度的back-INEPT梯度。所有实验都应用了2秒的松弛延迟和大约10 μs的90°脉冲。通过梯度进行激发塑形来实现溶剂抑制。1H–1H TOCSY实验的spin-lock混合时间使用MLEV17获得。1H–1H ROESY实验的混合时间为60 ms。1H和13C的归属是通过单维和多维NMR技术结合不同pH值来完成的：1H–1H TOCSY、1H–13C HSQC和1H–1H ROESY。为了避免由于Mn(ii)和Fe(ii)的顺磁性特征导致信号严重展宽，在进行NMR实验时向配体溶液中加入了亚化学计量的金属离子。所有NMR数据使用TopSpin（Bruker Instruments）软件处理，并使用Sparky 3.11和MestReNova 6.0.2（Mestrelab Research S.L.）程序进行分析。

圆二色性（CD）光谱是使用Jasco J-1500 CD光谱仪记录的。光谱采集范围为180–250 nm，扫描速度为400 nm m?1，光路长度为0.01 cm。每个光谱采集了七次叠加。配体浓度为0.35 mM，M:L比例为1:1.1。数据处理使用了Spectra Analysis（Jasco Inc.）软件。

电子顺磁共振（EPR）技术用于研究Mn(ii):L1系统。在X波段频率下获得的EPR光谱是使用配备NMR特斯拉计（ER 036TM）和频率计（E 41 FC）的Bruker ELEXSYS E500 CW-EPR质谱仪获得的。光谱采集时微波功率为10 mW，调制幅度为1 mT，调制频率为100 kHz。肽浓度为1 mM，金属:配体的摩尔比为1:1.1。光谱是在室温下获取的。数据由A. Ozarowski（佛罗里达大学盖恩斯维尔分校国家强磁场实验室）使用Doublet new（EPR OF S = 1/2）程序进行处理。

紫外-可见光谱是使用Jasco V-730 UV-Visible分光光度计记录的。扫描速度为每分钟400 nm，叠加次数为1次，比色皿的光学长度为0.1 cm。Fe(ii)浓度的比色测定基于1:3:M的红色Fe(ii)配合物与1,10-菲朗啉（λmax = 510 nm）的形成。利用预先制备的0.1–1.1 mM范围的校准曲线，根据510 nm处的吸收来确定Fe(ii)溶液的浓度。使用过量的1,10-菲朗啉（M:L = 1:5）以确保金属离子的完全配位。

我们采用了多种物理化学方法来表征L1、Ac-VEHDPAHAET-CONH2与Fe(ii)、Mn(ii)和Zn(ii)之间形成的配合物。质谱提供了关于形成的配合物的化学计量比信息。电位滴定数据用于确定配体对研究金属离子的稳定常数并计算亲和力。NMR光谱提供了关于不同pH值下金属结合模式的信息，CD光谱反映了系统的构象变化，而EPR光谱进一步证实了Mn(ii)配合物的形成。L1含有5个在研究pH范围内（2–11）能够脱质子的氨基酸残基，因此完全质子化的形式为[H5L]2+。正电荷是由于两个His残基中的咪唑环质子化产生的。从pH = 2.0开始直到pH约为4.10，这种配合物形式占主导地位（图S1）。Asp残基的脱质子化（pKa值为3.45）导致[H4L]+物种的形成。随后两个Glu残基的脱质子化导致溶液中[H3L]和[H2L]?的形成。这些脱质化的pKa值分别为4.09和4.72。最后两个His残基脱质子化，pKa值分别为6.40和7.10，形成[HL]2?物种和完全质子化的[L]3?，后者是在pH高于约10.0时溶液中唯一的配体形式。确定的pKa值与文献一致。L1的物种分布图显示在图S1中，而确定的稳定常数收集在表1中。

ESI-MS实验提供了关于L1与Fe(ii)、Mn(ii)和Zn(ii)之间形成的配合物的化学计量比的信息。所有研究系统的质谱仅显示与1:1 (M:L)化学计量比相关的配合物信号。获得的质谱显示在图S2–S4中。模拟和实验同位素分布的比较确保了正确的峰分配。表S2包含了与游离配体和金属配合物相关的最丰富峰。

Fe(ii)配合物是在厌氧条件下研究的，以防止金属离子的氧化。通过拟合实验数据获得的最佳配位模型包含Fe(ii):L1系统中的六个配合物物种（表2）。NMR实验是在pH 4.5、7.0和8.9下，使用Fe(ii):L1摩尔比0.33:1进行的，以探究Fe(ii)与肽在不同质子化状态下的相互作用。

Fe(ii):L1系统的稳定常数（logβ）和pKa值

肽
物种
logβb
pKac
脱质子残基

L1
[H5L]2+
25.76(2)
3.45
Asp

[H4L]+
22.31(2)
4.09
Glu

[H3L]
18.22(2)
4.72
Glu

[H2L]?
13.50(1)
6.40
His

[HL]2?
7.10(2)
7.10
His

a
T = 298 K, I = 0.1 M NaClO4，最后一位数的标准偏差在括号中给出。
b
总稳定常数（logβ）由公式表示：β(HnL) = [HnL]/[L][H+]n。
c
酸解离常数（pKa）表示为：pKa = logβ(HnL) ? logβ(Hn?1L)。

ESI-MS实验提供了关于L1与Fe(ii)、Mn(ii)和Zn(ii)之间形成的配合物的化学计量比的信息。所有研究系统的质谱都仅显示与1:1 (M:L)化学计量比相关的配合物信号。获得的质谱显示在图S2–S4中。模拟和实验同位素分布的比较确保了正确的峰分配。表S2包含了与游离配体和金属配合物相关的最丰富峰。

Fe(ii)配合物是在厌氧条件下研究的，以防止金属离子的氧化。通过拟合实验数据获得的最佳配位模型包含Fe(ii):L1系统中的六个配合物物种（表2）。NMR实验是在pH 4.5、7.0和8.9下，使用Fe(ii):L1摩尔比0.33:1进行的，以探究Fe(ii)与肽在不同质子化状态下的相互作用。

Fe(ii):L1系统的稳定常数（logβ）和pKa值

肽
物种
logβb
pKac
脱质子残基

L1
[FeH2L]+
16.79(6)
5.59
His

[FeHL]
11.20(7)
6.73
His

[FeL]?
4.47(6)
7.44
Namide或Owater

[FeLH?1]2?
?2.97(5)
—
2 × (Namide或Owater)

[FeLH?3]4?
?20.67(5)
10.04
Namide或Owater

[FeLH?4]5?
?30.71(6)
—

a
T = 298 K, I = 0.1 M NaClO4，标准偏差在括号中给出。
b
总稳定常数（logβ）由公式表示：β([FeHnL](n+2)+) = [[FeHnL](n+2)+]/[Fe(ii)][[L]n+][H+]n。
c
酸解离常数（pKa）表示为：pKa = logβ([FeHnL](n+2)+) ? logβ([FeHn?1L](n+1)+

配位从pH = 3.50开始，以[FeH2L]+的形式出现，其中包含一个处于脱质子状态的Asp和两个Glu残基（图3）。His残基的脱质子化导致[FeHL]物种的形成。在pH 4.5记录的NMR光谱中，只观察到轻微的扰动，包括His残基的芳香族咪唑质子以及Asp和Glu残基的微小影响。这些微妙的变化与电位滴定数据一致，表明溶液中主要存在的物种是[FeH2L]+，在该pH下占总Fe(ii)的比例不到20%。因此，有限的光谱响应表明在酸性条件下配位形成较弱或不完全，因为游离配体的高比例（约80%）可能掩盖了协调残基上的小扰动。图3显示了Fe(ii):L1系统中形成的配合物的分布图。根据NMR实验条件计算的物种分布：[L]tot = 1 mM; Fe(ii):L = 1:3。由于第二个His残基的脱质子化，形成了完全脱质子的[FeL]?物种。Fe(ii)配合物物种中咪唑氮的脱质子化pKa值（5.59和6.73）低于游离配体（6.40和7.10），这表明His残基参与了铁的配位。在pH 7.0时，多种物种共存，[FeL]?是主导形式，在多个残基上检测到明显的选择性的扰动（图4）。特别是His3和His7的侧链核发生了显著变化，特别是在Hα、Hβ、Hε1和Hδ2上，证实了通过咪唑氮原子的直接Fe(ii)配位（图5和图S5）。图4显示了pH 7时Fe(ii):L1复合物的结构表示，显示了受到Fe(ii)结合显著顺磁效应影响的核。严重展宽的信号被映射到结构上，突出了靠近金属中心的残基，并强调了直接或间接参与配位的残基。

在pH 7时，[FeH2L]+物种中咪唑氮的脱质子化pKa值较低（5.59和6.73），而游离配体为6.40和7.10，这表明His残基参与了铁的配位。在pH 7.0时，多个物种共存，[FeL]?是主导形式，几个残基上检测到明显的选择性扰动（图4）。特别是His3和His7的侧链核发生了显著变化，特别是在Hα、Hβ、Hε1和Hδ2上，证实了通过咪唑氮原子的直接Fe(ii)配位（图5）。图5显示了Fe(ii):L1复合物在pH 7时的结构表示，明确了受到Fe(ii)结合显著顺磁效应影响的核。

在pH 7时，选择了1H–1H TOCSY光谱的芳香区域进行比较，对于游离肽L1（红色）和Fe(ii):L1复合物（黑色）在0.3:1摩尔比下。在Fe(ii)配位后显示出显著化学位移变化的信号用红色突出显示。此外，Asp4的强顺磁效应很明显，其Hα、Hβ和HN质子的信号选择性消失，表明其羧基侧链参与了金属的结合。另外，Glu2和Glu9的γ质子信号也消失了，表明它们的羧基可能参与了配位（图S6）。此外，Ala8的Hβ–HN cross-峰的信号丢失，可能是由于其空间接近顺磁性的Fe(ii)中心。然而，仍然可见的Hα–HN cross-峰表明Ala8的主链酰胺保持质子化状态，没有直接参与配位。因此，在完全脱质子的[L]3?形式中，Fe(ii)的配位模式最有可能是{2 Nim, 3 COO?, H2O}。在研究的pH范围内最后检测到的三种物种[FeLH?1]2?、[FeLH?3]4?和[FeLH?4]5?，很可能是由于肽主链酰胺氮或水分子的脱质子化所致。酰胺基团与Fe(ii)配位的可能性已在文献中针对多种配体进行记录。36–41 然而，对于低自旋的Fe(ii)复合物，这种可能性已被否定，42 但在本研究中，L1与Fe(ii)形成了高自旋复合物。这一点通过NMR光谱中信号的选择性宽化和消失得到了证实，这与高自旋Fe(ii)的顺磁特性一致。锰复合物

对Mn(ii):L1体系获得的电位数据进行处理后，得到了一个与Fe(ii)体系非常相似的模型，只是缺少了最后的复合物形式。这些复合物种类显示出相同的质子化情况以及相似的稳定性常数（表3和图6）。图6

在Mn(ii):L1体系中形成的复合物的分布图。根据NMR实验条件计算的物种分布：[L]tot = 1 mM；Mn(ii):L = 1:50。表3

Mn(ii):L1体系的稳定性常数（logβ）和pKa值

肽
物种
logβb
pKa c
脱质子化残基

L1
[MnH2L]+
17.46(7)
6.32
His

[MnHL]
11.14(9)
6.80
His

[MnL]?
4.34(6)
9.54
Owater

[MnLH?1]2?
?5.20(6)

2 × Owater

[MnLH?3]4?
?25.77(5)

a
T = 298 K, I = 0.1 M NaClO4，标准偏差在括号中给出。
b
总体稳定性常数（logβ）通过以下公式表示：β([MnHnL](n+2)+) = [[MnHnL](n+2)+]/[Mn(ii)][[L]n+][H+]n。
c
酸解离常数（pKa）表示为：pKa = logβ([MnHnL](n+2)+) ? logβ([MnHn?1L](n+1)+

溶液中首先形成的物种是[MnH2L]+。NMR滴定实验是通过在pH 4.5下逐渐向L1肽体系中添加亚化学计量的Mn(ii)来进行的。在这些酸性条件下，只观察到了轻微的光谱扰动，这与电位数据一致，表明主要的物种是[MnH2L]+，其在溶液中的含量不到20%。这表明在低pH下Mn(ii)与肽之间的相互作用有限。相比之下，在pH 7.0时，两种物种[MnHL]和[MnL]?处于平衡状态，观察到了显著且特定于残基的扰动。Mn(ii)的顺磁效应在His3、His7和Glu2上尤为明显，其次是Glu9和Asp4，这表明它们参与了Mn(ii)的配位（图7、图8和图S8、S9）。图7

对于自由肽L1（红色）和Mn(ii):L1复合物（金色）在pH 7.0、摩尔比为0.005:1的情况下，选取了1H–1H TOCSY光谱的芳香区域进行比较。在Mn(ii)配位后显示出显著化学位移扰动的信号以红色突出显示。图8

对于自由肽L1（红色）和Mn(ii):L1复合物（金色）在pH 7.0、摩尔比为0.005:1的情况下，选取了1H–13C HSQC光谱的芳香区域进行比较。在Mn2+配位后显示出显著化学位移扰动的信号以红色突出显示。这些效应在图9中进一步得到了映射，其中化学位移显著的1H和13C核用不同颜色编码，突出显示了受Mn(ii)结合影响最大的残基。图9

在pH 7时，Mn(ii):L1复合物的结构表示，显示了在Mn(ii)结合后受到显著顺磁宽化的核。映射的核与顺磁中心的空间接近度很高，突出了参与或邻近金属配位环境的关键残基。数据表明配位环境涉及两个His残基、两个Glu残基和Asp4，表明是一种由侧链供体稳定的多齿配位模式。归因于His残基脱质子的计算pKa值（6.32和6.80）略高于Fe(ii)体系中的值，这可能表明Mn(ii)与His残基之间的相互作用较弱。在pH 9.0时观察到类似的配位模式，其中主要的物种是[MnL]?，并且有类似的残基特异性扰动（图S10和S11）。这意味着[MnL]形式的Mn(ii)配位球可能与Fe(ii)复合物中的相同：{2Nim, 3COO?, H2O}。水分子的脱质子导致[MnLH?1]2?和[MnLH?3]4?的形成。与Fe(ii)类似，未能检测到[MnLH?2]3?的形式。在室温下不同pH值下记录的Mn(ii):L1的EPR光谱显示了Mn(ii)特有的六线图案，其中电子（S）和核（I）自旋均为5/2（图S12）。无论pH值如何，获得的光谱都非常相似，其特征是超精细耦合常数A约为95 G，g因子值约为2.0。这样的值与六水合Mn(ii)一致。43,44 尽管EPR光谱可以使用已知浓度的外部EPR标准进行定量分析，45 但由于难以保持每个测量样本的共振参数相同，EPR光谱仪的定量质量通常较差。46 随着pH值的升高，强度的降低仅略有显著，这表明水分子在金属离子周围的交换相当缓慢，因此金属离子的配体场变化也较慢，反映在信号没有显著宽化上。47 这可能表明在整个研究的pH范围内都存在自由的Mn(ii)离子，与图6所示的分布图一致。锌复合物

通过电位滴定可以检测到三种Zn(ii)复合物形式（表4和图10）。NMR分析在pH 4.5、7.0和9.1下进行，肽与Zn(ii)的摩尔比为1:1。图10

在Zn(ii):L1体系中形成的复合物的分布图。根据NMR实验条件计算的物种分布：[L]tot = 1 mM；Zn(ii):L = 1:1。表4

肽
物种
logβb
脱质子化残基

L1
[ZnH2L]+
17.26(7)
2 × His

[ZnL]?
5.21(4)
2 × Owater

[ZnLH?2]3?
?11.76(5)

a
T = 298 K, I = 0.1 M NaClO4，标准偏差在括号中给出。
b
总体稳定性常数（β）通过以下公式表示：β(Zn(ii)HnL) = [Zn(ii)HnL]/([Zn(ii)][L][H+]n。第一个形成的物种是[ZnH2L]+，其中只有两个His残基保持质子化状态。由于[ZnHL]是一种瞬态形式，在溶液中形成较少，因此无法确定其稳定性常数并给出可靠的标准偏差。在pH 4.5时，Zn(ii)存在下L1的NMR光谱与自由配体的光谱基本相同，没有明显的配位证据。这一观察结果与分布图一致，分布图表明在该pH下超过80%的Zn(ii)未结合。两个His残基的脱质子导致[ZnL]?物种的形成。在pH 7.0时，[ZnL]?是主要物种，强烈的且特定于肽与Zn(ii)的相互作用显而易见，这通过含有能够配位金属离子的潜在供体原子的残基的选择性和显著化学位移变化得到证明（图11、图12和图S13、S14）。图11

对于自由肽L1（红色）和Mn(ii):L1复合物（金色）在pH 7时，摩尔比为1:1的情况下，选取了1H–13C HSQC光谱的脂肪族区域进行比较。在Zn(ii)配位后显示出显著化学位移变化的信号用红色箭头突出显示。图12

在pH 7时，Zn(ii):L1复合物中质子的化学位移扰动（Δδ，ppm）和碳核的化学位移扰动分别在图12中用红色箭头突出显示。图12

在pH 7时，Zn(ii):L1复合物中的化学位移扰动。直方图显示了Zn(ii)配位后质子（a）和碳（b）核的化学位移变化（Δδ，ppm）。（c）Zn(ii):L1复合物的结构表示，其中扰动最严重的核用蓝色表示1H，用红色表示13C，对应于图(a)和(b)中观察到的最大Δδ值。值得注意的是，Zn(ii)配位产生了清晰的化学位移扰动，而不是信号宽化，表明形成了一个定义明确且稳定的金属-配体复合物。这种光谱行为表明在NMR时间尺度上交换过程缓慢至中等，这表明了强烈且特定的相互作用，而不是通常与动态或弱结合事件相关的快速交换过程。在His3、His7和Glu9处观察到了最明显的扰动，支持它们直接参与Zn(ii)的配位。Asp4和Glu2也观察到了额外的但不那么显著的位移，可能是由于肽在金属结合时的构象变化。特别是，Asp4的空间定位与His3相对，可能阻碍了直接配位。因此，[ML]形式的Zn(ii)配位球可能是{2Nim, COO?, H2O}或{2Nim, 2COO?}，其中至少有一个Asp4和Glu2残基没有参与金属结合。在pH 9.1时观察到了类似的配位模式，[ZnLH?2]3?物种得到了支持，这一点通过HSQC和TOCSY光谱中的化学位移变化得到了证实（图S15和S16）。[ZnLH?2]3?的形成是由于两个水分子的脱质子作用。在pH > 9时观察到了沉淀现象，可能是由于金属离子的水解，表明配体与金属离子的结合不够紧密。配体和金属复合物的二级结构

我们利用远紫外CD光谱研究了自由配体L1及其Fe(ii)、Mn(ii)和Zn(ii)复合物的二级结构。对于每个体系，我们在四个pH值（3.50、5.50、7.50和9.50）下记录了180–250 nm范围内的光谱。所有光谱在198 nm附近都显示出一个负带，这是随机卷曲结构的特征。49 由于将研究的金属离子添加到自由配体中并没有显著改变光谱，因此Fe(ii)、Mn(ii)或Zn(ii)的存在都没有导致主要的构象变化。因此，所有研究的体系主要展示出随机卷曲的二级结构。这与YfeA蛋白晶体中模型的序列所显示的二级结构（PDB: 6Q1C）部分一致，在该模型中位点2既处于螺旋构象也处于随机卷曲构象。CD光谱显示在图S17中。形成的金属复合物的热力学稳定性

为了比较L1对Fe(ii)、Mn(ii)和Zn(ii)的亲和力，我们计算了解离常数（Kd），这是一个常用于比较生物配体结合金属离子能力的因子。解离常数可以定义为：

其中[M]表示自由金属离子的浓度，[L]表示所有配体物种的浓度，[ML]表示所有金属-配体复合物物种的浓度。在表5中，我们收集了L1的Kd值以及其他文献中报告的含有His、Asp和Glu残基的模型肽的Kd值，以及运输（FeoB、MntH、ZupT、YfeA、MtsA）和调控（Fur、MntR）蛋白的Kd值。表5

对于Fe(ii)、Mn(ii)和Zn(ii)，研究的和生物配体的Kd [M]值进行比较

配体
Fe(ii)
Mn(ii)
Zn(ii)
参考 L1Y. pestis Site 2 YfeA
4.54 × 10?5
1.22 × 10?4
2.85 × 10?5
本工作

Ac-HDHDHDHDH-NH2
6.27 × 10?6
8.41 × 10?5
1.77 × 10?7
30

Ac-HEHEHEHEH-NH2
1.88 × 10?5
1.25 × 10?4
1.49 × 10?7
30

大肠杆菌C末端FeoB
4.75 × 10?7
7.02 × 10?7
6.31 × 10?8
28

大肠杆菌Core CFeoB
1.88 × 10?4
1.35 × 10?4
1.07 × 10?5
50

大肠杆菌ExxE基序NFeoB
2.21 × 10?3
1.31 × 10?2
—
50

大肠杆菌Fur
1.2 × 10?6
2.4 × 10?5
1.4 × 10?10
51

化脓性链球菌MtsA
4.3 × 10?6
—
—
52

枯草芽孢杆菌MntR
—
0.2 × 10?6–2 × 10?6
—
53

Y. pestis YfeA
—
1.78 × 10?8
6.6 × 10?9
21

苍白密螺旋体TroA
—
7.1 × 10?9
2.25 × 10?8
54

耐辐射大肠杆菌MntH
—
1.9 × 10?4
—
55

聚球藻ZnuA
—
—
7.3 × 10?9
56

a
Kd值计算如下：

在pH = 7.0时。[M]表示自由金属离子的浓度，[L]表示所有配体物种的浓度之和，[ML]表示所有金属-配体复合物物种的浓度之和。L1复合物的计算Kd值与含有类似结合残基的模型肽的值范围一致，Zn(ii)复合物的差异更为显著，这可能是由于模型肽中存在更多的组氨酸残基以及Zn(ii)偏好多组氨酸配位。57–59 L1含有两个Glu和一个Asp残基，其对Fe(ii)和Mn(ii)离子的亲和力与模型肽Ac-HEHEHEHEH-NH2相当，但低于含有Asp残基的肽。该研究结果与以下陈述一致：序列中存在的酸的类型对复合物的稳定性具有重要意义，而Mn(II)和Fe(II)离子更倾向于与Asp结合而非Glu。与其他Fe(II)和Mn(II)转运蛋白相比，L1对所研究的金属离子的亲和力较低，这表明其金属结合能力相对较弱。本研究中测定的YfeA位点2的肽模型对Mn(II)和Zn(II)的亲和力明显低于之前对全长蛋白的报告值。然而，这些数据很可能指的是主要的金属结合位点，而非位点2，因为在ITC实验中只发现了1:1（M:L）的结合化学计量比。后续通过晶体学实验发现，位点2位于表面，并利用水分子来完成配位球，因此其金属结合方式更为不稳定。这与我们测得的位点2肽模型的较低亲和力相符。需要注意的是，肽系统无法完全反映全长蛋白中复杂的相互作用网络；因此，天然YfeA中位点2的亲和力可能与本研究中呈现的值有所不同，尽管差异可能不大。由于位点2位于表面，它与蛋白质其他部分的相互作用较少。L1对Zn(II)的亲和力高于对Fe(II)和Mn(II)的亲和力，这可能解释了为什么在晶体学实验中确定它为位点2的首选金属离子。鉴于YfeA无法转运Zn(II)，蛋白质可能会采用构象变化等机制来确保正确金属离子的结合。然而，情况未必如此，因为已有研究表明Zn(II)会干扰YfeA介导的Fe(II)转运；因此，蛋白质所采用的策略可能不足以阻止锌的结合。此外，位点2可能并不直接参与YfeA向YfeABCD系统膜转运组分的金属转移，而是在潜在的蛋白质-蛋白质相互作用中起作用。在这种情况下，结合正确的金属离子底物可能没有主要金属结合位点那么关键。

我们研究了Y. pestis YfeA位点2的肽模型的金属结合特性。所有研究的金属离子都由两个组氨酸残基结合，同时涉及天冬氨酸和谷氨酸残基的不同程度。位点2模型对Fe(II)、Mn(II)和Zn(II)的亲和力较低，表明其结合较为不稳定，这与位点位于表面的事实一致。虽然位点2已被证实参与了蛋白质-蛋白质相互作用，但金属离子在位点2与YfeA主要金属结合位点之间的转移机制尚未明确。由于位点2的结合不稳定，该区域可能作为YfeA的初始金属结合位点，随后金属离子再转移到主要金属结合位点。然而，由于两个位点之间的距离超过26 ?，金属的转移可能会很困难。YfeA位点2的肽模型对Zn(II)的亲和力略高于对Fe(II)的亲和力。有趣的是，目前尚未发表出带有Fe(II)结合位点2的YfeA晶体结构，这表明肽溶液研究与全长蛋白结晶研究之间的条件差异阻碍了铁的结合。这可能是由于肽模型位点2的构象与天然蛋白中位点的构象不同所致。尽管如此，我们的发现增进了对位点2金属结合特性的理解，并为仍待探索的Fe(II)配位化学领域做出了有价值的贡献。

作者声明与本研究无关的任何利益冲突。

作者表示，用于撰写手稿的数据将存储在Wroclaw大学的RODBUK Cracow开放研究数据存储库中。所有支持数据均包含在补充信息中，包括不同条件下的水解常数、ESI-MS数据以及金属-肽系统的NMR和CD光谱。补充信息（SI）可查阅，请访问DOI：https://doi.org/10.1039/d6dt00422a。

我们感谢波兰国家科学中心（NCN，2022/47/I/ST4/02354）的财政支持。M. O.还获得了波兰国家科学中心（UMO-2021/43/D/ST4/01231）的支持。研究结果是在COST Action CA18202项目“NECTAR – Equilibria and Chemical Thermodynamics Advanced Research”的框架下获得的，该项目得到了COST（欧洲科技合作组织）的支持。