分析挑战与北西班牙市政污水处理厂生物固体中抗生素的存在情况

《Journal of Chromatography A》：Analytical challenges and occurrence of antibiotics in biosolids from municipal sewage treatment plants in North Spain

　　A. Barros | G. Castro | M. Ramil | I. Rodríguez
摘要

抗生素是来自市政污水处理厂（STPs）的最令人担忧的制药污染物之一，它们既存在于处理后的废水中，也存在于脱水后的生物固体中。本研究考察了使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定污水废物中十种抗生素时面临的关键分析挑战。此外，还展示了这些抗生素在不同污水处理厂脱水生物固体中的分布结果。氟喹诺酮类化合物由于在玻璃器皿上的吸附作用、与样品基底的强烈相互作用以及LC-MS/MS分析过程中的信号抑制效应而被认为是最具问题的化合物。通过使用缓冲乙腈-水溶液（pH 4.4，1:1）对冻干样品进行超声处理，优化了提取方法，获得了74%至108%的平均回收率，且在不同类型的污泥中变化幅度适中。在对多种抗生素进行同时定量时，氟喹诺酮类的信号衰减程度有所不同，这取决于样品基底。对于这类化合物，可以通过使用混合模式（反相和阳离子交换）吸附剂对提取物进行分离来减轻信号抑制现象。结合使用同位素标记的替代标准品，基于溶剂的校准方法能够实现所有目标化合物的准确定量，其定量限低于5 ng g?1。阿奇霉素、克拉霉素、诺氟沙星、环丙沙星和氧氟沙星在脱水生物固体中普遍存在，其中克拉霉素的中位浓度范围为7 ng g?1，氧氟沙星的最高浓度达到1761 ng g?1。通过对处理后废水和生物固体排放物的质量平衡评估，确定了阿奇霉素、环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星是需要重点监测的抗生素。

1. 引言
抗生素因其能够促进抗生素抗性基因（ARGs）的产生以及这些基因可能整合到细菌基因组中而成为新兴污染物中最令人担忧的类别[1, [2], [3]]。市政废水是抗生素进入环境的主要途径[4]。它们在污水处理过程中的命运取决于在水相中的降解或转化与在污泥中的吸附之间的平衡[5]。尽管抗生素的极性从中等（如大环内酯类）到高不等，且具有两性性质（如氟喹诺酮类），但无论采用何种污泥处理技术，各种家族的抗生素残留物始终可以在最终脱水污泥（以下简称生物固体）中被检测到[6,7]。抗生素残留物可能会影响参与关键生化途径的微生物群落，包括那些控制厌氧消化过程中沼气产生的微生物[8]，以及污水处理厂中其他有害污染物的生物降解[9]。此外，这些化合物残留在生物固体和/或其衍生产品（如堆肥[10]、蚯蚓堆肥[11]和污泥消化物[12]）中，引发了关于将其作为肥料施用于农业或林业土壤时可能产生的环境影响的担忧。

从控制实验室的角度来看，生物固体的内在复杂性，以及有效提取某些化合物家族所需的特定样品制备条件[12]，成为阐明市政污水处理厂抗生素质量平衡的主要障碍。在污泥和生物固体中灵敏检测抗生素时的两个关键步骤是：(1) 有效、同时提取物理化学性质差异较大的化合物群体；(2) 减轻由液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）引起的信号抑制，从而保证其可检测性。

已经测试了加压液相提取（PLE）、超声辅助提取（UAE）和QuEChERS等方法来从生物固体、污泥及相关基质（如粪便）中提取抗菌剂。对于氟喹诺酮类化合物，提出了使用含极性有机溶剂和超纯水并调节至酸性pH值的溶剂混合物进行PLE提取[13], [14], [15], [16]。对于大环内酯类、磺胺类和三甲氧嘧啶等极性较低的抗生素，在相似的PLE条件下，纯有机溶剂（如甲醇）通常比其水溶液具有更高的提取效率[14]。基于QuEChERS协议的固液提取方法也能在从湿润污泥中提取大环内酯类和磺胺类化合物时获得定量结果[17]。然而，对于氟喹诺酮类的结果并不一致：有些研究报道提取效率较低，范围在10%至20%之间[18,19]，而对QuEChERS协议的改进（包括加入超声步骤）虽然提高了氟喹诺酮类的回收率，但降低了某些大环内酯类（克拉霉素和红霉素）和磺胺类的回收率[20]。

本研究的目标是：(i) 识别影响五种抗菌类别（大环内酯类、喹诺酮类、磺胺类、林可酰胺类和二氨基嘧啶类）抗生素LC-MS/MS测定效果的关键因素；(ii) 评估不同变量对其提取效率和选择性的影响；(iii) 提出一种简化的样品制备流程，以达到足够低的定量限（LOQs），以便监测市政污水处理厂产生的生物固体和不同类型污泥中的这些抗生素水平；(iv) 根据通过脱水污泥和处理后废水的相对排放量，确定必须在生物固体中检测的抗生素。

2. 材料与方法
2.1. 溶剂、吸附剂和标准品
超纯水在实验室中使用Geni U系统（Rephile，上海，中国）制备。LC-MS级乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）、甲酸（FA）、NaOH和柠檬酸由Merck（德国达姆施塔特）提供。聚丙烯（PP）试管（15 mL和50 mL）和用于QuEChERS提取的吸附剂（AOAC和EN模式）[21]购自Waters（美国马萨诸塞州米尔福德）。固相提取（SPE）柱子（OASIS HLB，200 mg；和OASIS MCX，150 mg）也来自Waters。石墨化碳和C18吸附剂由Merck提供。 pH 4.4的水性缓冲液是通过将0.2 M柠檬酸溶液与所需体积的1 M NaOH混合制备的。

天然抗生素（阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、克林霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、磺胺甲噁唑和三甲氧嘧啶）及其同位素标记类似物（阿奇霉素-d3、克拉霉素-d3、环丙沙星-d8、左氧氟沙星-d3、磺胺甲噁唑-13C6和三甲氧嘧啶-d9）的标准品分别从Merck和Cymit Quimica（西班牙巴塞罗那）购买。目标化合物的CAS编号和化学结构作为补充信息提供在表S1中。每种化合物的单个溶液分别在MeOH中制备[20,22]。进一步的稀释和天然与标记化合物的混合溶液在同一溶剂中进行。单个标准品及其混合物储存在PP试管中，置于-20 °C。包含从0.050 ng mL?1到100 ng mL?1（n=9）不同浓度的天然抗生素的校准溶液，以及固定浓度的标记化合物（8 ng mL?1），在pH 4.4缓冲的ACN:H2O（1:1）混合液中制备。

2.2. 样品和样品制备
生物固体来自西班牙北部23个处理市政污水的污水处理厂。其中四个工厂包含厌氧消化单元，在污泥脱水前在适中条件下运行。其余设施在污泥处理过程中未采用任何特殊处理，仅进行了离心步骤以将污泥中的水分含量降至70-72%。此外，还从一个大型污水处理厂获得了不同类型的污泥，该工厂包括热水解单元，随后在脱水前进行厌氧污泥消化。处理过的废水（时间比例积分样品，每隔30分钟采集一次，持续24小时）和生物固体也来自三个污水处理厂。所有样品均由运营这些污水处理厂的公司直接提供。收到样品后，半固态样品（污泥和生物固体）被冷冻、冻干、用研钵捣碎，并储存在-20 °C待提取。处理过的废水在分析前也储存在-20 °C。

在方法开发过程中，评估了不同的提取技术和条件。在这些实验中，将来自多个污水处理厂的冻干污泥混合后得到的0.5 g样品添加了九种抗生素的混合物（这些初步实验中未使用恩诺沙星），并过夜保存后再进行提取。

QuEChERS提取使用5 mL含有2.5% FA的ACN进行。样品首先用4 mL超纯水润湿，然后分别加入符合AOAC（硫酸镁、氯化钠和醋酸钠）或EN（硫酸镁、氯化钠、柠檬酸氢二钠和柠檬酸氢三钠）模式的酸化ACN和盐类[23]。手动搅拌和离心后，回收有机相并过滤。加压液相提取（PLE）在11 mL不锈钢细胞中进行，使用Dionex（美国森尼韦尔）的ASE200提取器，条件与先前研究中的相同[16]。简而言之，将0.5 g样品放置在1 g硅藻土上方。剩余的自由体积填充相同的吸附剂。提取在90 °C下进行，细胞在1500 psi的压力下加压，进行两个5分钟的循环。测试了pH 4.4的缓冲（ACN:H2O，1:1）和非缓冲混合物作为提取溶剂。对于超声辅助提取（UAE），实验在超声浴中进行，使用不同体积（10 mL和25 mL）的MeOH:H2O和ACN:H2O（pH 4.4）溶液。

在净化步骤中，测试了不同的策略：i) 使用反相HLB柱子对用超纯水稀释后的提取物进行SPE浓缩；ii) 使用混合模式（MCX）柱子对未稀释的提取物进行分离；iii) 通过向提取物的一部分添加石墨化碳和/或C18吸附剂进行分散SPE（d-SPE）。

测试技术的提取效率（EEs，%）计算为添加了2000 ng g?1抗生素的提取物与未添加抗生素的提取物之间响应差异的比率，再除以添加抗生素后与未添加抗生素的提取物之间响应差异的比率，然后乘以100。LC-MS/MS分析过程中的基质效应（MEs，%）通过添加了40 ng mL?1抗生素的提取物与未添加抗生素的提取物之间响应差异的标准化比率来估计，再除以参考标准的响应值。因此，MEs约为100%表示样品提取物和基于溶剂的标准的电离效率相当，而标准化比率低于和高于100%分别表示信号抑制和信号增强[24]。

在最佳条件下，将0.5 g冻干样品称量在50 mL PP试管中，然后加入25 mL pH 4.4缓冲的ACN:H2O（1:1）。样品在室温下进行UAE处理30分钟，之后以3500 rpm离心10分钟。取一部分提取物（2 mL）并与40 mg C18涡旋混合。上清液通过0.22 μm注射过滤器后进行LC-MS/MS分析。

2.3. 测定条件
抗生素的测定使用Agilent（美国威尔明顿）1290型超高效液相色谱（UPLC）系统与Agilent 6495D三重四极杆质谱仪（QqQ-MS）联用，配备离子漏斗电喷雾（ESI）源。目标化合物的准确产物离子谱由Agilent 6550四极杆飞行时间（QTOF）MS系统记录，该系统也与Agilent 1290 UPLC系统结合使用。色谱分离在Zorbax Eclipse Plus C18柱（50 mm x 2.1 mm，1.8 μm）中进行，该柱子也由Agilent提供。柱子温度保持在30 °C。流动相由超纯水（A）和甲醇（B）组成，两者都含有0.1%的FA，流速为0.3 mL min?1，按以下顺序流动：5% B（0-2分钟），100% B（15-16分钟），5% B（16.1-19分钟）。ESI源以正模式（ESI+）运行，生物固体和污泥提取物的注入体积设置为1 μL。每种化合物及其相关替代标准品的保留时间和对应关系在表1中列出。表1还列出了线性范围和仪器定量限（iLOQs）。

表1. 天然化合物及其同位素标记类似物的LC-ESI-MS/MS测定参数、线性范围和仪器定量限（iLOQs）。
化合物 | 保留时间（分钟）[M+H]+离子 | Q1 (CE, V) | Q2 (CE, V) | Q2/Q1比率 | iLOQ (ng mL?1)
--- | --- | --- | --- | --- | ---
阿奇霉素 | 8.77 | 74 | 9.5 | 11 | 6 | 83 (50) | 1.1 | 0.99 | 80.05
环丙沙星 | 7.10 | 33 | 2.1 | 31 | 4 | 21 | 1.5 | 50.99 | 0.02
克拉霉素 | 11.62 | 74 | 8.5 | 15 | 8 (31) | 59 | 0.5 | 0.99 | 0.02
克林霉素 | 9.38 | 42 | 5.2 | 12 | 6.1 (31) | 37 | 7.2 (19) | 0.08 | 0.99 | 0.05
恩诺沙星 | 7.28 | 36 | 0.23 | 16 | 2 (31) | 34 | 2.2 (20) | 5.0 | 0.99 | 0.05
左氧氟沙星 | 6.82 | 36 | 2.0 | 26 | 1.1 (31) | 31 | 8 (21) | 1.4 | 0.99 | 0.02
氧氟沙星 | 6.84 | 25 | 4.1 | 92 (27) | 15 | 6 (13) | 0.77 | 0.99 | 0.1
磺胺甲噁唑 | 6.16 | 29 | 1.1 | 23 | 0.2 (25) | 12 | 3 25) | 0.6 | 0.99 | 0.02
阿奇霉素-d3 | 8.76 | 75 | 2.5 | 11 | 6 (50) | 83 (50) | 1.1 | --- |
克拉霉素-d3 | 11.67 | 51 | 1.5 | 16 | 1 (31) | 59 | 3.5 (15) | 0.13 | ---
环丙沙星-d8 | 7.05 | 34 | 0.22 | 35 | 0 (42) | 32 | 2.2 (21) | 1.7 | ---
左氧氟沙星-d3 | 6.83 | 65 | 26 | 1.0 (31) | 32 | 1.0 (19) | 0.91 | ---
磺胺甲噁唑-13C6 | 6.79 | 26 | 0.19 | 8 (27) | 16 | 2 (13) | 0.78 | ---
三甲氧嘧啶-d9 | 6.05 | 30 | 0.22 | 33 | 1 (25) | 12 | 3 25) | 0.6 | 0.99 | 0.02

a和b表示目标化合物与标记为替代标准品的氘代物质之间的对应关系。在生物固体提取物和直接注入的处理过废水样品中识别抗生素是基于保留时间和响应比率（Q2）与相应校准标准品的匹配度，在± 0.1分钟和± 30%的范围内。仪器定量限（iLOQs）是使用基于溶剂的标准品计算得出的，考虑了每种化合物的Q1和Q2产物离子的最小信噪比为10。线性评估是通过将每种化合物的Q1跃迁响应与分配的SS所得响应进行校正来完成的，见表1。从生物固体和污泥中提取的抗生素浓度是使用基于溶剂的标准品计算的，这些标准品含有与污泥提取物中预期相同的SS浓度，见表1。该方法的准确性是通过在两种不同类型的生物固体上获得的回收率来评估的，这些生物固体在不同浓度下被加标。生物固体的程序LOQs（mLOQs）是根据iLOQs估计的，考虑到样品量（0.5克）和提取体积（25毫升），并对生物固体的 proposed 方法的 EEs 和 MEs 进行了校正，当它们超出可接受范围（80%到100%）时。废水中的抗生素残留物是使用与基质匹配的校准标准品进行量化的，这些标准品是通过向处理后的废水样品中添加逐渐增加的抗生素浓度（n=6）来制备的，浓度范围从0.05 ng mL-1到1.0 ng mL-1。过滤后的（0.22 μm）处理后废水样品是使用与生物固体提取物相同的LC-MS/MS条件进行分析的，但注射体积增加到了10 μL。从3个不同的污水处理厂（STPs）提取的生物固体和处理后的废水中测得的抗生素浓度被用来评估每种基质对市级STPs抗生素排放的相对贡献。

3. 结果与讨论
3.1. LC-MS/MS测定条件
在本研究考虑的抗生素中，大环内酯类（阿奇霉素、克拉霉素和红霉素）和氟喹诺酮类（环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和恩氟沙星）表现出一些共同的特点，这些特点影响了它们的色谱行为、稳定性、离子化和碎片化模式，从而影响了它们通过LC-MS/MS的检测能力。首先，这些物质在C18柱中的保留时间受到移动相中添加的修饰剂的影响。使用醋酸铵（5 mM）作为移动相时，氟喹诺酮类物质出现了拖尾峰，这提高了它们的LOQs，与使用FA（0.1%）作为修饰剂相比。其余抗生素的色谱谱型几乎没有受到所选修饰剂的影响；然而，阿奇霉素和克拉霉素在使用醋酸铵时会发生共洗脱。由于它们的前体离子（[M+H]+）相差1 Da，并且它们的产物离子谱有若干共同片段（在标称m/z值83、116、158和591处的离子，见图S1），色谱共洗脱可能导致在实际样品分析过程中出现误识别问题。使用FA（0.1%）作为移动相会使大环内酯类阿奇霉素和克拉霉素的酸-碱平衡向它们的二价和单价形式偏移，从而缩短了第一种化合物的保留时间，改善了它们的色谱分离效果。在酸性pH下，氟喹诺酮类物质保持带正电荷的状态，显示出比在中性pH下使用醋酸铵作为修饰剂时更低的极性和更高的溶解度，这解释了这些化合物峰值形状的改善。
目标化合物的储备溶液和混合物以μg/mL的范围制备在MeOH中；然而，对于相同溶剂中的低浓度和亚ng/mL范围的标样，发现了问题。图S2显示了在MeOH中制备的环丙沙星校准标样的响应与浓度之间的关系图，这些标样储存在玻璃和PP制成的2 mL自动进样器小瓶中。在第一种情况下，响应（Q1跃迁的峰面积）与浓度（从0.1到100 ng mL-1）之间存在指数依赖关系，而储存在PP小瓶中的标样则呈现线性趋势。其余的氟喹诺酮类和阿奇霉素也观察到了类似的行为，表明这些化合物显著吸附在了自动进样器玻璃小瓶的表面。由于玻璃在低浓度下的吸附作用特别明显，因此得到了指数响应图。其他化合物（克林霉素、磺胺甲噁唑和三甲氧苄氨嘧啶）无论使用哪种类型的自动进样器小瓶，都显示出线性响应，见图S2。对于在MeOH、ACN或ACN:FA（97.5:2.5）中制备并储存在玻璃容器中的氟喹诺酮类和阿奇霉素的校准标样，检测到了非线性响应，但在PP容器中则没有这种现象。Fabregat-Safont等人[25]之前已经报告过这种行为。作者指出，尽管阿奇霉素有自己的同位素标记SS，但相对响应的可重复性较差，表明这两种化合物的表现不同，因此标记的阿奇霉素无法正确校正信号随序列的降低[25]。为此，通过将校准标样在1:1的有机溶剂（MeOH或ACN）和超纯水中稀释来避免了这些化合物在玻璃容器上的吸附。此外，在从生物固体中提取抗生素时仅使用PP材料，用于储存以MeOH制备的浓缩标样，并用于储存浓度范围从0.05到100 ng mL-1的校准标样。废水样品也分别储存在高密度聚乙烯（HDPE）罐中，注射样品则储存在PP自动进样器小瓶中。
在一些先前关于废水样本中氟喹诺酮类（环丙沙星和诺氟沙星）的LC-ESI(+)-MS/MS分析的研究中报告了另一个问题，即它们结构中不同官能团的质子化[25]。同一化合物的质子体之间的平衡取决于所考虑样本的复杂性。此外，质子体表现出不同的产物离子，影响了它们在复杂环境样本中的测定可靠性[25]。在这项研究中，没有观察到基于溶剂的标准品和污泥提取物中的氟喹诺酮类准确产物离子谱之间的差异。图1显示了在QTOF-MS光谱中获得的环丙沙星产物离子的准确质量（m/z分别为314.1297、288.1501、245.1077和231.0560），这些光谱是针对原始污泥（A）、配备有厌氧消化单元的STP处理后的生物固体（B）以及基于溶剂的标准品（C）在两种不同碰撞能量（20 eV和40 eV）下获得的。
在“材料与方法”部分总结的测定条件下，UPLC-QqQ-MS系统为浓度范围从0.05到100 ng mL-1的抗生素提供了线性响应，测定系数（R2）高于0.998，iLOQs的范围从0.02 ng mL-1到0.1 ng mL-1，考虑到注射体积为1 μL，见表1。

3.2. 样品制备条件
表2总结了九种抗生素的EEs（在本研究的初步实验中无法获得恩氟沙星的标准品），这些抗生素来自一个加标的生物固体池（加标浓度为2000 ng g-1），在2.2节描述的不同条件下（提取技术和溶剂）。提取参数的选择基于文献数据，并考虑了化合物的极性，同时避免了使用与LC-MS分析兼容性低的添加剂（例如磷酸盐衍生的缓冲液），这些添加剂在先前的研究中使用荧光检测进行LC分离后有所报道[4]。五种化合物在所有考虑的条件下的EEs均高于70%。红霉素的表现与其他两种大环内酯类不同，在用MeOH:H2O超声处理和在柠檬酸盐存在下的QuEChERS提取过程中，其EEs较低，见表2。红霉素的不稳定性可能解释了它们表观提取效率的差异[26]。氟喹诺酮类的EEs受到所选技术和溶剂的影响很大。QuEChERS和使用MeOH:H2O时UAE的EEs都非常低（EEs < 35%，见表2），这与一些作者之前发布的数据相符[19,27]。使用pH 4.4的ACN:H2O缓冲液，并且在PLE或UAE条件下，三种氟喹诺酮类（环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星）的EEs都超过了60%。缓冲溶液通过促进它们羧基的质子化（pKa值在5.1到6.1之间，见表S1）降低了氟喹诺酮类的极性。在pH 4.4下，这些抗生素保持带正电荷的状态，而不是像在中性pH下使用醋酸铵作为修饰剂时那样以两性离子的形式存在，这解释了这些化合物峰值形状的改善。
首先研究了将污泥样本提取物稀释至100 mL（4倍稀释因子）后进行纯化和浓缩的可能性，然后通过过滤和HLB柱对25 mL的提取物进行SPE浓缩[16]。在这些条件下，氟喹诺酮类没有被SPE吸附剂定量保留，其穿透百分比在20%到25%之间。这种行为与这些化合物相对于本研究中涉及的其他抗生素的更高极性一致，见表S1。考虑到大多数化合物在其结构中包含碱性基团，测试了使用混合模式吸附剂（反相和阳离子交换特性）作为替代的清洗方法。将加标的生物固体提取物的UAE fractions（2 mL）通过MCX 150 mg SPE柱。这种吸附剂提供的相互作用与通常推荐用于从水样中浓缩氟喹诺酮类的反相和离子交换聚合物的组合相似[4]。之后，用2 mL的MeOH冲洗该吸附剂，然后是2 mL的MeOH:H2O:NH3（49:49:2）和MeOH:NH3（98:2） fractions。上述 fractions中每种化合物的归一化响应显示在图S3中。除了磺胺甲噁唑外，其余化合物在通过SPE吸附剂的缓冲提取物和MeOH冲洗 fractions（各2 mL）中都显示出可忽略或较低（克拉霉素和红霉素）的归一化响应。从MCX吸附剂中洗脱保留的抗生素需要不同的溶剂，这与它们的极性范围相对应。因此，使用含有2% NH3的2 mL MeOH:H2O（1:1）溶液恢复了氟喹诺酮类，而极性较小的大环内酯类（克林霉素和三甲氧苄氨嘧啶）则需要使用2 mL MeOH:NH3（98:2）来有效打破它们与吸附剂中正电荷基团的静电相互作用并使其释放出来。为了防止在清洗步骤中稀释提取物，在进一步的实验中，加载到MCX柱中的提取物体积增加到4 mL，然后用MeOH（4 mL）冲洗吸附剂，并且通过2 mL MeOH:H2N（49.5:49.5:1）的单一fraction洗脱保留的化合物。在这些条件下，四种氟喹诺酮类——阿奇霉素、克林霉素和三甲氧苄氨嘧啶——可以在4 mL碱性fraction中分离出来，其响应与未清洗的复杂提取物相似甚至更高，见图S4A。图S4A展示了生物固体提取物通过MCX吸附剂、冲洗过程以及从MCX柱中收集的碱性 fractions的图片，表明后者的复杂性较低。总体而言，MCX分级策略可能是一种适合七种化合物的清洗方法，这些化合物可以从中性干扰物中分离出来。然而，这种方法对于克拉霉素、红霉素和磺胺甲噁唑无效。前两种化合物分布在几个fraction中，而磺胺甲噁唑则没有在MCX吸附剂中被保留，见图S4。最终评估的清洗策略涉及在d-SPE模式下使用亲脂性吸附剂[19]。预计在UAE样品提取物中添加少量C18可以去除一些强亲脂性化合物，而不会保留更极性的抗生素。图S5中显示的数据证实，抗生素的响应在原始提取物和经过C18涡流处理的提取物之间没有变化（向2毫升提取物中添加了40毫克的吸附剂）。遗憾的是，单独使用C18未能显著降低提取物的视觉复杂性（见图S5）。石墨化碳解决了这个问题；然而，即使少量的这种吸附剂也能从ACN:H2O提取物中保留大部分抗生素，其中环丙沙星和氧氟沙星的损失高达90%（数据未显示）。由于本研究的主要目的是同时测定生物固体和污泥中的这十种化合物，除非另有说明，否则在本文报告的后续实验中采用了每毫升提取物使用20毫克C18的分散净化方法。

在污水处理厂（STPs）产生的固体废物的组成和性质受到污泥处理过程中所采用的具体工艺（如热水解和厌氧消化）的影响[28]。这些处理可能会在样品制备和测定步骤中分别影响提取效率（EEs）和基质效应（MEs）。表3总结了同一STP不同阶段获得的污泥的EEs：来自初级和水处理单元的原始污泥、经过热水解后的污泥、经过厌氧消化后的污泥以及使用UAE脱水后的生物固体。全球平均EEs显示在图S6中。阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素和三甲氧苄啶的EEs几乎不受污泥类型的影响，其全球平均值在95%到109%之间，标准偏差低于10%。其余抗生素的平均EEs范围从诺氟沙星的74%到磺胺甲噁唑的91%不等（见图S6），某些抗生素的EEs因污泥类型而异，特别是在环丙沙星的情况下（见表3）。表3中编译的不同类型污泥和生物固体的EEs优于使用有机溶剂与FA混合物的UAE方法得到的结果，后者的氟喹诺酮类化合物的EEs低于30%[19]。

表3. 来自同一STP（配备热水解和厌氧消化单元）的污泥的超声波辅助提取后经C18净化处理的提取效率（EEs，%）和基质效应（MEs，%）的总结。三次提取的平均值及标准偏差（SD）在括号内表示。

| 化合物 | EEs (%) | SD | MEs (%) | SD |
|------|-------|--------|--------|
| 原始污泥 | 112 (4) | 114 (1) | 93 (6) | 98 (5) |
| 热水解污泥 | 112 (2) | 100 (6) | 94 (1) | 93 (3) |
| 厌氧消化污泥 | 114 (1) | 51 (10) | 66 (3) | 71 (3) |
| 生物固体 | 127 (2) | 104 (6) | 63 (4) | 75 (3) |
| 环丙沙星 | 112 (2) | 94 (1) | 51 (10) | 67 (1) |
| 克拉霉素 | 93 (3) | 90 (13) | 98 (1) | 75 (10) |
| 林可霉素 | 106 (1) | 115 (1) | 107 (2) | 83 (5) |
| 诺氟沙星 | 93 (3) | 85 (3) | 64 (11) | 44 (7) |
| 磺胺甲噁唑 | 92 (3) | 91 (3) | 61 (8) | 72 (2) |
| 氧氟沙星 | 92 (3) | 91 (3) | 68 (8) | 79 (3) |

表3还总结了上述污泥类型经C18吸附剂净化处理后的MEs。与基于溶剂的标样相比，离子化效率的变化因化合物和样品而异。阿奇霉素和克林霉素的离子化效率在样品间没有显著差异，其归一化响应值范围为81%至127%。对于其他化合物，信号抑制程度从20%到80%不等。诺氟沙星、氧氟沙星和磺胺甲噁唑的信号抑制最为明显，而热水解后的污泥具有最复杂的基质，导致大多数化合物（阿奇霉素和克林霉素除外）的离子化效率与基于溶剂的标样相比有显著差异（见表3）。表3中编译的MEs与先前研究中的结果一致，即通过LC-MS/MS测定污泥[19,20]和家禽粪便[29]中的氟喹诺酮类抗生素时，信号抑制效应在60%到90%之间。鉴于这些依赖于样品的MEs，使用同位素标记的类似物变得必要，以提高在不同类型污泥中测定抗生素残留物的可靠性，而无需为每个样品进行耗时的基质匹配校准。

进一步研究了通过MCX吸附剂（见图S4）分离碱性化合物（阿奇霉素、克林霉素、三甲氧苄啶）和两性抗生素（氟喹诺酮类）与中性化合物的潜力，以确定这种方法是否可以降低表3中报告的MEs。大环内酯类克拉霉素和红霉素以及磺胺甲噁唑未被MCX吸附剂吸附；因此，这种净化策略不适用于这些化合物。图2比较了加标提取物（用相同样品的非加标等分液校正后）与参考标准物相比的归一化响应。所显示的数据对应于最复杂的基质：热水解后的污泥。与使用C18的d-SPE相比，应用MCX分级策略时，三甲氧苄啶和四种氟喹诺酮类的信号抑制程度降低。阿奇霉素和克林霉素的归一化响应范围在80%到120%之间。

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图2. 根据净化技术，选定抗生素的基质效应（MEs）作为归一化响应与参考标准物的关系。数据对应于来自同一类型污泥的加标组分，n=3次重复实验。

总之，MCX分级似乎是一种适用于专门针对碱性和两性抗生素的分析方法的策略；然而，它不适用于也包含该吸附剂无法保留的中性化合物的多类化合物分析方法。

3.3. 方法性能
在来自两个不同STPs的最终生物固体中研究了该程序的准确性，这些生物固体分别经过了厌氧消化处理（添加了50 ng g-1和200 ng g-1的污染物）。在每次实验中，添加的阿奇霉素、环丙沙星和氧氟沙星浓度是其他抗生素的10倍（分别为500 ng g-1和2000 ng g-1），以补偿它们在生物固体基质中的残留差异。准确性使用基于溶剂的标样进行测定。总体而言，校正后的回收率在73%到111%之间，相对标准偏差（RSD）低于10%。对于克林霉素，回收率范围在65%到94%之间（见表4）。这种较高的变异性可能是由于缺乏该化合物的氘代类似物。因此，分配的SS（阿奇霉素-d3）在补偿克林霉素的离子化效率变化方面的能力有限。最后，由于该基质中的高残留量，无法计算来自厌氧STP的生物固体中诺氟沙星的回收率（最低添加浓度为50 ng g-1）。最低检测限（mLOQs）在1 ng g-1到5 ng g-1之间（见表4），与先前的研究结果一致[5,17,30]，并且能够同时测定不同化学类别的抗生素。与应用于复杂固体基质（例如粪便）的既定多类抗生素测定方法相比，所提出的方法使LOQ低一个数量级[29]。此外，它简化了工作流程，无需浓缩初级提取物[6]。

表4. 来自两个未经过污泥处理设施和厌氧消化处理的STPs的生物固体加标样品的分析程序准确性，n=3次重复实验，以及程序LOQs（mLOQs）。

| 化合物 | 无处理 | 厌氧消化 | mLOQs (200 ng g-1) | mLOQs (50 ng g-1) | 回收率 (%) | RSD |
|------|------|--------------|--------------|-----------|--------|
| 阿奇霉素 | 104 (7) | 98 (2) | 96 (1) | 100 (1) | 2.5 |
| 环丙沙星 | 102 (6) | 73 (3) | 99 (2) | 92 (6) | 2 |
| 克拉霉素 | 91 (3) | 87 (6) | 102 (3) | 80 (2) | 1 |
| 林可霉素 | 94 (3) | 65 (4) | 72 (9) | 66 (2) | 2.5 |
| 氧氟沙星 | 97 (4) | 92 (2) | 95 (2) | 83 (2) | 5 |
| 红霉素 | 97 (3) | 83 (2) | 92 (3) | 74 (9) | 1 |
| 诺氟沙星 | 131 (6) | 91 (7) | 111 (6) | n.e. |
| 氧氟沙星 | 103 (3) | 85 (2) | 101 (2) | 90 (4) | 2 |
| 磺胺甲噁唑 | 106 (2) | 96 (2) | 100 (1) | 84 (10) | 5 |
| 三甲氧苄啶 | 97 (3) | 85 (2) | 95 (2) | 89 (3) | 1 | n.e. |

表3还总结了上述污泥类型经C18吸附剂净化处理后的MEs。与基于溶剂的标样相比，离子化效率的变化因化合物和样品而异。阿奇霉素和克林霉素的离子化效率在样品间没有显著差异，其归一化响应值范围为81%至127%。对于其他化合物，信号抑制程度从20%到80%不等。氧氟沙星、氧氟沙星和磺胺甲噁唑的信号抑制最为明显，而热水解后的污泥具有最复杂的基质，导致大多数化合物的离子化效率与基于溶剂的标样相比有显著差异（阿奇霉素和克林霉素除外）。表3中编译的MEs与先前的研究结果一致，即通过LC-MS/MS测定污泥[19,20]和家禽粪便[29]中的氟喹诺酮类抗生素时，信号抑制效应在60%到90%之间。鉴于这些依赖于样品的MEs，使用同位素标记的类似物变得必要，以提高在不同类型污泥中测定抗生素残留物的可靠性。

为了进一步研究通过MCX吸附剂分离碱性化合物（阿奇霉素、克林霉素、三甲氧苄啶）和两性抗生素（氟喹诺酮类）与中性化合物的潜力，以确定该方法是否可以降低表3中报告的MEs。大环内酯类克拉霉素和红霉素以及磺胺甲噁唑未被MCX吸附剂吸附；因此，这种净化策略不适用于这些化合物。图2比较了加标提取物（用相同样品的非加标等分液校正后）与参考标准物相比的归一化响应。所显示的数据对应于最复杂的基质：热水解后的污泥。与使用C18的d-SPE相比，应用MCX分级策略时，三甲氧苄啶和四种氟喹诺酮类的信号抑制程度降低。阿奇霉素和克林霉素的归一化响应范围在80%到120%之间。

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为了总结，MCX分级似乎是一种适用于专门针对碱性和两性抗生素的分析方法的策略；然而，它不适用于也包含该吸附剂无法保留的中性化合物的多类化合物分析方法。

3.3 方法性能
在最终生物固体中研究了该程序的准确性，这些生物固体来自两个不同的STPs，其中一个STPs进行了厌氧消化处理。在每个实验中，添加的阿奇霉素、环丙沙星和氧氟沙星浓度分别是其他抗生素的10倍（500 ng g-1和2000 ng g-1），以补偿它们在生物固体基质中的残留差异。准确性使用基于溶剂的标样进行测定。总体而言，校正后的回收率在73%到111%之间，相对标准偏差（RSD）低于10%。对于克林霉素，回收率范围在65%到94%之间（见表4）。这种较高的变异性可能是由于缺乏该化合物的氘代类似物。因此，分配的SS（阿奇霉素-d3）在补偿克林霉素的离子化效率变化方面的能力有限。最后，由于该基质中的高残留量，无法计算来自厌氧STP的生物固体中诺氟沙星的回收率（最低添加浓度为50 ng g-1）。mLOQs范围在1 ng g-1到5 ng g-1之间（见表4），与先前的研究结果一致[5,17,30]，并且能够同时测定不同化学类别的抗生素。与应用于复杂固体基质（即粪便）的既定多类抗生素测定方法相比，所提出的方法的LOQ低一个数量级[29]。此外，它简化了工作流程，无需浓缩初级提取物[6]。

表4. 来自两个未经过污泥处理设施和厌氧消化处理的STPs的生物固体加标样品的分析程序准确性，n=3次重复实验，以及程序LOQs（mLOQs）。

| 化合物 | 无处理 | 厌氧消化 |
|------|---------|---------|
| mLOQs (200 ng g-1) | 50 ng g-1 | 200 ng g-1 | 50 ng g-1 |
| 回收率 (%) | (RSD) | (RSD) | (RSD) | (RSD) |
| 阿奇霉素 | 104 (7) | 98 (2) | 96 (1) | 100 (1) | 2.5 |
| 环丙沙星 | 102 (6) | 73 (3) | 99 (2) | 92 (6) | 2 |
| 克拉霉素 | 91 (3) | 87 (6) | 102 (3) | 80 (2) | 1 |
| 林可霉素 | 94 (3) | 65 (4) | 72 (9) | 66 (24) | 2.5 |
| 氧氟沙星 | 97 (4) | 92 (2) | 95 (2) | 83 (2) | 5 |
| 红霉素 | 97 (3) | 83 (2) | 92 (3) | 74 (9) | 1 |
| 诺氟沙星 | 131 (6) | 91 (7) | 111 (6) | n.e. |
| 氧氟沙星 | 103 (3) | 85 (2) | 101 (2) | 90 (4) | 2 |
| 磺胺甲噁唑 | 106 (2) | 96 (2) | 100 (1) | 84 (10) | 5 |
| 三甲氧苄啶 | 97 (3) | 85 (2) | 95 (2) | 89 (3) | 1 | n.e. |

3.4 生物固体中的抗生素残留
评估了从23个不同STPs收集的生物固体中的目标抗生素浓度。STPs 1至4在脱水前对污泥进行了厌氧消化（来自初级和处理单元）。其余设施仅对污泥进行脱水处理，不进行其他处理。克林霉素和磺胺甲噁唑的浓度均低于其mLOQs（分别为2.5 ng g-1和5 ng g-1），在所有研究的生物固体中均未检出。后一种化合物在欧洲其他STPs的污泥中几乎未被检出，最大残留量为9 ng g-1，检出频率（DF）低于10%[17,22]。克林霉素的残留浓度范围从未检出到5000 ng g-1不等，取决于STP[22]。其他抗生素的浓度作为补充信息提供在表S2中。它们的总浓度范围在1837 ng g-1到12513 ng g-1之间，其中氟喹诺酮类氧氟沙星和环丙沙星以及大环内酯类阿奇霉素的浓度最高，分别为1761 ng g-1、1610 ng g-1和441 ng g-1（见表S2）。

图3A总结了每种化合物的中位浓度和最大浓度及其DF。氧氟沙星和红霉素的DF低于30%，最大残留量低于100 ng g-1。氧氟沙星通常用作兽药，在废水处理过程中脱乙基为环丙沙星[31]，这解释了在市政STPs样品中检测到的氧氟沙星残留量非常低而环丙沙星浓度相对较高的现象。三甲氧苄啶和克拉霉素的DF分别为87%和100%，其中位浓度和最大浓度与氧氟沙星和红霉素相当。在四个进行厌氧消化的STPs的生物固体中每1000立方米处理后的废水中排放的抗生素总质量范围从氧氟沙星的1100毫克到克林霉素的46毫克，见图4A和4B。图4中的数据显示，仅对四种选定的抗生素而言，生物固体是一个重要的排放途径，而对于大多数化合物来说，它们对总排放量的贡献可以忽略不计。鉴于这些数据是基于应用厌氧消化和紫外线照射的三种污水处理厂（STPs）中测量的浓度得出的，因此图4中的结论需要进一步验证。为了比较不同处理类型下抗生素通过生物固体排放的差异，有必要考虑更多采用多种处理技术的污水处理厂在脱水前对废水和污泥的处理情况。

图4. 生物固体中量化出的抗生素平均百分比与通过生物固体和处理后的废水排放的总量。A. 阿奇霉素和氟喹诺酮类的数据。B. 较少量残留化合物的数据。

4. 结论
市政污水处理厂（STPs）生物固体中的抗生素残留物主要由氟喹诺酮类（环丙沙星和氧氟沙星）和大环内酯类（阿奇霉素）组成。虽然阿奇霉素可以通过有机溶剂轻松提取，但氟喹诺酮类的有效回收需要醋腈（ACN）和超纯水的缓冲混合物。在阿联酋的条件下，抗生素的提取效率受到污泥类型的影响不大；然而，在C18反相色谱（d-SPE）清洗后观察到的基质效应依赖于样品类型，其中氟喹诺酮类的信号明显被抑制。因此，还需要进一步优化提取过程。特别是应探索使用反相和强阳离子交换（混合模式）吸附剂对提取物进行分馏，以缓解在氟喹诺酮类测定过程中发现的信号抑制问题。

在本研究中考虑的抗生素中，红霉素和恩诺沙星在生物固体和处理后的废水中的检测频率较低。克拉霉素、克林霉素、磺胺甲噁唑和三甲氧苄氨嘧啶主要存在于处理后的废水中，而生物固体中的含量不到这些化合物通过污水处理厂排放总量的5%。相比之下，环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星主要与生物固体相关联。这两种基质都对阿奇霉素的环境排放有显著贡献。这些发现强调了需要进一步研究污泥处理技术，以降低市政污水处理厂生物固体中的氟喹诺酮类浓度，然后再考虑将其作为土壤肥料的用途。

作者贡献声明：
A. Barros：撰写、审稿与编辑、方法论、调查、数据分析、数据管理。
G. Castro：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、方法论、调查、数据分析、概念化。
M. Ramil：撰写、审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、调查、资金获取、概念化。
I. Rodríguez：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、方法论、调查、数据管理、概念化。