《RSC Advances》：Vertical-flow porous microchamber arrays for cell capture, intracellular molecule staining, and population analysis
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本文针对传统胞内分子染色方法操作繁琐、细胞损失大、重复性差等问题，报道了一种基于多孔基底的垂直流微腔阵列平台。该平台通过简单的液滴操作实现被动式垂直流动与多步试剂交换，成功完成了对贴壁细胞与悬浮细胞中F-actin和细胞核的双重染色，并在稀有细胞（如循环肿瘤细胞模型）的检测、鉴定与定量评估中展现了优异性能。该研究为无损细胞处理、细胞表征及诊断研究提供了一种通用且可扩展的解决方案。
在医学诊断和基础生物学研究中，对细胞内特定分子进行染色和可视化是细胞表征、鉴定与检测的基础。然而，传统的细胞内分子染色方法通常依赖于基于离心的多步溶液交换操作，这个过程不仅步骤繁琐、劳动密集，还容易导致显著的细胞损失，并影响结果的重复性与可靠性。此外，现有的一些微流控解决方案虽然能减少细胞损失和试剂消耗，但往往依赖复杂的流体控制系统或精密的操作，限制了其广泛应用。因此，开发一种操作简单、能最大程度保留细胞、同时实现高效试剂交换的技术平台，成为了该领域亟待突破的瓶颈。
为此，研究人员在《RSC Advances》上发表了一项研究，他们提出并验证了一种创新的“垂直流多孔微腔阵列”平台。该平台的核心在于其多孔基底结构，它能通过简单的滴加操作，被动产生垂直方向上的液流，从而实现对捕获细胞的高度可控、多步试剂处理。这种设计巧妙地将细胞捕获、固定、透化和染色等步骤集成在一个微型装置中，旨在以最少的试剂消耗和近乎零的细胞损失，完成高质量的细胞内分子染色。
研究人员为开展此项研究，主要运用了以下几个关键技术方法：首先，通过结合聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制模塑技术与盐浸出技术，制备了具有多孔微腔阵列的器件。其次，利用扫描电子显微镜（SEM）和水渗透实验对器件的微观结构（如孔径）和流体渗透性进行了系统表征。再次，以9.9微米的荧光微球为模型，评估了器件的颗粒捕获效率与分布。最后，使用MCF-7（人乳腺癌细胞系）和Jurkat（人T淋巴细胞白血病细胞系）两种哺乳动物细胞系，在该平台上建立了完整的细胞内分子（F-actin和细胞角蛋白-19）染色流程，并进行了定量分析。
3.1. 多孔微腔器件的制备
研究人员设计并制造了两种不同腔室尺寸（50微米和100微米）的器件。通过改变牺牲性氯化钠（NaCl）颗粒的尺寸（5-15微米、15-25微米、30-60微米），调控了多孔基底表面的孔径。扫描电镜（SEM）分析显示，在所有制备条件下形成的孔洞大多小于典型哺乳动物细胞（10-20微米），适合有效捕获细胞并允许溶液渗透。横截面观察进一步证实，孔洞密集地形成于基底内部，而腔室间的壁体上几乎无孔，这有利于细胞在腔室内的选择性捕获和可控垂直流的产生。
3.2. 多孔微腔器件的表征
水渗透实验表明，当器件底部与吸水垫接触时，滴加在器件多孔区域的液滴能在约25-40秒内完全渗透过多孔基底，证明了溶液引入的快速性与可重复性。使用9.9微米荧光微球进行的捕获实验显示，超过90%的颗粒被捕获在微腔内部，且对于50微米腔室，颗粒捕获数量接近泊松分布，表明该器件适用于后续的细胞群体定量分析。
3.3. 细胞内分子的染色
研究人员在该器件上成功对贴壁细胞（MCF-7）和悬浮细胞（Jurkat）进行了F-actin（用荧光标记的鬼笔环肽染色）和细胞核（用Hoechst 33342染色）的双重染色。荧光图像显示，两种染色信号空间共定位，细胞形态保持良好。定量分析表明，与传统的基于离心的染色方法相比，在细胞圆形度、投影面积和平均荧光强度等参数上均无显著差异。更重要的是，细胞捕获效率分别达到91.7±7.0%（MCF-7）和90.1±7.2%（Jurkat），细胞损失极低。
3.4. 癌细胞的鉴定与定量
为模拟循环肿瘤细胞（CTCs）的检测，研究人员将不同数量（0， 10， 100个）的MCF-7细胞（作为上皮型CTC模型）与固定数量（1000个）的Jurkat细胞（作为白细胞模型）混合，并对上皮标志物细胞角蛋白-19（CK-19）进行染色。结果显示，随着加入的MCF-7细胞数量增加，CK-19阳性细胞的数量也相应增加。当理论上加入10个和100个MCF-7细胞时，实际检测到的细胞数分别为16.8±4.1和117.4±9.3，证明该系统能够对稀有细胞群体进行合理的定量评估。
研究结论与讨论
本研究成功开发了一种集成了垂直流生成多孔微腔阵列的多步细胞处理装置，并展示了一种简单高效的细胞捕获与细胞内分子染色策略。该平台通过结合复制模塑与盐浸出技术，无需复杂微加工即可制备出孔径与哺乳动物细胞尺寸相当甚至更小的多孔微腔器件。优化的器件实现了对贴壁细胞和悬浮细胞中细胞内分子的特异性染色与可视化，以及对稀有细胞群体的定量评估。简单的液滴加样操作完全摒弃了传统染色协议中所需的多轮离心步骤，从而在显著降低操作复杂性和试剂消耗的同时，最大限度地减少了细胞损失。
尽管当前器件在细胞捕获方面表现出色，但作者在讨论中也指出了未来改进方向。例如，可以通过优化制备条件形成更多、更小的孔洞，并改进腔室几何形状以提升捕获效率。此外，目前需要预先润湿疏水的PDMS多孔基底，未来可通过引入亲水聚合物对其进行亲水化改性以提升操作便利性。同时，多孔基底的光学不透明性使得明场观察具有挑战性，未来可通过减薄基底厚度来改善光学透明度。更精确的孔径控制甚至可能使该平台能够直接从全血等复杂生物样本中分离癌细胞。若能结合细胞回收策略，该平台还可与流式细胞术等下游分析过程整合。通过这些优化，这种基于微腔的器件有望成为生物研究中用于细胞内分子可视化和多步细胞处理的简易、通用平台。
