《Journal of Molecular Liquids》：Non-interfacial activation of CALB by soluble alkyl-onium ions: Structure activity relationships
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本研究以裂解酶B（CALB）为例，探讨烷基季铵离子对其的激活机制。实验表明，带有长烷基链的季铵离子（如TOA+）可在微摩尔级别显著提升CALB活性，并通过荧光光谱、圆二色光谱和zeta电位测量证实其通过静电和疏水相互作用结合，同时提高酶的热稳定性。结构活性关系揭示烷基链长度影响激活效果，并提出“电荷封盖”模型解释烷基季铵离子对多种酶的普遍激活作用。
Rangasamy Savitha | Ebin K. Baby | Gemma K. Kinsella | Barry J. Ryan | Kieran Nolan | Gary T.M. Henehan
都柏林技术大学食品科学与环境健康学院，Grangegorman Lower，都柏林，7，D07 E244，爱尔兰
摘要
在生物催化中，酶的活化有可能显著提高反应效率。然而，目前尚不清楚哪些基本因素决定了酶的活化机制，或者哪些结构特征定义了活化剂化合物。最近观察到不同酶可以被胆碱离子活化。以南极假丝酵母（Candida antarctica）脂肪酶B（CALB）为例，我们研究了活化与活化剂结构之间的关系。研究表明，胆碱能够活化CALB，且这种活化主要归因于其季铵基团。
结构-活性研究表明，多种烷基鎓化合物能够活化CALB，这种活化效果受到中心阳离子氮/磷周围疏水层的影响。令人惊讶的是，通过延长烷基链长度来增加烷基鎓离子的疏水性可以显著提高CALB的活化效果。例如，在低微摩尔浓度下，四辛基铵离子（TOA+）可使CALB的活性提高5倍以上。圆二色性（CD）、荧光光谱和ζ电位测量结果表明，TOA+通过静电和疏水相互作用与CALB结合。对CALB与TOA+混合物的热稳定性分析显示，该化合物在50°C时提高了CALB的热稳定性，并且在70°C时仍保持结构完整性。
总体而言，这项工作表明，四烷基鎓离子似乎起到了“封盖剂”的作用，它们能够与CALB表面可接触的负电荷结合。中心的正电荷有助于定位活化剂，而与相邻疏水残基的相互作用进一步增强了结合效果。
这些关于烷基鎓离子作用机制的见解解释了胆碱离子活化的普遍性，并将有助于指导绿色生物催化应用中酶活性的提升。
引言
生物催化是绿色化学和可持续工艺开发中的关键技术[1]。它提供了用更环保的替代品替代现有化学工艺的可能性。尽管酶在生物催化中得到了广泛应用，但它们的稳定性较差，在某些反应条件下活性较低[2]、[3]，这成为其广泛应用的一个主要限制。随着绿色化学方法在工业过程中的应用，提高酶的活性和稳定性变得越来越重要。为了克服这些不足，人们采用了多种方法来增强酶的性能，如化学修饰[3]、[4]、定点突变[4]、[5]、固定化[4]、[6]和溶剂工程[7]、[8]。在某些情况下，这些努力确实提高了酶的稳定性和活性。最近有报道称，胆碱离子能够活化不同的酶[9]、[10]、[11]、[12]。使用小分子活化剂的方法具有吸引力，因为它易于获取和实施。然而，我们对小分子活化机制的理解仍然有限，有效活化剂所需的结构特征也尚未明确。此外，关于这类活化剂如何发挥作用的科学框架也相对薄弱。
脂肪酶是最重要的工业催化剂之一，因为它们具有稳定性强、底物特异性广以及手性选择性高[13]、[14]、[15]、[16]。脂肪酶在精细化学品生产中催化多种反应，包括酯水解、酯合成（通过逆水解）、烯烃环氧化和酰胺合成等[17]。其中最显著的例子是界面活化现象：当脂肪酶遇到疏水相（通常是油/水界面）时，其催化活性会显著增强。这种现象归因于蛋白质中覆盖活性位点的α螺旋环的移动。这个“盖子”限制了底物对活性位点的接触；当与脂质或疏水相接触时，这个“盖子”会被移开，从而大大提高底物的转化速率[18]、[19]。虽然许多脂肪酶都表现出这种活化现象，但南极假丝酵母脂肪酶B（CALB；最近被重新分类为Moesziomyces antarcticus脂肪酶B[20]）由于其独特的结构特征，表现出较弱的或可忽略的界面活化效果。CALB缺乏明显的“盖子”结构[21]，这使得其催化位点在水性和有机介质中都更容易被底物接近。值得注意的是，关于CALB是否具有盖子的存在存在争议，一些最新研究表明CALB确实具有影响底物接触和转化速率的盖子结构[22]。
CALB因其稳定性和广泛的底物特异性而在生物催化中占据重要地位[17]。尽管其界面活化效果较弱，但在疏水载体上固定化后，其活性和稳定性得到了提升。商业参考催化剂Novozyme 435就是将CALB通过疏水相互作用非共价固定在交联的大孔聚甲基丙烯酸树脂上的产物[23]。CALB的活性位点附近有一个疏水口袋，这有助于促进这种相互作用[24]。固定化后的CALB对高温、溶剂和极端pH值的耐受性极高，因此被称为“完美的”脂肪酶[23]。迄今为止，已经进行了大量固定化研究以增强CALB的活性和稳定性[25]、[26]、[28]。
本实验室之前的研究揭示了胆碱（一种生理化合物）在酒精脱氢酶和角质酶活化中的作用[10]、[11]。在本研究中，我们也观察到胆碱能够活化CALB。我们研究了多种结构相关的化合物，以探讨CALB活化与不同烷基鎓离子结构之间的关系。我们采用了多种物理化学表征技术（如ζ电位测量、荧光光谱和圆二色性）来深入了解CALB的活化机制和稳定性提升机制。分子对接研究用于确定烷基鎓离子在CALB表面的结合位点。我们提出了一个模型来解释烷基鎓离子如何活化CALB，并说明了这一机制如何解释CALB在极性溶剂中的行为。
材料
Candida antarctica脂肪酶B（CALB；产品代码L3170）购自Merck公司。胆碱氯化物（99%）从Fisher Scientific购买。对硝基苯乙酸（pNPA）、Tris碱（99%+）、四甲基溴化铵（TMAB）、四乙基溴化铵（TEAB）、四丁基溴化铵（TBAB）、四丁基氯化铵（TBAC）、四己基溴化铵（THAB）、四辛基溴化铵（TOAB）、单甲基三丁基氯化铵（MTOAC）、四十二烷基溴化铵（TDAB）等试剂也用于实验。
结果
根据之前的研究，深共晶溶剂（DES）对角质酶和酒精脱氢酶的活化作用与这些溶剂中的胆碱成分有关[10]、[11]。在本研究中，首先考察了不同浓度的胆碱氯化物（ChCl）对CALB活性的影响。ChCl是一种三甲基铵（-N+(CH3)3)盐，含有羟乙基（-CH2-CH2-OH）取代基。为了分别研究这两个基团的影响，我们……
总体讨论
本研究首次发现胆碱能够将CALB的活性提高1.7倍。通过系统的结构-活性关系研究，我们发现多种季铵盐（铵盐和磷鎓盐）能够显著提高CALB的活性，尤其是当使用高烷基链长度的离子（如四己基铵（THA+）和四辛基铵（TOA+）时，活性的提升尤为明显。
进一步的研究表明……
结论
本研究将烷基鎓离子归为一类新的CALB活化剂，并建立了活化剂结构与活化程度之间的联系。该研究还提供了一个可验证的模型，解释了烷基鎓离子与CALB之间的相互作用机制。总体而言，这些发现将有助于提高酶的活性和稳定性。
作者贡献声明
Rangasamy Savitha：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、软件应用、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。Ebin K. Baby：数据验证、软件应用、实验设计。Gemma K. Kinsella：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、资金筹集。Barry J. Ryan：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、资金筹集。Kieran Nolan：撰写 – 审稿与编辑、项目监督
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了爱尔兰科学基金会（Research Ireland）“未来前沿”计划（项目编号21/FFP-A/9898）的资助。圆二色性、荧光光谱和ζ电位测量工作在都柏林城市大学的纳米研究设施进行，该设施得到了第三级机构研究计划（PRTLI）第五周期的资助。PRTLI项目由欧盟区域发展基金（ERDF）共同资助。
