《Journal of Water Process Engineering》：Mechanisms of elevated chlorine on conjugative transfer in the haloacetic acids and antibiotics resistance genes co-existence in drinking water distribution systems
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消毒副产物与抗生素抗性基因的协同作用机制研究，探讨高氯与卤乙酸对基因接合转移的影响，发现低浓度氯促进而高浓度抑制，揭示氧化应激、膜通透性和能量代谢的调控机制
刘志超|刘家伟|孙中月|史军|潘一帅|姜庆阳|邓慧萍
中国上海同济大学环境科学与工程学院污染控制与资源再利用国家重点实验室，200092
摘要
饮用水系统中消毒副产物（DBPs）和抗生素抗性基因（ARGs）的不断增加引起了人们的广泛关注。然而，高浓度氯和卤乙酸（HAAs）对ARGs接合转移的影响尚不明确。本研究探讨了在高浓度HAAs存在的情况下，高浓度氯对RP4质粒介导的ARGs接合转移的影响，重点分析了基因组和表型层面的机制，包括外部过程和细胞内部反应。研究评估了三氯乙酸（TCAA）和碘乙酸（IAA）以及氯化处理对细菌存活和接合转移的影响。实验结果表明，这些化学物质改变了多种关键细胞功能，如膜通透性、氧化应激（ROS生成）和能量代谢（ATP产生）。通过RT-qPCR技术量化了相关基因的表达变化。研究结果为TCAA和IAA促进ARGs接合转移的机制提供了新的见解，并揭示了氯残留物在此过程中的抑制作用。这强调了了解饮用水系统中DBPs与ARGs相互作用的必要性，同时表明适当管理氯残留物有助于减缓抗生素抗性的传播。
引言
饮用水消毒对公共卫生至关重要，因为它能有效杀灭病原体，降低水传播疾病的风险，确保水质安全[1]。传统消毒剂（如氯、二氧化氯、氯胺等）会与天然有机物（NOM）反应生成消毒副产物（DBPs），其中卤乙酸（HAAs）在氯化水中最为常见[2][3]。由于HAAs分布广泛且稳定性高，尤其在欠发达地区，其浓度可高达约10^2 μg L^-1[4]，因此成为主要问题。目前的研究主要集中在HAAs的毒性效应上，尤其是不同卤化形式的毒性比较（I > Br > Cl），重点关注其致癌性、致突变性和细胞毒性[5][6]。HAAs的化学反应性可能改变微生物的稳定性，并促进应激介导的基因交换，这表明DBPs暴露与饮用水系统中抗生素抗性基因（ARGs）的传播之间存在潜在联系[7]。因此，有必要关注HAAs如何影响水系统中的微生物污染。此外，由于ARGs在饮用水处理厂和分配系统（DWDS）中的普遍存在，它们已成为全球关注的重点[8][9][10][11]。DWDS中的生物膜微生物群具有高细胞密度和频繁的细胞间接触，为ARGs的传播提供了有利环境，从而增强了其持久性和扩散能力[12][13]。虽然分配网络中的余氯能有效控制游离微生物，但在亚抑制浓度下其氧化能力有限，不足以灭活生物膜中的微生物[13][14]。因此，除非氯残留量足够高，否则无法有效防止ARGs从不利水力区域和生物膜中释放和传播[15][16]。此外，研究表明，非抗生素物质在水环境中可通过调节双组分系统调节因子、增强细胞间相互作用等方式促进ARGs的水平转移[17][18][19][20][21]。在这种情况下，DBPs和ARGs的共存构成了饮用水系统中的一个潜在风险。现有研究表明，某些DBPs可通过基因突变或水平转移增加DWDS中ARGs的丰度[22][23][24]。这些发现不仅表明DBPs是水环境中ARGs富集和传播的重要因素，还强调了这些机制的现实意义。另有报告指出，HAAs可增加细胞内活性氧（ROS）水平[25]并促进ATP合成[26]。然而，高浓度HAAs对饮用水中抗性基因的存在和行为的影响尚未得到充分研究。作为维持分配网络水质安全的关键因素，余氯（游离氯）对ARGs的影响因浓度而异：低浓度氯可促进ARGs转移[13]，而2 mg L^-1的氯处理可使ARGs丰度降低30%，有助于控制和缓解与抗性基因相关的生态问题[27][28]。鉴于氯化DWDS中HAAs和ARGs的共存，采用多组学方法研究高浓度氯对ARGs传播的影响至关重要[29]。
在本研究中，我们假设HAAs和氯的共同作用遵循类似激素的作用机制：低浓度HAAs刺激ARGs转移，而高浓度氯则抑制这种转移。为验证这一假设，我们旨在：（1）量化TCAA和IAA对质粒转移频率的影响，以确定典型HAAs和氯残留物之间的剂量-反应关系；（2）评估接合机制和相关维持基因的转录调控，从而揭示这些化学物质如何调节ARGs的传播；（3）研究转移效率的生理决定因素，包括膜完整性、通透性变化以及消毒剂和DBPs引发的SOS反应；（4）阐明在不同应力强度下促进或抑制接合过程的生物能量驱动因素和氧化还原平衡（如ROS生成、ATP合成和NAD^+/NADH比例）。研究结果将为HAAs对ARGs接合转移的影响提供新的机制见解，并为改进氯残留物管理、控制DWDS中质粒介导的ARGs传播提供策略。
化学物质和菌株
TCAA（C2HCl3O2，CAS 76-03-9）和IAA（C2H3IO2，CAS 64-69-7）在制备后用超纯无菌水稀释。用于氯消毒过程的次氯酸钠溶液的可用氯含量高于5.20%。实验模型基于接合机制[30]，供体菌株为携带RP4质粒的大肠杆菌HB101（由中国天津环境与职业医学研究所的金敏教授提供）。
接合转移结果
本研究使用携带RP4质粒的耐抗生素大肠杆菌HB101作为供体菌株，大肠杆菌EC600作为受体菌株，以研究TCAA和IAA暴露对同属细菌中质粒接合转移的影响，以及氯残留物对接合过程的抑制作用。选择的TCAA（0至200 μg L^-1）、IAA（0至40 μg L^-1）和游离氯（2 mg L^-1）浓度基于典型的HAAs和氯残留物水平。
结论
研究表明，HAAs暴露和高浓度氯残留物对饮用水系统中质粒介导的ARGs接合转移具有相反的影响。在典型浓度下，TCAA和IAA促进了接合转移，而高浓度氯残留物（2 mg L^-1）则抑制了这种转移。从机制上看，HAAs暴露与氧化应激、膜通透性增加和能量供应增强有关，而高浓度氯残留物则导致过度的……（原文此处内容不完整）
作者贡献声明
刘志超：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学研究，数据整理。刘家伟：实验研究，数据整理。孙中月：数据分析。史军：研究指导。潘一帅：资源支持。姜庆阳：撰写 – 审稿与编辑，方法学研究，实验研究，数据分析。邓慧萍：撰写 – 审稿与编辑，方法学研究，资金申请。利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（2020YFD1100501）的财政支持。
