《Cancer Research Communications》：Single-Cell RNA Analysis of Murine Osteosarcoma Uncovers Skp2 Function in Metastasis, Genomic Instability, and Immune Activation and Reveals Additional Target Pathways
Open Access
编辑推荐：
为探索骨肉瘤治疗新靶点，研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，在免疫健全的转基因小鼠模型中分析了SKP2功能破坏对骨肉瘤的影响。研究发现，敲除Skp2可减少肺转移、减轻T细胞耗竭、上调干扰素（IFN）信号，并诱导细胞类型特异性应激反应。该研究不仅揭示了Skp2在骨肉瘤中的核心功能，还发现了潜在的治疗逃逸机制，为发展靶向Skp2及其协同通路的组合疗法提供了新的理论基础和公共数据资源。
骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，其标准治疗自20世纪80年代以来就未曾改变，预后较差，尤其是发生远处转移的患者。骨肉瘤在遗传上高度复杂，最常见的突变是肿瘤抑制基因TP53和RB1的缺失。尽管手术和化疗有所进展，但骨肉瘤患者的生存率在过去几十年里陷入平台期，亟需新的治疗策略。S期激酶相关蛋白2（S phase kinase-associated protein 2, SKP2）是SCF（Skp1-Cullin1-F-box）E3泛素连接酶复合物的底物识别因子，其关键靶点之一是周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27。通过靶向p27使其被蛋白酶体降解，SKP2可驱动细胞周期G1-S期的转换和细胞增殖，成为癌症治疗中一个颇具前景的新靶点。先前的研究表明，在免疫健全的骨肉瘤转基因小鼠模型中，敲除（knockout, KO）Skp2基因能够改善小鼠生存、驱动肿瘤细胞凋亡并诱导抗肿瘤免疫。然而，尽管肿瘤发生被延迟，疾病最终仍会进展，这暗示肿瘤存在对Skp2功能破坏的抵抗或逃逸机制。为了深入解析这些机制，并理解Skp2在肿瘤微环境中的调控作用，研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，对三种不同基因型（Skp2野生型、Skp2 KO、p27过表达）的骨肉瘤小鼠模型进行了高分辨率转录组分析。这项研究不仅揭示了Skp2在抑制转移、激活免疫等方面的积极作用，也发现了肿瘤为逃逸Skp2功能缺失而可能启用的替代途径，为设计更有效的联合疗法提供了新思路。相关研究成果发表在《Cancer Research Communications》上。
本研究主要采用了以下关键技术方法：1. 利用Osx-Cre转基因小鼠条件性敲除Rb1和Trp53基因，构建了三种骨肉瘤小鼠模型（DKO, DKOAA, TKO）作为研究对象。2. 对上述模型的原发肿瘤组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），样本来自10只小鼠（4只TKO, 3只DKOAA, 3只DKO）。3. 对scRNA-seq数据进行生物信息学分析，包括细胞聚类、注释、拷贝数变异（CNV）推断、差异表达分析、基因集富集分析（GSEA）和细胞亚群分析等。4. 通过组织病理学（H&E染色）对小鼠肺组织切片进行量化分析，评估不同基因型小鼠的肺转移发生率。5. 利用基于质谱的蛋白质组学技术，对从三种模型建立的骨肉瘤细胞系进行蛋白质表达谱分析，以验证转录组学发现。6. 整合分析已发表的人骨肉瘤患者scRNA-seq数据（来自GEO数据库）和小鼠数据，评估小鼠模型的临床相关性。7. 利用NCI TARGET骨肉瘤队列的临床和转录组数据，进行患者生存分析。
研究结果
A complex tumor microenvironment is present in the transgenic murine osteosarcoma tumors（转基因小鼠骨肉瘤肿瘤中存在复杂的肿瘤微环境）
研究人员对10个来自三种小鼠模型（DKO, DKOAA, TKO）的骨肉瘤肿瘤进行了scRNA-seq分析。经过严格的质量控制和数据整合，鉴定出了恶性细胞以及多种免疫细胞（如巨噬细胞、破骨细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞）和非恶性基质细胞（如内皮细胞、癌症相关成纤维细胞）。通过突变谱和拷贝数变异（CNV）分析，可靠地区分了恶性细胞与基质细胞。结果表明，该转基因小鼠模型成功再现了人类骨肉瘤肿瘤的微环境复杂性和遗传不稳定性。
Skp2 KO reduces molecular signatures of invasiveness and incidence of lung metastasis in OS（Skp2 KO降低骨肉瘤的侵袭性分子特征和肺转移发生率）
对恶性细胞的差异表达分析发现，与DKO相比，TKO和DKOAA模型中上皮-间质转化（EMT）、细胞外基质组织和细胞运动相关的基因特征显著下调。同时，TKO和DKOAA恶性细胞的促转移基因特征评分降低，而抗转移基因特征评分升高。对小鼠肺组织的组织病理学分析证实，TKO小鼠的肺转移负荷（包括转移灶阳性的肺组织比例和切片区间比例）显著低于DKO小鼠。这些发现表明，Skp2功能破坏能够通过下调EMT和转移相关基因的表达，降低骨肉瘤的肺转移发生率。
Functional disruption of SKP2 induces immune activation in the form of increased IFN pathway activity and reduction of T-cell exhaustion（SKP2功能破坏以增强IFN通路活性和减少T细胞耗竭的形式诱导免疫活化）
在所有肿瘤微环境细胞中，特别是在T细胞中，TKO相对于DKO表现出I型和II型干扰素（IFN）反应通路的显著上调。同时，在TKO和DKOAA的多种细胞类型中，内质网应激和复制应激相关通路也被激活。蛋白质组学分析在细胞系水平验证了抗原呈递相关蛋白的上调。对T细胞的亚群分析鉴定出一个表达耗竭标志物（如PD-1, CTLA-4, TIGIT, LAG-3）的CD8+T细胞亚群。组成分析显示，这个耗竭T细胞亚群在DKO肿瘤中比例很高，但在TKO和DKOAA肿瘤中几乎完全消失。这表明，Skp2功能破坏可诱导强烈的抗肿瘤免疫反应，其特征是IFN信号激活和T细胞耗竭减少。
E2f activity was upregulated in TKO and DKOAA malignant cells（E2f活性在TKO和DKOAA恶性细胞中上调）
转录因子活性分析（SCENIC）显示，在TKO恶性细胞中，E2F家族成员（E2f1, E2f7, E2f8）的调节子活性评分显著高于DKO。同时，细胞周期分析显示TKO和DKOAA恶性细胞中S期评分增加。与E2f驱动的过度复制和凋亡表型一致，TKO和DKOAA恶性细胞中凋亡相关基因（如Bbc3, Bid）表达上调。这支持了先前关于Skp2缺失通过E2f1超活化诱导DNA再复制和恶性细胞凋亡的发现。
Myc activity was upregulated in TKO and DKOAA malignant cells（Myc活性在TKO和DKOAA恶性细胞中上调）
基因集富集分析发现，“Hallmark Myc targets V1”基因集在TKO和DKOAA的恶性细胞中显著富集。包括Odc1、Ccna2、Cdk4等在内的多个Myc靶基因表达上调。对Myc靶基因特征评分的分析显示，TKO和DKOAA肿瘤中“高Myc应答”恶性细胞的比例显著高于DKO。这提示，骨肉瘤可能通过上调Myc信号通路来逃逸Skp2功能破坏带来的生长抑制，Myc通路可能成为与Skp2抑制联用的潜在靶点。
Skp2 KO places selective pressure on osteosarcoma malignant cells（Skp2 KO对骨肉瘤恶性细胞施加选择压力）
通过对scRNA-seq数据推断的拷贝数变异（CNV）进行分析，研究人员发现TKO和DKOAA恶性细胞的CNV谱比DKO细胞表现出更高的异质性。主成分分析（PCA）显示，TKO和DKOAA样本彼此之间以及它们与DKO样本之间的CNV谱差异更大，表明Skp2功能破坏可能加剧了骨肉瘤的基因组不稳定性。进一步分析鉴定出一些在TKO和DKOAA中发生显著拷贝数扩增且同时过表达的基因。此外，研究人员还发现了在Skp2缺失背景下，替代性E3泛素连接酶（如Fbxo5）的表达上调，以及恶性细胞在成骨细胞谱系和软骨细胞谱系标志物表达上的可塑性（同时表达Sp7和Sox9）。这些发现共同揭示了骨肉瘤为适应Skp2功能丧失而可能采用的多种逃逸机制。
研究结论与讨论
本研究通过单细胞RNA测序技术，首次在动物模型层面系统揭示了Skp2在骨肉瘤发生发展中的多重功能及其潜在的耐药逃逸机制。研究表明，在免疫健全的转基因小鼠骨肉瘤模型中，Skp2功能破坏（无论是基因敲除还是破坏其与p27的相互作用）能够带来多方面的治疗益处：1）通过下调上皮-间质转化（EMT）和转移相关基因的表达，显著降低肺转移的发生率；2）在肿瘤微环境中广泛诱导干扰素（IFN）信号通路活化，并显著减少耗竭性CD8+T细胞的比例，从而激发有效的抗肿瘤免疫反应；3）在恶性细胞中诱导E2f通路的过度激活和细胞凋亡。这些效应共同解释了先前观察到的Skp2 KO小鼠生存期延长、肿瘤生长减缓的现象。
然而，研究也深刻揭示了骨肉瘤应对Skp2靶向治疗的复杂性和韧性。尽管Skp2功能被破坏，肿瘤最终仍能形成，这背后涉及多种潜在的逃逸机制：1）Myc信号通路的代偿性激活：恶性细胞中Myc靶基因的广泛上调可能促进了细胞的持续增殖和存活。2）基因组不稳定性加剧：Skp2 KO对肿瘤细胞施加了强大的选择压力，导致拷贝数变异（CNV）谱的异质性增加，这可能促进了具有生存优势的亚克隆的出现。3）替代性E3泛素连接酶的上调：例如Fbxo5的表达增加，可能部分替代了Skp2的功能。4）谱系可塑性：恶性细胞同时表达成骨细胞和软骨细胞标志物，显示了其适应环境压力的可塑性。
这项研究的意义重大。首先，它提供了首个骨肉瘤动物模型的公开scRNA-seq数据集，为领域内的进一步大数据驱动研究提供了宝贵资源。其次，研究将小鼠模型的数据与人类患者数据相关联，发现小鼠模型重现了人类骨肉瘤的微环境复杂性，并且小鼠模型中上调的IFN信号与患者更好的生存率相关，极大地增强了研究发现的临床相关性。最后，也是最重要的一点，该研究不仅确认了Skp2作为骨肉瘤治疗靶点的价值，更重要的是系统地揭示了可能影响Skp2靶向疗法疗效的抵抗机制。这些机制，特别是Myc信号激活、基因组不稳定性和替代性E3连接酶的上调，为未来设计合理的联合治疗策略指明了方向。例如，将Skp2抑制剂与Myc抑制剂、靶向DNA损伤修复的药物或其他E3连接酶抑制剂联用，有望克服单一疗法的局限性，为改善骨肉瘤这一难治性癌症的临床预后带来新的希望。
